谷子AuxIAA家族基因干旱胁迫响应表达模式分析.pdf 8页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn谷子Aux/IAA家族基因干旱胁迫响应表达模#式分析1211341,2**刘晶，王俊杰，程璐，陈利青，禾璐，候蕊，韩渊怀5（1.山西农业大学农学院，山西太谷030801；2.山西农业大学生物工程研究所，山西太谷030801；3.山西省农业科学院玉米研究所，山西忻州034000；4.山西省晋城市城区农业委员会，山西晋城048400）10摘要：Aux/IAA是重要的蛋白质转录因子，广泛参与植物生长素介导的应答作用，同时参与植物的胁迫和防御响应。本文通过分析Aux/IAA家族基因在干旱胁迫中的表达情况，探索谷子的抗旱与Aux/IAA家族基因的关系。本文对谷子Aux/IAA家族基因理化性质、蛋白亲疏水性、启动子功能元件等进行生物信息学分析，并对抗旱（GG）和干旱敏感(JF16)谷子品种在浇水和干旱胁迫下基因的表达谱数据进行分析。结果显示：谷子Aux/IAA家族基因均15含有多个与胁迫相关的功能元件，且5个基因编码的蛋白均为亲水性蛋白；干旱胁迫处理后，GG和JF16中5个基因的表达变化趋势有所不同，Seita.5G126200、Seita.1G028400、Seita.3G109400表达量均下调，Seita.1G356800基因的表达量明显上调。谷子Aux/IAA家族基因参与调控谷子干旱胁迫，且其调控过程比较复杂，可作为参与谷子抗旱的候选基因。本研究结果为进一步探究谷子中Aux/IAA与抗旱机制提供理论基础。20关键词：谷子；Aux/IAA；干旱胁迫；生物信息学分析中图分类号：S515ExpressionanalysisofAux/IAAfamilymembersinresponsetodroughtstressinfoxtailmillet12113425LIUJing,WANGJunjie,CHENGLu,CHENLiqing,HELu,HOURui,HAN1,2Yuanhuai(1.CollegeofAgriculture，ShanxiAgricultureUniversity，Taigu030801，China;2.InstituteofAgriculturalBioengineering，ShanxiAgricultureUniversity，Taigu030801，China;3.MaizeResearchInstitutetoShanxiAcademyofAgricultureSciences，Xinzhou034000，China;304.UrbanAgricultureCommitteeofShanxiJincheng，Jincheng048400，China)Abstract:Aux/IAAisanimportanttranscriptionfactorprotein.Itiswidelyinvolvedinplantauxin-mediatedresponse,plantstressanddefenseresponse.TherelationshipbetweendroughtresistanceandAux/IAAfamilymemberswasstudiedbyanalyzingtheexpressionofAux/IAAfamilymembersunderdroughtstressinfoxtailmillet.Thebioinformaticsanalysiswascarriedouton35thephysicochemicalproperties,proteinhydrophobicityandcis-actingelementsoftheAux/IAAfamilymembersinfoxtailmillet.ThenweanalyzedtheexpressionofAux/IAAfamilymembersunderdroughtstress.Theresultsshowedthattherewereanumberofstress-relatedfunctionalelementsintheAux/IAAfamilymembersinfoxtailmille,andtheproteinstheycodewereallhydrophilic.Theexpressionlevelsofgenesweresignificantlydifferentbetweendrought-tolerantanddrought-sensitive40varietiesunderdroughtstress.TheexpressionlevelsofSeita1.5G126200,Seita.1G028400andSeita.3G109400weredown-regulated,whereastheexpressionlevelofSeita.1G356800genewassignificantlyup-regulated.TheAux/IAAfamilymembersinfoxtailmilletareinvolvedintheregulation基金项目：教育部高等学校博士学科点专项基金（20131403110001）;山西农业大学科技创新基金（20142-07）作者简介：刘晶（1994-），女，硕士，基因组学与分子育种通