GBT28082-2011榆枯萎病菌检疫鉴定方法.pdf 11页

'ICS65．020．01B16圆园中华人民共和国国家标准GB／T28082--201榆枯萎病菌检疫鉴定方法DetectionandidentificationofOphiostomanovo—ulmiBrasierandOphiostomaulmi(Buisman)Nannf．2011-12-30发布2012-06-01实施宰瞀鹊紫瓣訾糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会况19 标准分享网www.bzfxw.com免费下载刖蟊本标准按照GB／T1．1—2009给出的规刘起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC／TC271)提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：吴品珊、严进、杜洪忠。GB／T28082--2011 标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围榆枯萎病菌检疫鉴定方法GB／T28082--2011本标准规定了榆枯萎病菌的分离培养、形态学鉴定的方法。本标准适用于来自榆枯萎病菌有发生国家和地区的榆属(UlmusL．)苗木、原木、木制品和木包装中榆枯萎病菌的检疫鉴定。2榆枯萎病菌基本信息中文名：榆枯萎病菌。学名：Ophiostomano∞一ulmiBrasier；Ophiostomaulmi(Buisman)Nannf．。异名：Ceratocystisulmi(Buism．)Moreau。病害英文名：dutchelmdisease，elmwiltdisease。属真菌界Fungi，子囊菌门Ascomyeota，子囊菌纲Ascomycetes，粪科菌亚纲Sordariomyeetidae，长噱壳目Ophiostomatales，长喙壳科Ophiostomataeeae，长喙壳属Ophiostoma。榆枯萎病菌其他信息参见附录A。3方法原理依据无性孢子和有性世代的形态特征和生物学特性，以及其对寄主造成的症状特征进行检测鉴定。4仪器4．1生物显微镜。4．2体视显微镜。4．3光照生物培养箱。4．4高压灭菌器。4．5超净工作台。4．6电子天平。4．7摇床。5试剂和培养基5．1试剂琼脂粉，麦芽膏，Oxoid麦芽提取物，榆树枝条，葡萄糖，天门冬酰胺(L-asparagine)，磷酸二氢钾(KH。POt)，硫酸镁(MgSO。·7H：O)，硫酸锌(ZnSO^)，三氯化铁(FeCl。)，维生素B。，维生素风，放线茵酮，链霉素，青霉素。洼：放线菌酮为剧毒品，注意防护。1 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28082--2015．2培养基5．2．1选择性培养基0．2g放线菌酮溶于100mL水，取50mL加于1000mL麦芽膏(MA)培养基内，灭菌后冷至45℃，加入10mL含1％链霉素和1％青霉素的混合液。5．2．2麦芽膏培养基MA25g麦芽膏，17g琼脂粉，1000mL蒸馏水，灭菌。5．2．3榆边材培养基ESA取50g健康的榆树边材或枝条，去皮粉碎成直径0．5em的小块，15g琼脂粉，500mL蒸馏水，灭菌。5．2．4Tchernoff改良培养液20g葡萄糖、2g天门冬酰胺、1．5g磷酸二氢钾、lg硫酸镁、20mg硫酸锌、10mg三氯化铁、1mg维生素B1和1mg维生素B6，1000mL蒸馏水，灭菌。5．2．5Oxoid麦芽提取物培养基MEA33gOxoid麦芽提取物，10g琼脂粉，1000mL蒸馏水，灭菌。6标准菌株Ophiostomanovo-ulmiA交配型(Amatingtype)，雌性；B交配型(Bmatingtype)，雄性。OphiostomaulmiA交配型(Amatingtype)，雌性；B交配型(Bmatingtype)，雄性。中国检验检疫科学院保存病菌的标准菌株。7检测检查苗木、原木或木材的表面，纵向和横向切开树干或枝条检查。榆枯萎病菌的2个种引起的外观症状是相同的。在树干或枝条的横切面上，可见靠近外面的年轮附近有深褐色斑点或条纹，有时斑点密集，可连成断续的深褐色圆环。