CJT150-2001城市供水致突变物的测定鼠伤寒沙门氏菌哺乳动物微粒体酶试验.pdf 9页

'CJ中华人民共和国城镇建设行业标准CJ/"r141-150-2001城市供水水质检验方法标准及编制说明和研究报告2001一07门7发布2001门2一01实施中华人民共和国建设部发布 一、城市供水水质检验方法标准Standardmethodsfortheexaminationofwaterofurbanwatersupply标准分享网www.bzfxw.com免费下载 CJ/T150-2001前言本标准由建设部标准定额研究所提出。本标准由建设部给水排水产品标准化技术委员会归口。本标准由国家城市供水水质监测网天津监测站负责起草。本标准起草人:张旭东、李墙。本标准参加验证单位:北京监测站、上海监测站、深圳监测站、武汉监测站、昆明监测站 中华人民共和国城镇建设行业标准城市供水致突变物的测定鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验CJ/T150一2001Urbanwatersupply-Determinationofmutagenesis-Salmonellatyphimurium/Mammalsmicrosomalenzymetest范围本标准规定了用鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验测定城市供水的致突变性本标准适用于城市供水及其源水水质致突变性的测定。本标准规定以2L为接种的最高检测水样体积。2方法人工诱变鼠伤寒沙门氏菌突变株(即组氨酸营养缺陷型)，在无组氨酸的培养基上不能生长，如受到致突变物的作用，使其基因发生变化而回复突变为原来的野生型，即使在缺乏组氨酸的条件下也能生长(如下图所示)。其中一些致突变物为直接致突变物。另外一些为间接致突变物.即需代谢活化后具有致突变性野生型到噢ff组氨酸营养缺陷型C7竺}k$野生型试剂和材料3.1营养肉汤牛肉浸膏59蛋白陈10g氯化钠59蒸馏水1000niL将上述成分混合后，加热溶解，用饱和NaOH溶液调节pH值至7.2，分装于试管中，每管10mL,经121C高压湿热灭菌20min,4"C冰箱保存，供增菌使用。(保存期7天)3.2v-B液柠檬酸(C,H,O·H20)10g磷酸氢二钾(K2HP04·31-120)65.5g磷酸氢钱钠(NaNH,HP04·4H20)17.5g硫酸镁(MgSO·7H,O)1.0g蒸馏水500mL将上述试剂在少量蒸馏水中溶解后.稀释至500mL。硫酸镁水溶液在最后缓慢加人以防止产生沉淀.经滤纸过滤后，于4C冰箱保存。3.3底层培养基中华人民共和国建设部2001一07-17批准标准分享网www.bzfxw.com免费下载2001一12-01实施5s CJ/T150一2001葡萄糖209V-B液100mL琼脂17g蒸馏水900mL将V-B液用饱和NaOH溶液调节pH值至7.0。另将葡萄糖溶于100mL蒸馏水中(溶液变黄者弃去重配)，两者于115℃灭菌10mine琼脂于800mL蒸馏水中煮沸溶化，121℃灭菌20min，待其凉至80C左右，将前两者倒人混匀。浇制平板，每皿25mL。于4"C冰箱中可保存14天。3.40.5mmol/L一组氨酸一0.5mmol/L一生物素溶液成分L一组氨酸(FW155.7)7.8mg「或L一组氨酸盐酸盐(FW209.63)10.5mg]D一生物素12.4mg蒸馏水100mL混匀溶解，于4C冰箱中保存。3.50.1mol/L一组氨酸溶液L一组氨酸(FW155.7)1.56g[或L一组氨酸盐(FW209.63)2.10g]蒸馏水100mL混匀溶解，于4"C冰箱中保存。3.6营养琼脂琼脂16g营养肉汤1000mL将琼脂倒人营养肉汤内加热煮沸，用饱和NaOH溶液调节pH值至7.2^7.4,121C高压灭菌20min。于4"C冰箱中可保存14天。3.7H一顶层培养基琼脂0.6g抓化钠0.5g蒸馏水100mL将琼脂和抓化钠溶于蒸馏水中加热煮沸，以每支试管2.5mL分装，加塞,121C高压灭菌20min。于4℃冰箱中可保存14天。3.8H一顶层培养基H一顶层培养基100mL。.1mol/LL一组氨酸溶液10mL将加热溶化了的H一顶层培养基加人0.1mol/LL一组氨酸溶液10mL混匀，趁热以每支试管2.5mL分装，加塞，121C高压灭菌20min。