信联系人：韩渊怀（1963-），男，教授，博导，作物遗传育种.E-mail:swgctd@163.com-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnofmilletdroughtstress,andtheprocessofregulationisacomplexprocess.Someofthemcouldalsobeusedascandidategenesfordroughttoleranceinfoxtailmillet.Theseresultsprovideatheoreticalbasis45forfurtherstudyofthemechanismoftherelationshipbetweentheAux/IAAanddroughttoleranceinfoxtailmillet.Keywords:Foxtailmillet;Aux/IAAfamilymembers;Droughtstress;Bioinformaticsanalysis500引言谷子在古代被称做“百谷之长”，是我国种植最古老的农作物之一，是重要的杂粮作物[1]。我国的谷子种植范围较广，主要分布在华北、东北地区。由于种植地区不同，各地区的环境、气候条件差异较大，对谷子的生长发育产生较大影响。目前，影响谷子产量的因素有很多，干旱（drought）是限制谷子产量提高的主要因素。55因此，了解谷子干旱胁迫条件下的分子机制对提高谷子抗旱性有很大作用。生长素IAA（Indole-3-aceticacid），是重要的植物激素之一，对植物生长发育具有重要的调节作用，其在转录水平上的调控受很多蛋白的影响。Aux/IAA（auxin/indoleaceticacidsprotein）和生长素应答因子ARF（auxinresponsefactor）是两个重要的蛋白质转录因子，它们广泛参与植物生长素介导的应答作用，Aux/IAA蛋白是通过与ARF转录因子相互60作用介导生长素反应的短寿命转录调控因子。通常Aux/IAA家族基因均包含4个保守结[2]构域：结构域I、II、III、IV。近年来对Aux/IAA基因家族的研究逐渐成为热点，虽然对植物生长素的研究主要集中在植物发育过程中，但最近的一些研究表明，生长素也参与植物的胁迫或防御反应。据报道，[3]植物感病时内源性激素IAA含量显著增加，同时，一些生长素调节基因的表达量也会发[4][5]65生改变；microRNA介导的生长素信号被抑制时，可以使细菌的耐药性增强；对水稻生长素相关的基因进行全基因组分析发现，几种与生长素相关的基因在各种非生物胁迫条件下[6]的表达存在差异，说明生长素与非生物胁迫信号之间是有联系的；拟南芥处于低温环境时，[7]其中Aux/IAA和ARF基因家族成员的表达也会发生改变。目前国内外对于谷子中Aux/IAA基因家族干旱胁迫表达分析的研究较少，本研究以耐70旱品种勾勾母鸡咀（GG）和干旱敏感品种晋汾16（JF16）为材料，种植21d，用20%的PEG-6000对谷子幼苗进行干旱胁迫处理，将处理后的幼苗提取RNA，进行表达谱测序分析，找到与胁迫相关的Aux/IAA家族基因，对其理化性质、启动子元件等进行生物信息学分析，同时对干旱胁迫下耐旱品种GG和干旱敏感品种JF16中不同Aux/IAA家族基因成员的表达量进行分析，为进一步研究谷子Aux/IAA家族基因在干旱胁迫等发育进程中的功能奠定基础，75为植物在分子水平的抗旱机制提供理论基础。1材料与方法1.1试验材料试验所用材料耐旱品种勾勾母鸡咀（GG）和干旱敏感品种晋汾16（JF16）由山西农业大学农业生物工程研究所和山西省农业科学院品种资源研究所提供，在山西农业大学农学院-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn80人工气候室种植培养。将GG和JF16种于混合土壤（蛭石：营养土=1:3），在14h光照（28℃）、10h黑暗（23℃）条件下培养21天后，用20%的PEG-6000对谷子幼苗进行干旱胁迫处理，处理时间为30min，对照组用蒸馏水处理。将处理后的幼苗随机选取3株，提取RNA、反转录，然后进行表达谱测序分析。851.2试验方法利用ExPASY（https://web.expasy.org/compute-pi/）分析谷子Aux/IAA家族基因的理化性质；利用GSDS2.0（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析基因结构；利用ExpasyProtscale（http://web.expasy.org/protscale/）分析Aux/IAA家族基因编码蛋90白的亲水/疏水性；利用Phytozome12（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）谷子基因组数据库查找Aux/IAA家族基因的基因序列信息；利用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）对谷子Aux/IAA家族基因进行启动子元件分析；95利用MAGA7.0软件对谷子中找到的5个Aux/IAA家族基因的氨基酸序列进行比对，构建系统发育树。