GBT28083-2011栎枯萎病菌检疫鉴定方法.pdf 9页

'ICS65．020．01B16雷圄中华人民共和国国家标准GB／T28083--2011栎枯萎病菌检疫鉴定方法DetectionandidentificationofCeratocystisfagacearum(Bretz)Hunt2011-12-30发布2012-06-01实施宰瞀髁紫瓣訾糌瞥翼发布中国国家标准化管理委员会及111 标准分享网www.bzfxw.com免费下载刖青本标准按照GB／T1．1—2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC／TC271)提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：严进、吴品珊、陈克、黄英、陈岩、段胜男、常雪艳。GB／T28083--2011 标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围栎枯萎病菌检疫鉴定方法GB／T28083--2011本标准规定了栎枯萎病菌的检疫鉴定方法，包括对栎属(QuercusL．)和栎枯萎病菌其他寄主的原木、木制品、木质包装和苗木的检疫。本标准适用于对来自栎枯萎病发生国家和地区的所有栎属植物和栎枯萎病菌其他寄主的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版(包括所有的修改单)适用于本文件。SN／T2122进出境植物及植物产品检疫抽样3栎枯萎病菌基本信息壳斗长喙壳ECeratocystis丘gacearum(Bretz)Hunt]属真菌界(Fungi)，子囊茵门(Ascomycota)，核菌纲(Pyrenomycetes)，球壳目(Sphaeriales)，长喙壳科(Ophiostomataceae)，长喙壳属(CeratocystisE11．&Halst．)。栎枯萎病菌其他信息参见附录A。4方法原理栎枯萎病菌的寄主范围、传播途径、植株症状(参见图B4)和病原形态(参见图R1、图B．2、图＆3)是栎枯萎病菌检疫鉴定方法的依据。5试剂与标准菌株5．1试剂葡萄糖(C。H。0。·H。O)、甲(苯)丙氨酸、磷酸二氢钾(KH。PO。)、硫酸镁(MgSO；·7HzO)、硫酸铁[Fe：(sot)3·zH：O含量(以Fe计)21．o～23．o％]、硫酸锰(MnSOt)、硫酸锌(ZnSOt·7HzO)、维生素H(VitaminH)、琼脂粉。以上试剂除特殊注明外，均为化学纯。5．2标准菌株”Ceratocystisfagacearum(Bretz)HuntA1和A2标准菌株。1)来自美国的Ceratocystis扫gacearum(Bretz)HuntA1和A2标准菌株保存于中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所。1 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28083--20”6主要仪器设备6．1仪器设备立体显微镜、生物显微镜(具油镜和测微尺)、电子分析天平(感量0．001g)、普通天平(感量0．1g)、超净工作台、生物培养箱、高压灭菌器。6．2试验用具斧子、锯子、手持放大镜、培养皿、三角瓶(500mL)、试管(直径12ram)、烧杯(1000mL)、手术刀、手术剪、镊子、载玻片、盖玻片、量筒、吸管、酒精灯。7检疫与鉴定7．1现场检疫7．1．1样品抽取按照SN／T2122规定的方法。7．1．2现场检疫将抽取的原木或木制品或苗木用斧子或锯子分别横向和纵向切开，仔细观察横断面和纵断面有无黑褐色条纹。如带皮，则要检查树皮和木质部之间是否有垫状菌丝层和边材上是否有传病媒介(参见附录C)。将有症状样品带回实验室作进一步检验。7．2室内检测与鉴定7．2．1分离培养采用麦芽浸出液酵母培养基或NFP培养基<见甜录D)，用于病原菌的分离、培葬形状测定和菌种保存。在可疑发病的褐色条纹处取一块组织，切成4mm×4mm的小片，用0．5％NaOCl表面消毒5rain，无菌水冲洗3遍，放在直径9cm的平板培养基上，每皿放4片～6片，于24℃培养箱内培养，黑暗和光照各i2h交替。7d后用显微镜检查。若发现昆虫，首先需进行形态鉴定(参见附录c)，如为露尾甲，则应检查是否携带栎枯萎病菌，方法是将其肢解，组织片用上述方法分离培养。7．2．2形态观察观察并记录培养基上生长茵落的形态特征。从菌落中挑取少量培养物，以水作浮载剂，制成玻片，在显微镜下观察。如为Ceratocystis血gacearum的无性阶段，即可观察到分生孢子梗和分生孢子。详细记载分生孢子和菌丝的形态，记录并测量分生孢子梗、分生孢子大小。用直径4mm的打孔器取菌落边缘的萤块2块，分剐放在2个NFP培养基平板的一侧；用同法分别取标准菌株CeratocystisfagacearumA1和A2交配型的菌块各l块，分别放在上述平板培养基的另一侧，于24℃下培养7d～10d。用立体显微镜观察同一平板培养基上的两菌落交界处是否产生子囊 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28083--2011壳。挑取两菌落交界处产生的子囊壳制成玻片，于显微镜下观察。如与A1交配型菌落交界处产生子囊壳，则待测菌株为A2交配型，如与A2交配型菌落交界处产生子囊壳，则待测菌株为A1交配型。