去掉树皮，木质部上有深褐色纵向条纹，有时条纹不明显，可轻削一层木质，条纹便显现出来。切开枝权处，常可找到小蠹的蛀食槽。取有如下症状的样品做病菌分离：干枯呈深褐色的枝条，有小蠹蛀食槽痕迹的树皮，横断面上有深褐色斑点或断续的褐色圆环枝干，纵切面有褐色条纹枝干，货物上附着有小蠹虫。8鉴定8．1分离培养对变色的木质部，去掉树皮，切取直径为5mm大小，于选择性培养基(见5．2．1)上，20℃黑暗培养；对有虫蛀槽的树皮，清除蛀槽内的虫粪和残屑，70％酒精消毒10s～30S，无菌水冲洗，灭菌滤纸吸干水分，切取边长为5mm～10mm的大小，于选择性培养基上，20℃黑暗培养；小蠹虫解肢为5mm大小，70％酒精消毒10s～30S，无菌水冲洗，灭菌滤纸吸干水分，于选择性培养基上，20℃黑暗培养。一2 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28082--201旦有真菌菌落出现，立即分别转皿。转皿到ESA培养基，zo℃培养，以期获得粘柬梗霉Pesotumulmi；转接于Tchernoff改良培养液中，室温下110r／min振荡培养，以期获得酵母状分生孢子Blastomyces；转皿到MEA培养基，20℃黑暗培养，以做种的鉴定。8．2子囊孢子培育子囊孢子需在A、B型2种交配型同时存在的ESA培养基上形成。如确认在ESA培养基上长出褐色粘束梗霉，同时取Ophiostoma∞∞一ulmi(任意亚种)和Ophiostomaulmi标准菌株的A、B交配型，分别与分离出的病菌，等距离三角形接种在ESA培养基上，各重复3皿，20℃黑暗培养7d，然后室温(20℃～25℃)漫射光下继续培养14d。8．3种的鉴定菌落形态、菌落生长速度和最佳生长温度，是区分榆枯萎病菌两个种的主要指标。取在MEA培养基上培养的新鲜菌块(2mm大小)，转接在MEA培养基中央，共转6皿，3皿置于20℃黑暗培养，3皿置于33℃黑暗培养。20℃黑暗培养2d后，取出培养皿测量菌落直径D。，继续在20℃黑暗培养5d，再次测量菌落直径D，，按(D，一Do)／5计算病菌5d的平均辐射状生长速度(mm／d)。最后将培养皿置于室温，漫射光继续培养10d，以观察菌落特征。33℃黑暗培养2d后，取出培养皿测量菌落直径F0，继续在33℃黑暗培养8d，再次测量菌落直径E，，按(E·一E0)／8计算待测菌8d的平均辐射状生长速度(mm／d)。最后将培养皿置于室温，漫射光继续培养10d，以观察菌落特征。必要时做亚种鉴定(参见附录B)。9结果判定9．1Ophiostomanovo-ulmi9．1。1菖落特征在MEA培养基上，经20℃黑暗7d和室温漫射光10d培养后，菌落灰白至乳白色，花瓣状、轮纹明显。气生菌丝量中等，常结集成绳索状使菌落有条纹呈现。欧亚亚种0．novo-ulmisubsp．novo-ulmi的菌落条纹较少，边缘有不规则的叶状浅裂。0．novo-ulmi在20℃黑暗条件下生长较快。生长速度为(2．8mm／d～)3．1mm／d～4．8mm／d(～5．7mm／d)，33℃的生长速度为(omm／d～)O．1mm／d～0．5mm／d。9．1．2病菌形态菌丝：分隔，直径1pm～6pm，气生菌丝常结集成绳索状，菌丝体分生孢子丰富。粘束梗霉Pesotumulmi：易在ESA培养基上形成。束丝无性态(synnemata[anamorph)单个或多个，褐色到黑色，纤细，1mm～2mm长；褐色假根状菌丝附着在培养基上，褐色有隔菌丝平行构成束状，顶部张开分枝成透明的菌丝，其上产生分生孢子。分生孢子全壁芽殖、单胞、透明、卵形到椭圆形、大小为(2pm～6pm)×(1／xm～3pm)，聚集成乳白色粘性孢子滴(参见附录c)。发簇孢Sporothrix：可在大多数培养基上形成。分生孢子梗多侧生，10tam～30pm(～50pm)，分生孢子(4．5pm～14pm)×(2btm～3pm)，全壁芽生，有0．5pm～1pm的细齿，单胞、透明，椭圆形至长形，尖端通常较细、微弯，连有一个小囊领。菌丝体分生孢子常聚成粘性滴状，酵母状芽殖。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28082--201酵母状分生孢子Blastomyces：在液体培养基中产生，单胞，酵母状芽殖，孢子大小变化很大。子囊壳在ESA培养基上表生到部分埋生，有褐色假根状菌丝附着在基质上。