2结果2.1谷子Aux/IAA家族基因的基因结构与理化性质在谷子中找到了5个Aux/IAA家族基因，对它们进行基因结构和理化性质的分析，主100要包括基因组序列长度、CDS序列长度、在染色体上的位置、氨基酸数量、等电点和分子量。由表1可以看出，谷子Aux/IAA家族的5个基因分布在3条不同的染色体上，分别位于1，3，5号染色体的不同位点。他们的基因组序列长度有很大区别，最小为973bp，最大的有4822bp；有4个蛋白长度在231~277个氨基酸之间，最小（Seita.1G028400）为175个氨基酸，相对应的蛋白分子量在18914.19（Seita.1G356800）~29316.79（Seita.1G028400）105之间，CDS序列长度在528~810之间。等电点分析发现，除Seita.1G356800等电点的为6.08显酸性外，其余4个均大于7.5，显碱性。表1谷子Aux/IAA家族基因的基本信息Table1ThebasicinformationofAux/IAAfamilymembersinfoxtailmilletCDS序列长度染色体位置氨基酸数目分子量/Da基因名称基因长度等电点LengthofLocationofNumberofMolecularGenesnameLengthofgenePICDSsequencechromosomeaminoacidsweight/DaSeita.5G12620097372352407.8526273.25Seita.5G268600312381052698.1928230.03Seita.1G356800482283412776.0818914.19Seita.1G028400124052811758.3829316.79Seita.3G109400260869632318.5623918.72-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn1102.2Aux/IAA家族基因内含子-外显子结构组成分析使用GSDS2.0对Aux/IAA家族基因的CDS序列、基因序列进行结构分析。由图1可以看出：所有基因都包含内含子和外显子结构，Seita.1G028400、Seita.3G109400都含有5个内含子，Seita.5G268600含有4个内含子，而Seita.1G356800和Seita.5G126200只含有2个内含子；Seita.5G126200不含有上下游序列，且Seita.1G028400、Seita.3G109400有较长115的上游序列。图1谷子Aux/IAA家族基因内含子-外显子结构Fig.1Intron-exonstructuresofAux/IAAfamilymembersinfoxtailmillet2.3Aux/IAA家族基因编码蛋白的亲水/疏水性分析120用ExpasyProtscale分析Aux/IAA家族基因编码蛋白的亲水/疏水性，结果如图1所示：Aux/IAA家族基因蛋白氨基酸残基中疏水性最强的为Seita.1G356800（2.500），最弱的为Seita.3G109400（2.360）；亲水性最强Seita.5G126200（-3.780），最弱（-3.080）。在5个Aux/IAA家族基因编码的蛋白中，亲水性氨基酸数量明显多于疏水性氨基酸的数目，故推断5个Aux/IAA家族基因编码的蛋白均为亲水蛋白。125-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图2Aux/IAA家族基因蛋白的亲水/疏水性预测Fig.2PredictionofhydrophobicityandrophilicityofAux/IAAfamilymembers1302.4Aux/IAA家族基因的启动子元件及功能分析使用在线软件PlantCARE对所取谷子的Aux/IAA家族基因启动子上游1500bp进行启动子元件分析。由表2可以看出谷子Aux/IAA家族基因都含有至少一个或多个与胁迫相关的调控元件，它们共同调控谷子生长过程对胁迫的应对。5个基因均含有与茉莉酸甲酯（MeJA）相关的调控元件，除Seita.5G126200外均含有与脱落酸（ABA）相关的调控元件，除135Seita.1G356800外都含有与水杨酸（SA）相关的调控元件，Seita.1G356800和Seita.1G028400含有与赤霉素（GA）相关的调控元件等。表2谷子Aux/IAA家族基因启动子功能元件数目Table2ThenumbersofpromoterelementinAux/IAAgenefamilymembersinfoxtailmillet胁迫有关的启动子功能元件Cis-actingelementsrelatedtostress胁迫响应低温响应干旱诱导响应热响应基因DefenseLowDroughtABAMeJASAGAMYBLightHeatstressGeneandstresstemperature-inducibilityresponseresponseresponseresponseSeita.5G12620004102100210Seita.5G26860034100251101Seita.1G35680024013260000Seita.1G02840012111170000Seita.3G10940022200162000140表3谷子Aux/IAA家族基因成员中与胁迫相关的顺式作用元件Table3Cis-