于4"C冰箱中可保存14天。3.9顶层培养基H一顶层培养基100mL0.5mmol/LL一组氨酸一。.5mmol/LD一生物素溶液10mL将加热溶化了的H一顶层培养基加人0.5mol/LL一组氨酸-0.5mmol/LD一生物素溶液后混匀，趁热以每支试管2.5mL分装，加塞,121C高压灭菌20min。于4"C冰箱中可保存14天。3.100.2mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.4)每100mL含0.2mol/L磷酸氢二钠(Na}HP04·12H,O)81ml60 CJ/T150一20010.2mol/L磷酸二氢钠(NaH2P0,·2H20)19mL若pH值小于7.4，用0.2mol/L磷酸氢二钠调节至7.4,115"C高压灭菌10min，于4℃冰箱中保存。3.11氨节青霉素碱性溶液氨节青霉素80mg氢氧化钠溶液(0.02mol/L)10mL临用时无菌操作配制。112氨节青霉素平板在1000mL底层培养基中加人0.5YoL一组氨酸盐酸盐溶液10mL，或0.5%L组氨酸溶液8.17mL,0.5mmol/l.D一生物素溶液6m工，121"C高压灭菌20min后，加人1.9mL氨节青霉素碱性溶液，混匀浇制平板，供挑选菌种用。3.13结晶紫水溶液。.1g/100mL避光保存。114苦酮酸水溶液4.0mg/mLTA98(-S9或+S9)作阳性对照用(或敌克松水溶液0.5mg/mL)3.15环磷酞胺水溶液20m创mLTA100(-S9或+S9)作阳性对照用3.16S-9混合液每毫升含量S-90.32mLMgC12(0.4mol/L)20ILKCl(1.65mol/L)20pL辅酶ll(NADPH)2.7mg6-磷酸葡萄糖(1mol/L)5pL磷酸钠缓冲液(0.2mol/L)0.6mL灭菌蒸馏水35pL除S-9外，各组分灭菌后保存于冰箱，无菌操作，临用时配制，置于冰箱中，其活性可保持4h-5ho3.17S-9的制备使用体重200g左右的健康雄性大鼠，用玉米油稀释的国产多氯联苯(或aroclor-1254，浓度为200mg/ml，剂量为100mg/kg)腹腔注射一次。诱导五天后，断头处死大鼠，无菌取出肝脏，放人烧杯中称重。按每克肝脏加人0.15mol/LKCI溶液3mI，连同烧杯移人冰水中，用消毒剪刀剪碎肝脏，在玻璃匀浆器内制成肝匀浆，在高速冷冻离心机上以9000彭速度12000rpm)10min。吸出上清液即为S-9,分装小试管，每管2mL，放一80C或一20C冰箱保存。应无菌操作，制备后，应用接种环挑出少许在营养琼脂板上涂布，37C,24.h培养检验应为无菌。用间接致癌物(黄曲霉素B或2氨基药)鉴定其生物活J性，方可使用。3.182-氨基荀溶液2mQ/LDMSO溶液刁仪器设备妇42高压蒸气灭菌器干热灭菌箱43恒温箱444546普通冰箱高速冷冻离心机(12000r/min)们低温冰箱(一80C)或液氮罐标准分享网www.bzfxw.com免费下载超净工作台 CJ/T150一20014.8恒温水浴锅4.9真空泵4.10比色器4.11自动菌落计数器4.12微量加液器或微量注射器(100yL-500pL)4.13试管、平皿(090)、分度吸管置于干热灭菌箱160C,灭菌8ho4门4振荡培养箱5试验菌种的选用、鉴定与保存5.1菌种的选用鉴于TA98,TA100菌种特性变异小，不易丢失、且能分别测试移码型突变和碱基置换型突变，因此本试验采用TA98,TA10。作为测试菌种。5.2菌种鉴定5.2门增菌液的制备将菌种接种于10mL已灭菌的营养肉汤中，37C振荡培养14h-16h至每毫升活菌数不少于1X10s^2X10s个。5.2.2组氨酸缺陷型鉴定将各装有2.5mLH顶层培养基的3支试管中分别加人。.1m工增菌液.分别倒人底层培养基平板。37C培养48h。将各装有2.5mI.H+顶层培养基的3支试管中分别加人0.1ml增菌液，分别倒人底层培养基平板。37C培养48h结果判定:在有组氨酸的培养基上应成菌膜状而在无组氨酸的培养基上应只有个别菌落生长。5.2.3深度粗糙突变(rfa)一一结晶紫抑菌试验用接种环或无菌滤纸将。.1m工增菌液涂布于营养琼脂平板上，将6mm直径无菌滤纸浸湿结晶紫水溶液后放置其上，37C培养24h。一式两份。