子囊壳基部球形、黑色，宽75pm～140pm，刚毛稀少至中度，褐色至黑色、有隔130bcm×3pm；子囊壳颈部黑色，长230pm～640pm(～1070pm)，颈基部直径19pm～36gm，顶部9pm～14pm；颈长度与基部球宽度之比通常为1．5～6．2；孔口缘丝茂盛，透明、有隔、少分枝，(20pm～60pm)×(1pm～2pm)；子囊薄壁、球形至卵形、易消解；子囊孢子透明、单胞、桔瓣形，(4．5pm～6pm)×(1pm～1．5pm)，聚生成奶白色粘性孢子滴。自然条件下产生的交配型B占优势，雌性交配型A强烈排斥o．ulmi的雄性交配型B。9．2Ophiostomaulmi9．2．1菌落特征在MEA培养基上经20℃黑暗7d和室温漫射光10d培养后，菌落呈光滑蜡质、苔状，轮纹不明显。乳白至黄褐色，偶有紫褐色斑块，气生菌丝难辨。在20℃时，生长速度为(1．5mm／d～)2．0mm／d～3．1mm／d(～3．5mm／d)，在33℃条件下的生长速度较O．nOVO—ulmi快，为1．1mm／d～2．8mm／d。9．2．2病菌形态0．ulmi的3种分生孢子的形态与0．novo-ulmi基本一致(9．1．2)，唯发簇孢Sporothrix的菌丝体分生孢子和其出芽形成的分生孢子常合生成酵母状团块。子囊壳在ESA培养基上表生到部分埋生，有褐色假根状菌丝附着在基质上。子囊壳基部球形、黑色，宽100pm～150pm，刚毛稀少至中度，褐色至黑色、有隔130gmX3p“；子囊壳颈部黑色，长280Pm～420pm(～510pm)，颈基部直径为18pm～42pm，顶部11pm～16pm；颈长度与基部球宽度之比通常为2．4～3．5；孔口周丝茂盛，透明、有隔、少分枝，(20pm～60pm)×(1bomb2pm)；子囊薄壁、球形至卵形、易消解；子囊孢子透明、单胞、桔瓣形，(4．5,um～6pm)×(1pm～1．5pm)，聚生成奶白色粘性孢子滴。自然条件下产生的交配型A和B大致相等，雌性交配型A可接受O．M∞一ulmi的雄性交配型B。9．3Ophiostomanovo-ulmi和Ophiostomaulmi的特征比较特征比较见表1。表1特征比较特征Ophiostomanovo-ulmiOphiostomaulmi20℃(2．8～)3．1～4．8(～5．7)(1．5～)2．O～3．1(～3．5)生长速度mm／d33℃(0～)0．1～0．51．1～2．8菌落形态花瓣状、轮纹弱显，有条纹光滑蜡质、苔状，轮纹不明显交配型B型占优势A型和B型大致相等颈长230～640r～1070)280～420(～510)／Lm子囊壳颈长与基部球1．5～6．22．4～3．5直径比 标准分享网www.bzfxw.com免费下载CB／T28082--20119．4结论如分离菌的形态特征与鉴定指标吻合，可鉴定为榆枯萎病菌。否则，不视为榆枯萎病菌。10样品保存检疫鉴定后保存样品，以备复验、谈判和仲裁。由鉴定人标识确认、样品管理员登记，置于干燥、防虫、防鼠处保存，保存期为1年，有特殊需求保存期可适当延长。保存期满，需经灭菌后方可处理。11菌种保藏将病菌接在MEA培养基斜面上，待菌丝布满斜面后，封好盖子，--20℃保存。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28082--2011A．1分类附录A(资料性附录)榆枯萎病菌的分类、寄主与分布榆枯萎病是榆树上的毁灭性病害，常年危害欧美的林木业，在20世纪30年代和70年代曾引起两次大规模流行。榆枯萎病的致病菌已经分化为2个种，Ophiostomaulmi引致欧美的第一次大流行，Ophiostomanovo-ulmi是第二次大流行的致病菌，在《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中称为新榆枯萎病菌。OphiostomanOZtO—ulmi侵袭性较强，其内分为两个亚种——欧亚亚种Ophios—tomanD口D—ulmisubsp．nOlO—ulmi和美洲亚种Ophiostomano伽一ulmisubsp，americana。本标准将Ophiostomaulmi和OphiostomanOVO—ulmi统称为榆枯萎病菌。A．2寄主范围寄主主要为榆属(UlmusL。)树木。以美洲榆(U．americana)，荷兰榆(U．