HG3616-1999苏云金杆菌原粉.pdf 10页

'He3616-1999前言本标准是根据我国以往制定的苏云金杆菌企业标准等有关材料，结合我国实际情况而制定的。本标准对苏云金杆菌原粉的要求、试验方法、抽样以及包装、运输等作了具体要求和规定，从而为苏云金杆菌生产提供了统一的技术依据。本标准的附录A是提示的附录，附录B是标准的附录。本标准由中华人民共和国原化学工业部技术监督司提出。本标准由化学工业部沈阳化工研究院归口。本标准主要起草单位:中国农业大学应用化学系。本标准参加起草单位:湖北省生物农药工程研究开发中心、济南科贝尔生物工程有限公司。本标准主要起草人:刘丰茂、王开梅、钱传范、钟连胜、赵欣听、王绮文。1156 中华人民共和国化工行业标准HG3616-1999苏云金杆菌原粉Bacillusthuringiensistechnical苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis,B.t)是目前应用最广泛的一种微生物杀虫剂，它的主要杀虫成分是伴抱晶体中的毒素蛋白，其中，对鳞翅目有毒力的蛋白相对分子质量为130000范围本标准规定了苏云金杆菌原粉的要求、试验方法以及标志、标签、包装、贮运本标准适用于防治鳞翅目害虫的苏云金杆菌原粉。2引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB/T1250-1989极限数值的表示方法和判定方法GB/T1600-19790989)农药水分测定方法GB/T1601-1993农药pH值的测定方法GB/T1604-1995商品农药验收规则GB/T1605-19790989)商品农药采样方法GB3796-1983农药包装通则GB/T16150-1995农药粉剂、可湿性粉剂细度测定方法3要求3.1外观:灰白色至棕褐色粉末。3.2苏云金杆茵原粉应符合表1要求。表1苏云金杆菌原粉控制项目指标指标项目一等品合格品毒素蛋白，%)7.06.0毒力效价([PxIU/mg口[HaIU/mg]))5000040000pH值5.5^7.0水分，/0a《6.0细度，45jam,0,)98注:Px和Ha分别为小菜蛾(Plutellaxylostella)和棉铃虫(Heliothisarmigera)缩写.国家石油和化学工业局1999-06-16批准2000一06一01实施157 HG3616一19994试验方法除另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，所述溶液均为水溶液。4.1抽样按照Gs/T1605-19790989)中“原粉采样”进行，用随机数表法确定抽样的包装件，最终抽样量应不少于100go4.2鉴别试验当用生物测定法评价产品质量产生疑问时，可用以下方法进行鉴定。用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法测定有效毒素蛋白的相对分子质量是否为130000，同时测定其含量是否符合3.2指标的规定。4.3毒素蛋白含量测定方法毒素蛋白含量可以用SDS-PAGE一扫描法和SDS-PAGE一洗脱比色法两种方法进行测定，二者精密度、准确度接近，前者由于自动化程度更高，而定为仲裁法。4.3门SDS-PAGE一扫描法(仲裁法)4.3.1门方法提要用碱性溶液处理苏云金杆菌原粉伴抱晶体，使其降解为毒素蛋白，然后通过SDS-PAGE，依蛋白质相对分子质量的差异，使毒素蛋白与其他杂蛋白分离，之后用薄层扫描仪或电泳图像扫描仪扫描蛋白区带面积，进行定量。4.3.1.2仪器、设备电泳仪。夹芯式垂直电泳槽(1.5mm凹形带槽橡胶模框)、凝胶板面积145mmX100mm(1.5mm,12孔样品槽模具)。高速薄层层析扫描仪或电泳图像扫描仪。离心机:10000r/min,分析天平:精确至0.0001g,4.3.1.3试剂和溶液过硫酸按(AP),十二烷基硫酸钠(SDS),四甲基乙二胺(TEMED),氢氧化钠。