HG3618-1999苏云金杆菌悬浮剂.pdf 6页

'HG3615-1999前言本标准是根据我国以往制定的苏云金杆菌企业标准等有关材料，结合我国实际情况而制定的本标准对苏云金杆菌悬浮剂的要求、试验方法、抽样以及包装、运输等作了具体要求和规定，从而为苏云金杆菌的生产提供了统一的技术依据。本标准由中华人民共和国原化学工业部技术监督司提出。本标准由化学工业部沈阳化工研究院归口。本标准主要起草单位:中国农业大学应用化学系。本标准参加起草单位:湖北省生物农药工程研究开发中心、济南科贝尔生物工程有限公司。本标准主要起草人:刘丰茂、王开梅、钱传范、钟连胜、赵欣听、王绮文。1172 中华人民共和国化工行业标准HG3618一1999苏云金杆菌悬浮剂Bacillusthuringiensissuspensioncon亡entrate苏云金杆菌(Bacillusthuringlensis，B.t.)是目前应用最广泛的一种微生物杀虫剂，它的主要杀虫成分是伴抱晶体中的毒素蛋白，其中，对鳞翅目有毒力的蛋白相对分子质量为13000。范圈本标准规定了苏云金杆菌悬浮剂的要求、试验方法以及标志、标签、包装、贮运。本标准适用于由苏云金杆菌原药和助剂制成的苏云金杆菌悬浮剂，主要用于防治鳞翅目害虫。2引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所有版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB/T125o一1989极限数值的表示方法和判定方法GB/T1601一1993农药pH值的测定方法GB/T1604一1995商品农药验收规则GB/T1605一1979(1989)商品农药采样方法GB3796一1983农药包装通则GB/T14825一1993农药可湿性粉剂悬浮率测定方法GB/T1615。一1995农药粉剂、可湿性粉剂细度测定方法HG3617一1999苏云金杆菌原粉3要求3.1外观:棕黄色至褐色悬浮液体。3.2苏云金杆菌悬浮剂还应符合表1要求。表1苏云金杆菌悬浮剂控制项目指标指标项目s000IU/“L4000IU/尸L2000lU/朴L毒家蛋白，%)0.80。40.2毒力效价([PxltJ小L〕[Halu加L」))8000400020000.pH值范围4.5~6.5细度(150料m).%)98悬浮率(有效成分)，%)80注:Px和Ha分别为小菜蛾(Plutellaxylostella)和相铃虫(Heliothisa恤娜ra)的缩写。国家石油和化学工业局199一06一16批准2000一06一01实施1173 HG3618一19994试验方法除另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，所述溶液均为水溶液。4.1抽样按照GB/T1605-19790989)中第四章“乳剂和液体状态的采样”进行，用随机数表法确定抽样的包装件数，最终抽样量应不少于250mL,4.2鉴别试验当用生物测定法检测产品质量产生疑问时，可用以下方法进行鉴定。用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法测定有效毒素蛋白的相对分子质量是否为130000，并同时测定毒素蛋白含量是否符合3.2指标的规定。4.3毒素蛋白含量的测定毒素蛋白含量可以用SDS-PAGE一扫描法和SDS-PAGE一洗脱比色法两种方法进行测定，二者精密度、准确度接近，前者由于自动化程度更高，而定为仲裁法。4.3.1SDS-PAGE一扫描法(仲裁法)4.3.1.1方法提要用碱性溶液处理苏云金杆菌悬浮剂伴抱晶体，使其降解为毒素蛋白，然后通过SDS-PAGE，依蛋白质相对分子质量的差异，使毒素蛋白与其他杂蛋白分离，之后用薄层扫描仪或电泳图像扫描仪扫描蛋白区带面积，进行定量。4.3.1.2仪器、设备电泳仪。夹芯式垂直电泳槽(1.5mm凹形带槽橡胶模框)、凝胶板面积145mmX100mm(1.5mm,12孔样品槽模具)。高速薄层层析扫描仪或电泳图像扫描仪。离心机:10000r/min,分析天平:精确至0.0001g,4.3.1.3试剂和溶液过硫酸铁(AP),十二烷基硫酸钠(SDS),四甲基乙二胺(TEMED),氢氧化钠。30%丙烯酞胺:称取丙烯酞胺30g，亚甲基双丙烯酸胺(原称:甲叉双丙烯酞胺0.8g，溶于100mL蒸馏水中，过滤，于40C暗处贮存备用。1mol/L,pH8.8三经基甲基氛基甲烷-HCI缓冲液:称取三经基甲基氨基甲烷30.25g溶于蒸馏水中.用浓盐酸调至pH8.8，用燕馏水定容至250mL,1mol/L,pH6.8三9基甲基氛基甲烷-HCI缓冲液:称取三9基甲基氨基甲烷12.10g溶于蒸馏水中，用浓盐酸调至pH6.8，用蒸馏水定容至100mL,电极缓冲液:称取三经基甲墓氛基甲烷3.03g，甘氨酸14.42g，十二烷基硫酸钠1g，用蒸馏水溶解并定容至1000mL,3X样品稀释液:1mol/L,pH6.8三经基甲基氨基甲烷-HCI18.75mL，十二烷基硫酸钠6g，甘油30mL,琉基乙醇15mL，少许滨酚蓝，用燕馏水定容至100mL,染色液:称取考马斯亮蓝(CBB)R-2501g，加人甲醇450mL,冰乙酸100mL,燕馏水450mL，溶解过滤后使用。