HG3617-1999苏云金杆菌可湿性粉剂.pdf 6页

'HG3617-1999前言本标准是根据我国以往制定的苏云金杆菌企业标准等有关材料，结合我国实际情况而制定的。本标准对苏云金杆菌可湿性粉剂的要求、试验方法、抽样以及包装、运输等作了具体要求和规定，从而为苏云金杆菌的生产提供了统一的技术依据。本标准由中华人民共和国原化学工业部技术监督司提出。本标准由化学工业部沈阳化工研究院归口。本标准主要起草单位:中国农业大学应用化学系。本标准参加起草单位:湖北省生物农药工程研究开发中心、济南科贝尔生物工程有限公司。本标准主要起草人:刘丰茂、王开梅、钱传范、钟连胜、赵欣听、王绮文。1166 中华人民共和国化工行业标准FIG3617-1999苏云金杆菌可湿性粉剂Bacillusthuringiensiswettablepowder苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis,B.t.)是目前应用最广泛的一种微生物杀虫剂，它的主要杀虫成分是伴抱晶体中的毒素蛋白，其中，对鳞翅目有毒力的蛋白相对分子质量为130000范围本标准规定了苏云金杆菌可湿性粉剂的要求、试验方法以及标志、标签、包装、贮运。本标准适用于由苏云金杆菌原药和助剂等制成的苏云金杆菌可湿性粉剂，主要用于防治鳞翅目害虫。2引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所有版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB/T1250-1989极限数值的表示方法和判定方法GB/T1600-1979(1989)农药水分侧定方法GB/T1601-1993农药pH值的测定方法GB/T1604一工995商品农药验收规则GB/T1605-19790989)商品农药采样方法GB3796-1983农药包装通则GB/T5451-1984农药可湿性粉剂湿润性测定方法GB/T14825-1993农药可湿性粉剂悬浮率测定方法GB/T16150-1995农药粉剂、可湿性粉荆细度测定方法HG3616-1999苏云金杆菌原粉3要求外观:灰白色至棕揭色疏松粉末，不应有团块。;一;苏云金杆菌可湿性粉剂应符合表1要求。表1苏云金杆菌可湿性粉剂控制项目指标指标项目32000IU/mg16000IU/mg8000IU/mg毒素蛋白，%)4.02.01.0毒力效价([PxIU/mg][HaIU/mg]))32000160008000.pH值6.0-7.5细度(75pm),%)981167 HG3617一1999表1(完)指标项目32000IU/mg16000IU八ng8000IU/mg悬浮率(有效成分)，%)70湿润时间，min毛3水分%镇4.0注Px和H。分别为小菜蛾(Plutellaxylostella)和棉铃虫(Heliothisarmigera)的缩写4试验方法除另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，所述溶液均为水溶液。4.1抽样按照GB/T1605-19790989)中第五章“粉剂和可湿性粉剂的采样”进行，用随机数表法确定抽样的包装件。最终抽样量应不少于1009.4.2鉴别试验当用生物测定法检测产品质量产生疑问时，可用以下方法进行鉴定。用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法测定有效毒素蛋白的相对分子质量是否为130000，并同时测定毒素蛋白含最是否符合3.2指标的规定。4.3毒素蛋白含量的测定毒素蛋白含量可以用SDS-PAGE一扫描法和SDS-PAGE一洗脱比色法两种方法进行测定，二者精密度、准确度接近，前者由于自动化程度更高，而定为仲裁法。4.3.1SDS-PAGE一扫描法(仲裁法)4.3.1.1方法提要用碱性溶液处理苏云金杆菌可湿性粉剂伴抱晶体，使其降解为毒素蛋白，然后通过SDS-PAGE，依蛋白质相对分子质量的差异，使毒素蛋白与其他杂蛋白分离，之后用薄层扫描仪或电泳图像扫描仪扫描蛋白区带面积，进行定量。4.3.1.2仪器、设备电泳仪。夹芯式垂直电泳槽(1.5mm凹形带槽橡胶模框)、凝胶板面积145mmX100mm(1.5mm,12孔样品槽模具)。高速薄层层析扫描仪或电泳图像扫描仪。离心机:10000r/min,分析天平:精确至0.0001g,4.3-1.3试剂和溶液过硫酸按(AP),十二烷基硫酸钠(SDS),四甲基乙二胺(TEMED),氢氧化钠。30%丙烯酞胺:称取丙烯酞胺30g，亚甲基双丙烯酸胺(原称:甲叉双丙烯酸胺)0.8g,溶于100mL蒸馏水中，过滤，于4℃暗处贮存备用。1mot/L,PH8.8三经基甲基氨基甲烷-HCI缓冲液:称取三经基氨基甲烷30.25g溶于蒸馏水中，用浓盐酸调至pH8.8，用蒸馏水定容至250m工。1mot/L,pH6.8三Iq基氨基甲烷-HCI缓冲液:称取三9基氨基甲烷12.10g溶于蒸馏水中，用浓1168 HG3617一1999盐酸调至pH6.8.用蒸馏水定容至100mL.电极缓冲液:称取三轻基氨基甲烷3.03g，甘氨酸14.42g，十二烷基硫酸钠1g，用蒸馏水溶解并定容至1000mLe3X样品稀释液:1mol/L,pH6.8三9基氨基甲烷一HCl18.75mL，十二烷基硫酸钠6g，甘油30mL,琉基乙醇15mL，少许滇酚蓝，用蒸馏水定容至100mL.