30%丙烯酸胺:称取丙烯酸胺30g，亚甲基双丙烯酞胺(原称:甲叉双丙烯酞胺)0.8g，溶于100mL蒸馏水中，过滤，于4"C暗处贮存备用。1mol/L,pH8.8三9基甲基氨基甲烷-HCI缓冲液:称取三9基甲基氨基甲烷30.25g溶于蒸馏水中，用浓盐酸调至pH8.8，用蒸馏水定容至250mL.1mol/L,pH6.8三经基甲基氨基甲烷-HCI缓冲液:称取三经基甲基氨基甲烷12.10g溶于蒸馏水中，用浓盐酸调至pH6.8，用蒸馏水定容至100mL,电极缓冲液:称取三经基甲基氨基甲烷3.03g，甘氨酸14.42g，十二烷基硫酸钠1g，用水溶解并定容至1000ML,3X样品稀释液:1mol/L,PH6.8=g基甲基氨基甲烷-HCI18.75mL，十二烷基硫酸钠6g，甘油30mL,琉基乙醇15mL，少许澳酚蓝，用燕馏水定容至100mL,染色液称取考马斯亮蓝(CBB)R-2501g，加人甲醇450mL，冰乙酸100mL,蒸馏水450mL,溶解过滤后使用。脱色液量取甲醇100mL，冰乙酸35mL，用蒸馏水定容至1000mLe1158 HG3616一1999漂洗液:量取无水乙醇30mL，冰乙酸10mL,蒸馏水60mL,混合均匀后使用。毒素蛋白标样:毒素蛋白(相对分子质量为130000)含量为9.3%的原粉。4.3.1.4试样处理称取标样、试样各20mg(准确至。1mg)，移至5mL离心管中，加2mL水充分悬浮。然后加人0.55mol/L氢氧化钠溶液0.45mL(使氢氧化钠溶液的终浓度为0.1mol/L)，放置约5min，再加人3X样品稀释液1.30mL，使最终体积为3.75mL，于1000C沸水中煮6min,离心(2000r/min)10min后取上层清液，以备电泳上样。4.3-1.5SDS-PAGE分离毒素蛋白a)制备8%-10%聚丙烯酞胺凝胶采用不连续缓冲系统，制胶方法见附录A(提示的附录)。b)上样取上述标样溶解液上层清液，于聚丙烯酞胺凝胶的上样孔中分别上样6,8,10,12,14pL(毒素蛋白含!约为3^-7pg)，作为标准曲线，再取一定体积的试样溶液上层清液(毒素蛋白含量约为5pg升加人到上样孔中，注人电极缓冲液后，接通电源。c)电泳电泳初期电压控制在100V左右，待试样进人分离胶后，加大电压到120V，继续电泳，当指示剂前沿到达距底端1cm左右时停止电泳，取出胶板，在7.5%(体积百分数)乙酸中浸泡30min,d)染色将分离胶部分取下，用考马斯亮蓝(CBB)R-250染色液染色过夜。e)脱色倒去染色液，先用漂洗液洗涤凝胶，然后加人脱色液，于37℃下加热使其脱色，更换几次脱色液，直至背景清晰为止。4.3.，.6测定胶板经脱色后，可清晰地看到130000蛋白区带.用高速薄层层析扫描仪或电泳图像扫描仪扫描该区带，扫描波长为600n,样品中毒素蛋白的百分含A(X)按式(1)进行计算。X=-YsX100⋯“⋯”。“..··......··⋯⋯(1)m2V,式中:m,—从标准曲线上查得的样品中毒素蛋白的量+1+H}mi—lmL稀释液中样品的质量,mg;V,—样品最终定容体积,mL(3.75mL);V}-注人凝胶上样孔的样品体积,pL,4.3.，.7允许差取其算术平均值为测定结果。两次平行测定结果相对偏差小于等于8%04.3.2SDS-PAGE一洗脱比色法4.3-2.1方法提要用碱性溶液处理苏云金杆菌原粉伴抱晶体，使其降解为原毒素，热后通过SDS-PAGE，依蛋白质相对分子质t的差异，使毒素蛋白与其他杂蛋白分离，再割胶，洗脱，侧定吸光度。4.3.2.2仪器、设备分光光度计。其他同4.3.1.2,4.3.2.3试剂和溶液毗吮1159 HG3616一1999其他同4.3.1.3,4.3-2.4试样处理同4.3.1.4,4.3-2,5SDS-PAGE分离毒素蛋白a)制备8%-10y,聚丙烯酞胺凝胶同4.3.1.5a).b)上样取上述标样溶液上层清液，于上样孔中分别上样15,20,30,40,501,L(毒素蛋白含量约为7.5--25Vg)，作为标准曲线，再取一定体积的试样溶液上层清液(毒素蛋白含it约为15pg)，加人到上样孔中，注人电极缓冲液后，接通电源。