hollandica)，山榆(u．glabra)，英国榆(u．procera)等较为感病，人工接种可为害榉属(ZelkovaS．)。该病菌是欧美榆属上的重要有害真菌，可侵染各龄榆树，引致榆树干枯、死亡，称为榆枯萎病，或荷兰榆病。A．3分布亚洲：亚美尼亚、阿塞拜疆、格鲁吉亚、伊朗、土耳其、乌兹别克斯坦、哈萨克斯坦(仅Ophiostomano∞一ulmi)。欧洲：阿尔巴尼亚、爱尔兰、丹麦、挪威、瑞典、波兰、捷克、斯洛伐克、匈牙利、法国、德国、奥地利、荷兰、瑞士、英国、比利时、西班牙、葡萄牙、意大利、罗马尼亚、希腊、摩尔多瓦、乌克兰、俄罗斯、圣马力诺、塞尔维亚、波黑(仅Ophiostomanovo-ulmi)、克罗地亚(仅OphiostomanOlO—ulmi)、斯洛文尼亚(仅Ophiostomanovo-ulmi)、保加利亚(仅Ophiostomanovo-ulmi)、马其顿(仅Ophiostomano"oo—ulmi)、白俄罗斯(仅Ophiostomaulmi)、芬兰(仅Ophiostomaulmi)。美洲：美国、如拿大。大洋洲：新西兰(仅Ophiostomanovo-ulmi)。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载B．1鉴定附录B(资料性附录)欧亚亚种Ophiostomanm,o-ulmisnbsp．novo-ulmi和美洲亚种Ophiostomanovo-ulmisubsp．americana的鉴定方法GB／T28082--2011B．1．1交配型的测定亚种的鉴定首先要确定供试菌的交配型。取标准菌株Ophios￡omanovo-uLmi任意亚种的交配型A和B以及待测菌，等距离三角形分别接种在ESA培养基上，重复3皿，zo℃黑暗培养1周后，在室温(20℃--25℃)漫射光下继续培养两周。B．1．2A交配型的培养经测定交配型为A的供试菌，在MEA培养基上20℃黑暗培养；取标准菌株美洲亚种的B交配型为受体，接种于ESA培养基，20℃黑暗培养14d，再漫射光下继续培养7d，使菌落长满全皿；切取MEA培养基上的待测菌2Crl3．2为供体，茵面朝下贴放在受体菌落的一侧．另以标准菌株美洲亚种和欧亚亚种的A交配型为供体对照，同法分别置于受体的另外部位，重复3皿，室温漫射光下培养。10d后记录各供体上每1ciil2的子囊壳数目。B．1．3B交配型的培养经测定交配型为B的供试菌。在MEA培养基上20℃黑暗培养；取标准菌株欧亚亚种的A交配型为受体，接种于ESA培养基，zo℃黑路培养Kd，再漫射光下继续培养7d，使菌落长满垒皿；切取MEA培养基上的待测菌2cm2为供体，菌面朝下贴放在受体菌落的一侧，另以标准菌株美洲亚种和欧亚亚种的B交配型为供体对照，同法分别置于受体的另外部位，重复3皿，室温漫射光下培养。10d后记录各供体上每1cIn2的子囊壳数目。B．2结果判定B，2，1交配型判定若待测菌与交配型B的交界处产生子囊壳，则待测茵为A交配型；若待测菌与交配型A的交界处产生子囊壳，则待测菌为B交配型。B．2．2A交配型亚种判定若待测菌与受体(美洲亚种B交配型)所生子囊壳数目与供体对照美洲亚种A交配型所生子囊壳数目大致相等，是供体对照欧亚亚种A交配型所生子囊壳数目的10倍～30倍，则待测菌为美洲亚种。若待测菌与受体(美洲亚种B交配型)所生子囊壳数目与供体对照欧亚亚种A交配型所生子囊壳数目大致相等，是供体对照美洲亚种A交配型所生子囊壳数目的1／10～1／30，则待测菌为欧亚亚种。B．2．3B交配型亚种判定若待测菌与受体(欧亚亚种A交配型)所生子囊壳数目与供体对照欧亚亚种B交配型所生子囊7 标准分享网www.bzfxw.com免费下载(；B／T28082--2011壳数目大致相等，是供体对照美洲亚种B交配型所生子囊壳数目的10倍～30倍，则待测菌为欧亚亚种。若待测菌与受体(欧亚亚种A交配型)所生子囊壳数目与供体对照美洲亚种B交配型所生子囊壳数目大致相等，是供体对照欧亚亚种B交配型所生子囊壳数目的1／10～1／30，则待测菌为美洲亚种。 附录C(资料性附录)榆枯萎病菌形态示意图GB／T28082--2011图C．1子囊壳(左)和粘束梗霉Pesotumulmi(右)(仿F．W．Holmes)0n、、／图C．2发簇孢Sporothrix(左)酵母状孢子Blastomyces(右)(仿F．W．Holmes)'