染色液:称取考马斯亮蓝(CBB)R-2501g，加人甲醇450mL，冰乙酸100mL,蒸馏水450mL，溶解过滤后使用。脱色液:量取甲醇100mL，冰乙酸35ml，用蒸馏水定容至1000mL.漂洗液:量取无水乙醇30mL，冰乙酸10mL,蒸馏水60mL，混合均匀后使用。毒素蛋白标样:毒素蛋白(相对分子质量为130000)含量为9.3%的原粉。4.3-1.4试样处理称取标样、试样各20mg(准确至。.1mg)，移至5mL离心管中，加2mL水充分悬浮。然后加人0.55mol/L氢氧化钠溶液0.45mL(使氢氧化钠溶液的终浓度为0.1mol/L)，放置约5min，再加人3X样品稀释液1.30mL，使最终体积为3.75mL，于1000C沸燕馏水中煮6min，离心(2000r/min)10min后取上层清液，以备电泳上样。4.3-1.5SDS-PAGE分离毒素蛋白a)制备8%-100/n聚丙烯酞胺凝胶采用不连续缓冲系统，制胶方法见HG3616-1999附录A(提示的附录)。b)上样取上述标样溶解上层清液，于聚丙烯酞胺凝胶的上样孔中分别上样6,8,10,12,141,L(毒素蛋白含量约为3-7gg)，作为标准曲线，再取一定体积的试样溶液上层清液(毒素蛋白含量约为5Kg)，加人到上样孔中，注人电极缓冲液后，接通电源。c)电泳电泳初期电压控制在100V左右，待试样进人分离胶后，加大电压到120V，继续电泳，当指示剂前沿到达距底端1cm左右时停止电泳，取出胶板，在7.5写(体积百分数)乙酸中授泡30min,d)染色将分离胶部分取下，用考马斯亮蓝(CBB)R-250染色液染色过夜。e)脱色倒去染色液，先用漂洗液洗涤凝胶，然后加人脱色液，于37℃下加热使其脱色，更换几次脱色液，直至背景清晰为止。4.3.1.6测定胶板经脱色后，可清晰地看到130000蛋白区带，用高速薄层层析扫描仪或电泳图像扫描仪扫描该区带，扫描波长为600nm,样品中毒素蛋白的百分含量(X)按式(1)进行计算。X二塑,VeX100.............·⋯⋯”·⋯⋯(1)m2V,式中:m,—从标准曲线上查得的样品中毒素蛋白的It"jug;mi—lmL稀释液中样品的质量，mg;V—样品最终定容体积,mL(3.75mL);V,—注人凝胶上样孔的样品体积,PL,4.3.1.7允许差取其算术平均值为测定结果。两次平行测定结果相对偏差小于等于8%。4.3.2SDS-PAGE一洗脱比色法1169 HG3617一19994.3.2门方法提要用碱性溶液处理苏云金杆菌可湿性粉剂伴抱晶体，使其降解为毒素蛋白后，通过SDS-PAGE，依蛋白质相对分子质量的差异，使毒素蛋白与其他杂蛋白分离，再割胶，洗脱，测定吸光度。4.3.2.2仪器、设备分光光度计。其他同4.3.1.2,4.32.3试剂和溶液毗15to其他同4.3.1.3.4.3-2.4试样处理同4.3.1.4,4.3-2.5SDS-PAGE分离毒素蛋白a)制备8%-10%聚丙烯酸胺授胶同4.3.1.5a),b)上样取上述标样溶液上层清液，于上样孔中分别上样15,20,30,40,50pL(毒素蛋白含量约为7.5-25pg)。作为标准曲线，再取一定体积的试样溶液上层清液(毒素蛋白含里约为15pg)，加人到上样孔中，注人电极缓冲液后，接通电源。c)电泳同4.3.1.50,d)染色同4.3.1.5d),e)脱色同4.3.l.5e),4.3.2.6测定用手术刀刮下待测区带，放于玻璃试管中，再加25环毗吮(体积百分数)3.0mL，于37℃下振荡洗脱毒素蛋白所吸附的考克斯亮蓝(CBB)R-250，平衡后用分光光度计，以25%毗咤为参比，于605nm下，测定溶液的吸光度，用式(1)计算毒素蛋白含量。43.2.7允许差取其算术平均值为测定结果。两次平行测定结果相对偏差小于等于8%。4.4毒力效价的测定按HG3616-1999附录B(标准的附录)进行。4.spH值的测定按GB/T1601进行。4.6细度的测定按GB/T16150-1995中2.2进行测定。4.7悬浮率测定4.7.1操作步骤称取样品200.0mg(精确到。1mg)，放人盛有玻璃珠的三角瓶中，加人标准硬水100mL，用手左右振荡60次。制得的悬浮液全部转移到250mL具塞量简中，用标准硬水稀释到250mL。按GB/T14825-93中3.1进行。4.7.2计算悬浮率(Y)按式(2)计算:1170 HG3617一1999111.1(C一Q)y=⋯⋯(2)C式中:C—配置悬浮液所取试样的毒力效价，IU;Q—留在量筒底部的25mL悬浮液的毒力效价，IU,4.7.3允许差二次重复测定结果之差应不超过loan,4.8湿润时间的测定按GB/T5451进行。4.9水分的测定按GB/T1600-1979(1989)中“共沸蒸馏法，进行测定。5检脸规则应符合GB/T1604有关规定。极限数值按GB/T1250处理。6标志、标签、包装、贮运6.，产品包装应符合GB3796规定，并应注明所用标准编号。6.2可湿性粉剂产品主要采用塑料袋包装，密封。6.3贮存时严防日晒，勿受压，I于阴凉干燥处。6.4运输时，注意轻放，防止损坏。6.5保证期:在正常贮运条件下，可湿性粉剂的质f保征期从生产日期算起为二年，产品出厂时毒力效价和毒素蛋白含f不低子3.2指标，两年内产品毒力效价和毒素蛋白含t均不低于3.2指标的70%.1171'