actingelementswithfunctionrelatedtostressesinAux/IAAgenefamilymembersinfoxtailmillet元件功能元件名称序列ElementsfunctionElementsnameSequenceABAABRECGCACGTGTCABRECACGTGABRETACGTGMeJACGTCA-motifCGTCATGACG-motifTGACGSATCA-elementCAGAAAAGGATCA-elementTCAGAAGAGGGATATC-boxTATCCCA-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnMYBMBSCGGTCA热响应HSEAGAAAATTCG胁迫响应TC-richrepeatsATTTTCTTCA低温响应LTRCCGAAA干旱诱导MBSTAACTG厌氧诱导GC-motifCCCCCGGC-motifGCCGCGCG2.5Aux/IAA家族基因成员干旱胁迫时在GG和JF中的表达量分析145使用20%的PEG-6000对谷子幼苗进行干旱胁迫处理后，对Aux/IAA家族基因在耐旱品种GG和干旱敏感品种JF16中的表达量进行分析（图3）。由图中可以看出，GG和JF中，Seita.5G126200、Seita.1G028400、Seita.3G109400三个基因在干旱胁迫条件下，表达量都下调；Seita.5G268600基因在正常浇水时表达水平差异不明显，在干旱胁迫时，耐旱品种GG中表达量上调，在干旱敏感品种JF16中表达量却出现150下调；Seita.1G356800基因在正常浇水情况下，在GG中表达水平很低，在JF中表达水平较高；在干旱胁迫时，GG和JF中Seita.1G356800基因的表达量都明显上调。图3谷子Aux/IAA家族基因干旱胁迫及对照情况下在GG和JF中的表达量155Fig.3TheexpressionofAux/IAAfamilymembersinGGandJFunderdroughtstressandcontrol-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn2.6谷子Aux/IAA家族基因成员亲缘关系分析使用MAGA6.0软件对谷子中找到的5个Aux/IAA家族基因的氨基酸序列进行比对，构建系统发育树，从而可以直观的看到5个成员亲缘关系的远近，了解其进化过程。由图可160知，Aux/IAA家族5个基因中，其中Seita.1G356800和Seita.5G268600聚为一类，说明二者亲缘关系较近；Seita.3G109400和Seita.5G126200聚为一类，二者亲缘关系较近；Seita.1G028400单独为一类，但是它与Seita.1G356800、Seita.5G268600在一个大的分支，说明Seita.1G028400与Seita.1G356800、Seita.5G268600有一定的亲缘关系。165图4谷子Aux/IAA家族基因进化树分析Fig.4PhylogenetictreeofAux/IAAfamilymembers3结论与讨论生长素IAA是植物体内一种非常重要的激素，在植物的生长发育过程中起重要的调节170作用。Aux/IAA基因是生长素信号转导过程中重要的调节转录因子，同时它在植物抗逆性方面也起到调节作用。本文通过对谷子幼苗进行20%的PEG-6000干旱胁迫处理，找到5个响应干旱胁迫的Aux/IAA家族基因，对其基因结构、理化性质、与胁迫相关的启动子原件等进行分析，为研究谷子Aux/IAA家族基因在干旱胁迫等发育进程中的功能奠定基础。通过对Aux/IAA家族5个基因编码的蛋白质进行亲水/疏水性分析，发现5个蛋白均为175亲水性蛋白。蛋白质的高亲水性使植物即使受到干旱胁迫，蛋白质也能够代替细胞中的水分[8]子，从而很好的抵御干旱胁迫对植物造成的损伤，在提高植物的抗逆性方面有很大作用。表明，Aux/IAA家族基因对谷子抗旱性的提高方面有影响。通过对谷子Aux/IAA家族基因启动子上游1500bp进行启动子元件分析，结果显示，谷子Aux/IAA家族基因包含许多与胁迫相关的元件：ABRE是与脱落酸（ABA）相关的调控180元件，而ABA可以提高植物的抗旱能力；CGTCA-motif和TGACG-motif均是与茉莉酸甲酯（MeJA）相关的调控元件，MeJA能够激发植物防御基因的表达，从而提高植物的抗逆[9]能力；TCA-element和TATC-box分别是与水杨酸（SA）和赤霉素（GA）相关的调控元件，据报道，干旱条件下在玉米幼苗叶表皮喷洒SA可以提高其抗旱性、GA可以提高烟草[10-11]幼苗及种子的抗旱性；MBS（TAACTG）是与干旱诱导相关的调控元件；MBS185（CGGTCA）、TC-richrepeats等都是与胁迫相关的调控元件，它们共同作用来调节谷子生-7- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn长过程对胁迫的响应。有研究表明，对不同胁迫下水稻中Aux/IAA家族基因的表达谱进行分析，多个基因表[12]达量出现上调或下调。