脱色液:量取甲醇100mL，冰乙酸35mL，用燕馏水定容至1000mL1174 HG3618一1999漂洗液:量取无水乙醇30mL，冰乙酸10mL,蒸馏水60mL,混合均匀后使用。毒素蛋白标样:毒素蛋白(相对分子质量为130000)含量为9.3%的原粉。4.3.1.4试样处理称取标样20mg(准确至。.1mg)，移至5mL离心管中，加2mL水充分悬浮。量取待测试样10mL，准确称量后，用蒸馏水定容至100mL，充分摇匀后取2mL稀释液，移至5mL离心管中。在上述2ml，试样溶液中加人0.55mol/L氢氧化钠溶液0.45mL(使氢氧化钠溶液的终浓度为0.1mol/L)，放置约5min，再加人3X样品稀释液1.30mL，使最终体积为3.75mL，于100℃沸蒸馏水中煮6min,离心(2000r/min)10min后取上层清液，以备电泳上样。4.3.1.5SDS-PAGE分离毒素蛋白a)制备8%-10%聚丙烯酞胺凝胶采用不连续缓冲系统，制胶方法见HG3616-1999附录A(提示的附录)。b)上样取上述标样溶液上层清液，于聚丙烯酞胺凝胶的上样孔中分别上样6,8,10,12,14pL(毒素蛋白含量约为3-7pg)，作为标准曲线，再取一定体积的试样溶液上层清液(毒素蛋白含量约为5pg)，加人到上样孔中，注人电极缓冲液后，接通电源。c)电泳电泳初期电压控制在100V左右，待试样进人分离胶后，加大电压到120V，继续电泳，当指示剂前沿到达距底端1cm左右时停止电泳，取出胶板，在7.5%(体积百分数)的乙酸中浸泡30min,d)染色将分离胶部分取下，用考马斯亮蓝(CBB)R-250染色液染色过夜。e)脱色倒去染色液，先用漂洗液洗涤凝胶，然后加人脱色液，于37℃下加热使其脱色，更换几次脱色掖，直至背景清晰为止。4-3.，.6测定胶板经脱色后，可清晰地看到130000蛋白区带，用高速薄层层析扫描仪或电泳图像扫描仪扫描该区带，扫描波长为600n,样品中毒素蛋白的百分含量(X)按式(1)进行计算。X二-,VX100···⋯⋯’········.··⋯⋯(1)m2V,式中:m,—从标准曲线上查得的样品中毒索蛋白的量,kg.m,-2mL稀释液中样品的质I,mgtV,—样品最终定容体积,mL(3.75mL)=vZ—注人凝胶上样孔的样品体积,pL,4.3.1.7允许差取其算术平均值为测定结果。两次平行测定结果相对偏差小于等于8%。4.3.2SDS-PAGE-洗脱比色法4.3.2.1方法提要用碱性溶液处理苏云金杆菌悬浮剂伴抱晶体，使其降解为毒素蛋白，然后通过SDS-PAGE.依蛋白质相对分子质量的差异，使毒素蛋白与其他杂蛋白分离，再剖胶，洗脱，测定吸光度。4.3-2.2仪器分光光度计。其他同4.3.1.2,1175 HG3618一19994.3-2.3试剂和溶液毗吮e其他同4.3.1.3,4.3.2.4试样处理同43144.3-2.5SDS-PAGE分离毒素蛋白a)制备8%-10%聚丙烯酞胺凝胶同4.3.1.5a).b)上样取上述标样溶掖上层清液，于上样孔中分别上样15,20,30,40,50pL(毒素蛋白含量约为7.5^25p8)，作为标准曲线，再取一定体积的试样溶液上层清液(毒素蛋白含盈约为15pg)，加人到上样孔中，注人电极缓冲液后，接通电源。c)电泳同4.3.1.5c),d)染色同4.3.1.5d).e)脱色同4.3.1.5e).4.3.2.6测定用手术刀刮下待测区带.放于玻璃试管中，再加25%毗陡(体积百分数)3.0mL，于37℃下振荡洗脱毒素蛋白所吸附的考马斯亮蓝(CBB)R-250，平衡后用分光光度计，以25%毗吮为参比，于605nm下，测定溶液的吸光度，用式(1)计算毒素蛋白含量。4.3.2.7允许差取其算术平均值为测定结果。两次平行测定结果相对偏差小于等于8%.4.4毒力效价的测定按HG3616-1999附录B(标准的附录)进行。4.5FH值的测定按GB/T1601进行。4.6悬浮率测定4.6.1测定步骤样品招匀后取5.00mL(精确到0.01mL)，于100mL三角玻瑞瓶中，加人标准硬水100mL，用手左右振荡50次。制得的悬浮液全部转移到250mL具塞t筒中，用标准硬水稀释到250mL。按GB/T14825-1993中3.1进行。4.6.2计算悬浮率(Y)按式(2)进行计算:111.1(C一Q)y=·.....⋯⋯”....。··········........(2)C式中:C配置悬浮液所取试样的毒力效价，IU,Q—留在I筒底部的25mL悬浮液的毒力效价，IU,4.6.3允许差二次重复测定结果之差不得超过10%.4.7细度的测定吸20.00mL试样(准确至0.01mL)，按GB/T16150-1995中2.2进行。1176 HG3618一19995检验规则应符合GB/T1604有关规定。极限数值按GB/T1250处理。6标志、标签、包装、贮运6，产品包装应符合GB3796规定，并应注明所用标准编号。6.2悬浮剂产品主要采用1L塑料壶包装，壶有内外盖，不泄漏。6.3贮存时严防日晒，勿受压，置于阴凉干燥处。64运输时，注意轻放，防止损坏。6.5保证期:在正常贮运条件下.悬浮剂的质量保证期从生产日期算起为一年半，本产品出厂时毒力效价且蛋白含量不低于3.2指标，一年半内毒力效价与蛋白含量均不低于3.2指标的60%.1177'