c)电泳同4.3.1.50.d)染色同4.3.1.5d),e)脱色同4.3.1.5e).4.3.2.6测定用手术刀刮下待侧区带，放人玻璃试管中，再加25毗吮(体积分数)3.0,mL，于37℃下振荡洗脱毒素蛋白所吸附的考克斯亮蓝(CBB)R-250,平衡后用分光光度计.以25%毗吮为参比，于605nm下，测定溶液的吸光度，用式(1)计算毒索蛋白含盘。4.3.2.7允许差取其算术平均值为测定结果。两次平行测定结果相对偏差小于等于8%.4,4毒力效价的测定按附录B(标准的附录)进行.4.5PH值的测定按GB/T1601测定。4.6细度的测定按GB/T16150-1995中2.2进行侧定。4.7水分的测定按GB/T1600-1979(1989)中“共沸蒸馏法，进行测定。5检验规则应符合GB/T1604有关规定。极限数值按GB/T1250处理。6标志、标签、包装、贮运6.月..产品包装应符合GB3796规定，同时注明所用标准编号。6.门乙原粉主要采用塑料袋包装，密封.6.q︺贮存时严防日晒，勿受压，A于阴凉干燥处。运输时，注意轻放，防止损坏。:.:保证期:在正常贮运条件下，原粉质量保证期从生产日期算起为二年，产品出厂时毒力效价和毒素蛋白含量不低于312指标，两年内产品毒力效价和毒素蛋白含f均不低于3.2指标的60yo.]ISO HG3616一1999附录A(提示的附录)电泳胶的制备A1斜板本实验选用板状电泳。具体操作根据实验室条件而定。基本操作大体上是根据电泳槽高矮大小，选择两块大小一样的玻璃板，其中一块一端带有2-3cm高的凹槽。两块玻璃板洗净干燥后，在无凹槽的玻璃板两边各放一条“间隙条”(塑料条、胶条都可以，其宽度、厚度根据需要而定)。然后放上带凹槽的玻璃板，用夹子将两块玻璃板固定，这样两块玻璃板之间就形成了一定的间隙。形成的间隙下端应该封闭，以防灌人的胶液漏出。一般用胶纸条封闭，待灌人的胶凝固后，再撕去胶纸;或用100^"1.5%浓度的琼脂封闭，方法是:在琼脂中加人电极缓冲液或蒸馏水，在沸水浴中加热溶解，将带有间隙的玻璃板装置，垂直放在一个高3cm、宽3cm、比玻璃板宽而长的一个小槽内(商品电泳槽有配套装置)，趁热将溶解的琼脂胶灌人小槽内，待冷却后取出玻璃板装置，下端即封严，可进行灌注聚丙烯酞胺胶液。A2制备分离肢从冰箱中取出制胶试剂，平衡至室温。按表A1先配制分离胶。本试验中分离胶浓度为10%,将胶液配好、混匀后，迅速注人两块玻璃板的间隙中，至胶液面离玻璃板凹槽3.5cm左右。然后在胶面上轻轻铺1cm高的燕馏水，加燕馏水时通常顺玻璃板慢慢加人，勿扰乱胶面。垂直放置胶板于室温约20^-30min左右使之凝聚。此时，在凝胶和燕馏水之间可以看到很清晰的一条界面。然后吸出胶面上的燕馏水。A3制备浓缩胶其用量根据实际情况而定，制备方法按表A1,表A1SDS-PAGE凝胶的配方贮备液分离胶浓缩胶30肠丙始院肢10mL3.4mL1mol/L,pH8.8三经基甲羞氮墓甲烷-HCI13ml,1mol/L,pH6.8三径荃甲签氮基甲烷-HCI2.5mL热馏水11.6mL14.0ml,10%十二烷荃硫酸钠0.35ml,0.20mL10%过硫酸铁0.23mL0.20mL四甲基乙二胺23pL20fZ混合上述溶液，用少量灌人玻璃板间隙中，冲洗分离胶胶面，而后倒出。然后把余下的胶液注人玻璃板间隙，使胶液面与玻璃板凹槽处平齐，而后插人“梳子”，在室温放置20^30min，浓缩胶即可凝聚。凝聚后，慢慢取出梳子，取时应防止把胶孔弄破。取出梳子后，在形成的胶孔中加人蒸馏水，冲洗未凝聚的丙烯酞胺等，倒出孔中燕馏水，再加人电极缓冲液。将灌好胶的玻璃板垂直固定在电泳槽上，带凹槽的玻璃板与电泳槽紧贴在一起，形成一个贮液槽，向其中加人电极缓冲液，使其与胶孔中的缓冲液相接触。在电泳槽下端的贮液槽中也加人电极缓冲液。1161 HG3616一1999附录B(标准的附录)毒力效价的测定B1毒力效价测定方法之一—用小菜蛾(Plutellaxylostella)作试虫的测定方法(仲裁法)Bl.1试剂或材料标准品:CS-95,Hs.n，效价20000IU/mg.