记载子囊壳、子囊和子囊孢子的形态特征并测量和记录子囊壳、子囊和子囊孢子大小。8鉴定标准8．1营养体形态菌落呈绒毛状，厚1mm～3mm，初为白色，后为淡灰色至黄绿色，常有褐色斑块。菌丝分枝有横隔，淡色至褐色，宽2．5pm～6．0gm，菌落中还能形成菌核，菌核茶褐色至黑色，质地疏松，形状不定，直径可达2．5cm。此外，还可形成一种橄榄色厚垣孢子。8．2无性繁殖器官形态分生孢子内生，无色，单胞，圆筒形，两端平截，大小为(2pm～4．5”m)×(4pm～22pm)，在培养基上可形成分生孢子链。分生孢子梗分枝或不分枝，宽2．5pm～5pm，长20Pm～60pm，淡色至黑色，有分隔，顶端逐渐变尖(参见图B．1)。8．3有性繁殖器官形态子囊壳单生或丛生，黑色，瓶形，基部球形，直径240,um～380pm，几乎整个埋于基质内。子囊壳具有长喙，喙长250pm～450pm，顶端生有无色须状物(参见图B．2)。子囊球形至近球形，最大直径7,um～lOgm，内含8个子囊孢子。子囊孢子单胞，无色，椭圆形，微弯，大小为(zpm～3pm)×(5Fm～lOpm)(参见图B．3)。子囊壁易消解，成熟后，子囊孢子从孔口流出，聚集在白色粘液中呈小滴状，在水中不易分散。9结果判定如形态鉴定结果与8．1、8．2、8．3相符合，即可确定分离物为Ceratocystisfagacearum(Bretz)Hunt。10样品保存10．1菌种保存分离获得的Ceratocystis丘gacearum菌种，应转入试管斜面，置于15℃黑暗条件下保存至少12个月，以备复验、谈判和仲裁。10．2传病介体保存捕获的传病昆虫除用于分离病原菌外，其余的应使其存活至检验鉴定完成，然后制成标本。尽量保持其身体各部位的完整性。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28083--2011A．1分布附录A(资料性附录)栎枯萎病菌Ceratocystisfagacearum(Bretz)Hunt分布和寄主欧洲：保加利亚、波兰、罗马尼亚。北美洲：美国(阿肯色、印地安纳、伊利诺斯、依阿华、堪萨斯、肯塔基、马里兰、密执安、明尼苏达、密苏里、内布拉斯加、北卡罗莱纳、南卡罗莱纳、南达科他、俄亥俄、俄克拉荷马、宾夕法尼亚、田纳西、得克萨斯、弗吉尼亚、西弗吉尼亚、威斯康星)。A．2寄主栎属QuercusL．、栗属CastaneaMill．、锥属CastanopsisSpach和石栎属LithocarpusB1．的全部种。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载附录B(资料性附录)病原菌形态示意图和症状圈B1分生孢子和分生孢子梗图B4栎树边材上黑褐色条斑 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28083--201C．1传病媒介附录C(资料性附录)栎枯萎病菌Ceratocystisfagacearum(Bretz)Hunt传病媒介果实露尾甲属CarpophilusStephensC．1ugubris露尾甲属GlischrochilusReifferG．s口ngMinoZenf"5G．q"口d“signnf“5G．危sciatusG．siepmanni鬃额小蠹属PsP“do户i￡yo声^f^orHsSwaineP．minutissimusP。pruinosis毛束小蠹ScolytusintricatusRatzeburgC．2露尾甲科形态描述体长1mm～7mm；体宽扁，黑色或褐色；头显露，上颚宽，强烈弯曲；触角短，11节，柄节及端部3节膨大，中间各节较细；前胸背板宽大与长；鞘翅宽大，表面有纤毛和刻点行，臀板外露或末端2节～3节背板外露；前、中足基节横形，基前转片明显；胫节短部膨大，前足胫节外侧具锯齿突起，跗节5-5—5，第3节双叶状，第4节很小，第5节较长；腹部可见5节。幼虫圆形，头小；下颚关节区退化；下唇须1节；触角3节；复眼3对～4对，第9腹节末端具尖的尾突。C．3小蠹科形态描述微小至小形，体长1mm～9mm，宽短，圆筒形。头部的一部分向下方延长成较短的头管，象鼻部分短而不甚明显。触角短，锤状，呈膝状弯曲，末端3节膨大。前胸背板大，长度约占体长的三分之一以上，前端收狭。外咽片消失，仅存1条外咽缝；无上唇；下颚须3节，节间僵直不能活动；足胫节有齿，跗节5节，其中第4节甚小，成为假4节，末节长。鞘翅长，盖过腹末，表面有粗大的刻点条纹。腹板可见5节～6节，腹部末节通常平切状。有发达的几丁质前胃。体多为黑色或褐色，被毛。幼虫无足式，似象甲幼虫。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载D．1麦芽浸出液酵母培养基麦芽浸出液酵母琼脂粉蒸馏水先调酸度至pH6．D．2NFP”培养基附录D(规范性附录)培养基配方5g1g20g1000mL0，然后在1．51×107Pa或121℃下灭菌15min。葡萄糖甲(苯)丙氨酸磷酸二氢钾(KHzPO。)硫酸镁(MgSOt)硫酸铁[Fe。(SO。)。]硫酸锰(MnSO。)硫酸锌(ZnSO。)维生素H(VitaminH)琼脂粉蒸馏水在1．51×107Pa或1213g0．5glg0．5g0．2g0．2g0．2gb“g20g1000rllL℃下灭菌15rain。GB／T28083--20112)NFP：南京林业大学(原南京林产工业学院)森林病理教研组配方(摘自《植物检疫)(浙江农业大学汇编)——上海科学技术出版社1979)。'