结果判定:具有深度粗糙变异的菌株在滤纸片处出现抑菌环(直径>1mm).5.2.4R因子鉴定—抗氨节青霉素试验用接种环将增菌液在营养琼脂平板上划线，再用接种环蘸上氮节青霉素碱性溶液与其交叉划线，37C培养18h-24ho结果判定:无R因子的菌株在交叉处有抑菌带，有R因子者则无。5.2.5AuvrB突变—紫外线损伤修复试验用接种环将增菌液在营养琼脂平板上划线，平板的一半用黑纸遮盖，置紫外灯下〔15W,距离33cm)照射8s037C培养24ho结果判定:切除修复系统缺损(AuvrB)的菌株受辐射后不生长，野生型则生长。5.2.6自发回复突变在无菌的2.5mL顶层培养基加人0.1ml增菌液倒人底层培养基平板上，37C培养48h。一式三份结果判定:观察每皿自发回变数TA98应在1550个/皿，TA100应在75-200个/皿范围内。5.2.7回变特性阳性对照在无菌的2.5mL顶层培养基中加人0.1mL增菌液并加人0.1mL阳性物后倒人底层培养基平板上，37C培养48h。一式三份。结果判定:出现密集菌落(大于2倍以上自发回变数)者为突变试验阳胜o5.3菌种的保存6z CJ/T150一200110mL增菌液中加人1mL二甲基亚风(DMSO)在一60"C--80℃可保存六个月至一年。营养琼脂斜面增菌保存，在4C可保存三个月。6测定步孩61水样浓缩液的制备6.1门XAD-2树脂的处理6.1.1.1市售XAD-2树脂需用重蒸馏水洗去所含氯化物，弃去浮于上层的树脂。用色谱纯级甲醇将水洗去。6.1.1.2依次用丙酮、乙醚、甲醇各蒸馏回流8h。保存在甲醇中。(溶剂均需三次重蒸馏或用色谱纯级)6.1.2安装XAD-2树脂柱将处理好的树脂倒入一支高45cm、直径2.5cm的玻璃柱内，树脂体积20mL.在玻璃柱底部及树脂柱上部放人经丙酮、乙醚、甲醇蒸馏回流过的玻璃棉以支撑树脂并截留杂质。用1000mL蒸馏水冲洗树脂柱。6.1.3水样的采集、吸附及滤水量清洁的容器采集水样后，静置高处数小时使水中悬浮物沉淀并使溶解氧稳定，经加抓消毒的水要先用NaISi0:脱氯。用虹吸法将601水样以流速为40m工丫min通过树脂柱。6.1.4有机物的洗脱、浓缩、保存水样过柱吸附后用氮气吹干树脂柱，分三次，每次以10mL加人色谱纯丙酮(视情况亦可用丙酮，甲醇=3:7混合溶剂)溶液浸泡后，以3m工/mm流速收集洗脱液于三角烧瓶。用5g无水硫酸钠过滤脱水后，倒人x-D浓缩器浓缩至2mL左右。放人真空干燥器抽负压将溶剂蒸干并保存在真空干燥器内。浓缩物应尽快使用。用时加DMSO定容至3.0mL，为原液.并稀释至原液的1/2,1/4浓度，则原液、1/2原液浓度溶液,1/4原液浓度溶液各。.10m1一分别相当于水样2.01.,1.0L,O.5Lo6.2试验方法和步骤6.2.1试验方法:平板掺人法。62.2试验步骤6.2.2门增菌培养方法同菌种鉴定6.2-2.2培养基制备:提前一天制备底层培养基平板若干个.放人37C温箱内验证无菌。试验当天融化顶层培养基，45C水浴保存6.2.2.3接种培养:在每管顶层培养基中加人0.1mL增菌液、0.1mL相当于一定水样体积的浓缩液(6.1.4),需活化时再加人。.4mI,S-9混合液，混匀后倒人底层培养基上铺匀。37C士1C培养48h，接种3个水样体积(6.1-4).每个接种水样体积进行三个平行测定。6.2.2.4对照:自发回变和阳性对照做三个平行测定。自发回变每皿加0.1mLDMSO，阳性对照每皿加0.1mL阳性对照物。7结果分析及评价7门对待测物的每个剂量及阳性对照应列出每皿的实际回变菌落数及平均数，其中三个平行样回变菌落数相对标准偏差应小于30%7.2在1-2个接种水样体积下，其回变菌落数是自发回变数的两倍及两倍以上，且有剂量反映关系者，定为阳性;否则即为致突变阴性8质f控制8门每次试验前后都应用20%的新洁标准分享网尔灭清洁www.bzfxw.com无菌室，避免免费下载细菌及霉菌滋生。63 CJ/T150一20018.2每批培养基都要做灭菌完全试验。8.3应避免琼脂与葡萄糖一同高压，防止产生弱致突变性，影响试验结果。8.4若考虑水样中悬浮物吸附的致突变物，应连同悬浮物一同通过XAD树脂过滤。85试验有效性每次试验应当测定待测物和S-9混合液的无菌性并确定对阳性对照物的反应性，保证测试菌株自发回变数在确定的范围内且变化较小。9安全9.1做完试验后一切带菌的器皿、培养基应及时经12YC高压灭菌20mine9.2应严格保管、使用及销毁阳性物。'