小菜蛾幼虫:Plutellaxylostella.食用菜籽油。醉母粉:工业用。维生素C:医用，分析纯。琼脂粉:凝胶强度大于300g/cmz.磷酸氢二钾:分析纯。磷酸二氢钾:分析纯。聚山梨醋-80:粘度3.5X10-"-5.5X10-m2/s.菜叶粉:甘蓝型油菜叶，800C烘干，磨碎，过80目筛。蔗搪:分析纯。纤维素粉CF-11.氢氧化钾:分析纯。抓化钠:分析纯。15%尼泊金:对经基苯甲酸甲醋(化学纯)溶于95%乙醇。10%甲醛溶液:甲醛(分析纯)溶于蒸馏水。干酷素溶液:干酷素(BR生物试剂)2g加0.001mol/L红氧化钾2mL,8mL蒸馏水，灭菌。磷酸缓冲液:抓化钠8.5g;磷酸氢二钾6.0g,磷酸二氢钾3.0g;聚山梨醋-80溶液。.1mL;蒸馏水1000mL.B1.2仪器、设备磨口三角瓶:250mL.分析天平:精确到。.1mg.电动搅拌器:无级调速，100^6000r/min.医用手术刀。振荡器。水浴锅。养虫管:9cmX2.5cm.烧杯:50mL.试管:18mmX180mm.玻璃珠:那MM.移液管:10mL.B1.3测定步骤B1.11感染液的配制a)标准品用分析天平准确称取标准品100.0^-150.0mg(精确到。1mg)，装人250mL装有10粒玻璃珠的1162 HG3616一1999磨口三角瓶中。加人100mL磷酸缓冲液，浸泡10min，在振荡器上振荡30min。得到浓度约为1mg/mL的标准品母液(该母液在4℃冰箱中可存放10天)。然后将标准品母液稀释成浓度为1.000,0.500,0.250,0.125,0.0625,0.0313mg/mL六个稀释感染液。b)可湿性粉剂样品称取相当于标准品毒力效价的样品适量(精确到。.2mg)，加100mL磷酸缓冲液，然后参照标准品的配制方法配制样品感染液。C悬浮剂样品将样品振荡20min，充分摇匀。用移液管吸取样品10.00mL，加人装有90mL无菌蒸馏水的磨口三角瓶中，吸洗三次，充分摇匀得到含100gL/mL的母液。将母液稀释成含量分别为5.000,2.500,1.250,0.625,0.313和0.156CAL/mL六个稀释液。对有些效价过高或过低的样品，在测定前需先以3个距离相差较大的浓度做预备试验，估计LC,o值(半致死中浓度)的范围，据此设计稀释浓度。B1.3.2感染饲料的配制饲料配方:维生素C0.5g、干酪素溶液1.0mL、菜叶粉3.0g,酵母粉1.5g、维生素粉1.0g,琼脂粉2.0g,蔗糖6.0g、菜籽油。.2mL,10%甲醛溶液。.5mL,15%尼泊金1.0mL,蒸馏水100mL,将蔗糖、醉母粉、干酪素溶液、琼脂粉加人90mL的蒸馏水中调匀。搅拌煮沸，使琼脂完全熔化，加人尼泊金，搅匀。将其他成分用剩余的10mL燕馏水调成糊状。当琼脂冷却至75℃左右时与之充分混合，搅匀，置55℃水浴锅中保温备用。取50mL烧杯7只，写好标签，置55℃水浴中预热;分别向每个烧杯中加人1mL对应浓度的感染液，缓冲液作空白对照。向每个烧杯中加人9mL熔化的感染饲料;用电动搅拌器搅拌20s，使每个烧杯中的感染液与饲料充分混匀。将烧杯静置，待冷却凝固后，用医用手术刀将感染饲料切成1cmX1cm的饲料块，每个浓度取4个饲料块分别放人4支养虫管中，每管放人一块，写好标签。B1.13接虫感染随机取已放置饲料的养虫管，每管投人10头小菜蛾三龄初幼虫，每浓度4管，塞上棉塞，写好标签，在相同饲养条件下饲养。B1.4结果检查及计算感染48h后检查试虫的死亡情况。判断死虫的标准是以细签轻轻触动虫体，无任何反应者判为死亡。计算标准品和样品各浓度的供测昆虫死亡率，查Abbott表或用式(BD计算校正死亡率(X,)。对照死亡率10%以下需要校正，大于10%则试验结果无效。T一C___人1=二----万布xIuO⋯“..⋯‘.·········..⋯⋯(B1)1—U式中:T—处理死亡率;C—对照死亡率。将感染液各浓度换算成对数值，校正死亡率转换成死亡机率值，用最小二乘法分别求出标准品LC,。值和待测样品LCs。值，然后按式(B2)计算待测样品的毒力效价(XZ)[PxIU/mg