本试验通过分析Aux/IAA家族的5个基因在耐旱品种GG和干旱敏感品种JF16中的表达量，发现在干旱胁迫时，Seita.1G356800基因表达量在两个品种中[6]190都上调，说明该基因响应干旱胁迫，提高植物的抗旱能力，与Jain等人的研究结果一致；Seita.5G268600基因干旱胁迫下在耐旱品种GG中表达量上调，在干旱敏感品种JF中表达量下调，说明该基因在两个不同品种中表达响应不同，可能是造成两个品种抗旱能力不同的原因之一；Seita.5G126200、Seita.1G028400、Seita.3G109400三个基因表达量均下调，说明[14]Aux/IAA家族基因在生长素、水杨酸和抗生素胁迫信号通路之间的串扰中起到重要作用。195综上所述，通过对谷子Aux/IAA家族基因进行理化性质、蛋白质亲疏水性、所含胁迫原件等进行了生物信息学分析，并对谷子干旱胁迫下的表达谱数据进行分析，阐明谷子Aux/IAA家族基因与干旱胁迫相关，但是它的表达是个复杂的过程，因此我们通过初步探究了解谷子在干旱胁迫时它的表达量及其变化规律，为植物的抗旱和激素调节植物生长提供理论基础。200[参考文献](References)[1]禾璐．绿色小米品种大青谷米色形成机制研究[D]．太谷：山西农业大学，2015．[2]HagenG，GuilfoyleT．Auxin-responsivegeneexpression:genes,promotersandregulatoryfactors[J]．PlantMolecularBiology，2002，49(3/4)：373-385.205[3]O"DonnellPJ，SchmelzEA，MoussatcheP，etal．Susceptibletointolerance-arangeofhormonalactionsinasusceptibleArabidopsispathogenresponse[J]．PlantJournal，2003，33(2)：245-257．[4]DowdC，WilsonLW，McFaddenH．GeneexpressionprofilechangesincottonrootandhypocotyltissuesinresponsetoinfectionwithFusariumoxysporumf.sp.vasinfectum[J]．MolecularPlant-MicrobeInteractions，2004，17(6)：654-667．210[5]NavarroL，DunoyerP，JayF，etal．AplantmiRNAcontributestoantibacterialresistancebyrepressingauxinsignaling[J]．Science，2006，312：436-439．[6]JainM，KhuranaJP．Transcriptprofilingrevealsdiverserolesofauxin-responsivegenesduringreproductivedevelopmentandabioticstressinrice[J]．FEBSJournal，2009，276(11)：3148-3162．[7]HannahMA，HeyerAG，HinchaDK．Aglobalsurveyofgeneregulationduringcoldacclimationin215Arabidopsisthaliana[J]．PLoSGenetics，2005，1(2)：179-196．[8]BakerJ，SteeleC，DureL．Sequenceandcharacterizationof6Leaproteinsandtheirgenesfromcotton[J]．PlantMolecularBiology，1988，11(3)：277-291．[9]HorbowiczM，KossonR，WiczkowskiW，etal．Theeffectofmethyljasmonateonaccumulationof2-phenylethylamineandputrescineinseedlingsofcommonbuckwheat(Fagopyrumesculentum)[J]．ActaPhysiol220Plant，2001，33(3)：897-903．[10]坎平，王莎莎，马文广，等.赤霉素引发同时提高烟草种子及幼苗抗旱性和抗冷性[J].种子，2014，2(33)：30-34．[11]曹翠玲，刘林丽，田强兵．水杨酸对玉米幼苗抗旱性的影响[J]．玉米科学，2014，12(增刊)：103-104．[12]SongY，WangL，XiongL．ComprehensiveexpressionprofilinganalysisofOsIAAgenefamilyin225developmentalprocessesandinresponsetophytohormoneandstresstreatments［J］．Planta，2009，229(3)：577-591[13]CakirB，KilickayaO，OlcayAC．Genome-wideanalysisofAux/IAAgenesinVitisvinifera:cloningandexpressionprofilingofagrapeAux/IAAgeneinresponsetophytohormoneandabioticstresses［J］．ActaPhysiolPlant，2013，35(2)：365-377．230-8-'