滋补脾阴法对糖尿病认知功能障碍大鼠海马线粒体功能障碍作用的研究.pdf 6页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn滋补脾阴法对糖尿病认知功能障碍大鼠海#马线粒体功能障碍作用的研究12**孙铮，战丽彬5（1.大连医科大学中西医结合研究所，辽宁大连116044；2.南京中医药大学基础医学院）摘要：目的：探讨滋补脾阴法调节糖尿病认知功能障碍大鼠海马线粒体功能的机制。方法将SD大鼠随机分为对照组(Con)，糖尿病组(Model)，滋补脾阴方药组(ZBPYR)，补中益气汤组10（BZYQ）和六味地黄汤治疗组（LWDH）共5组。通过DCFH荧光标记和JC-1染色法分别检测活性氧含量、线粒体膜电位。WesternBlot观察各组海马组织中细胞色素C（CytoC）在胞核/胞浆中表达的差异及总蛋白表达水平的差异。结果1.ZBPYR组和BZYQ组线粒体活性氧（ROS）含量较Model组降低（P<0.05），LWDH组与Model组相比无明显统计学差异（P>0.05）；2.与Model组比较，ZBPYR组、BZYQ组海马组织线粒体膜电位15明显升高（P<0.05），LWDH组线粒体膜电位变化不明显（P>0.05）；3.ZBPYR组和LWDH组胞浆中CytoC蛋白表达水平较Model组减弱（P<0.01），BZYQ中CytoC蛋白表达水平较Model组无统计学意义；4.ZBPYR组、BZYQ组和LWDH组胞核中CytoC蛋白表达水平较Model组增强（P<0.01）。结论：滋补脾阴方药较补中益气汤、六味地黄汤能明显改善糖尿病认知功能障碍大鼠海马线粒体ROS含量、线粒体膜电位，并阻止线粒体中CytoC向20胞浆释放。推测滋补脾阴方药提高大鼠认知功能是通过调节线粒体功能完成的。结果提示滋补脾阴法，对糖尿病大鼠认知功能障碍的疗效优于脾益气法和滋补肾阴法。关键词：滋补脾阴法；健脾益气法；滋补肾阴法；糖尿病认知功能障碍；线粒体功能中图分类号：R285.525TheeffectsofZibuPiyinrecipeonthemitochondrialfunctioninthehippocampusofdiabetescognitivedysfunctionrats12SUNZheng,ZHANLi-bin(1.DalianMedicalUniversity,College(Institute)ofIntegrativeMedicine;302.NanjingUniverisityofChineseMedicine，CollegeofBasicMedicine)Abstract:ToinvestigatethemechanismofZibuPiyinRecipeonthehippocampusmitochondriaofdiabetes-associatedcognitivedeclinerats.Methods:SDratsweredividedintofivegroups(n=5each):controlgroup(Con),diabetesgroup(Model),ZiBuPiYingroup(ZBPYR),BuZhongYiQigroup(BZYQ)andLiuWeiDiHuanggroup(LWDH).DCFHandJC-1labelingwereusedtotesttheROS35levelandmitochondriamembranepotentialinhippocampusofSDrats.Westernblotanalysiswasusedtoobservetheexpressionofcytochromec(CytoC)innucleusandcytosol.Results:1.TheROSofZBPYRandBZYQwasdecreasedcomparedwiththeModelgroup,whilethegroupofLWDHhasnosignificance;2.ThelevelsofmitochondriamembranepotentialinZBPYRandBZYQgroupwereincreasedthantheModelgroup(P<0.05),whiletheLWDHgrouphasnosignificance;3.The40expressionofCytoCincytosoloftheZBPYRandLWDHgroupswassignificantlylowerthantheZBPYRgroups(P<0.01),whilethegroupsofBZYQhavenosignificance;4.TheexpressionofCytoCinnucleusoftheZBPYR,BZYQandLWDHgroupswassignificantlyhigherthantheZBPYRgroups(P<0.01).Conclusion:TheimprovementinthelevelsofROSandthemitochondrialmembranepotential,andtheinhibitionofthereleaseofCytoCfromcytoplasmafterZBPYRtreatment基金项目：基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（优先发展领域）（20132105130001）作者简介：孙铮（1983），女，讲师，博士硕士生，中西医结合防治神经系统疾病的基础与临床、中药单体抗肿瘤方向研究通信联系人：战丽彬（1964），女，教授，博导，中西医结合防治老年脑病的基础与临床研究，中医藏象学说脾本质及其应用的研究.E-mail:zlbnj@njucm.edu.cn-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn45mightbeassociatedwiththefunctionofmitochondria.Bytakingtheeffectofthetest,wefurthermakesurethatthemaincauseofcognitivedysfunctionindiabeticratswasspleenQiandYindeficiency.Keywords:ZibuPiyinRecipe;YiqiJianpiRecipe;ZibuShenyinRecipe;Diabetesassociatedcognitivedecline;Mitochondrialfunction50糖尿病相关认知下降（diabetes-associatedcognitivedecline，DACD）或称糖尿病认知功能障碍是糖尿病中枢神经系统并发症之一，其临床表现为轻、中度认知功能障碍，学习和记[1]忆能力下降，甚至导致阿尔茨海默病。近年来随着糖尿病发病率持续提高，DACD的预防55和治疗成为亟待解决的医学和社会问题。临床数据显示许多DACD患者在出现神经元丢失、认知功能减退等发病症状早期，与认知相关的大脑顶颞叶皮层和海马糖代谢已出现异常，氧[2]化磷酸化系统紊乱。线粒体是糖代谢和氧化磷酸化的主要场所，当线粒体发生功能障碍时，其对脑组织影响尤为明显。因为大脑虽然重量仅占身体总重的2%，但对能量的依赖性最强。由此推测线粒体功能障碍、能量代谢异常可能是糖尿病神经退行性病变发生的早期病理现60象。因此研发以调控线粒体功能为靶点的药物，可为治疗DACD提供新的思路和视野。滋补脾阴方药（ZBPYR）源于清代著名医家吴澄《不居集》中的资成汤，经战丽彬教授结合多年临床经验化裁而成，全方以培补后天、滋补脾阴为原则。20余年来，课题组研究发现滋补脾阴方药能够显著改善老龄及痴呆大鼠的学习记忆能力，其机制包括抗氧化和调[3，4]节能量代谢，减缓神经元丢失等。既往研究还发现滋补脾阴方药保护谷氨酸诱导神经病65变，改善DACD大鼠学习和记忆能力[5]，但ZBPYR对DACD模型鼠大脑线粒体功能的潜在作用尚不清楚。本研究以高脂饲料喂养联合小剂量链脲佐菌素（STZ）注射建立DACD模型，将滋补脾阴方药与健脾益气的代表方药补中益气汤、滋补肾阴的代表方药六味地黄汤进行比较，研究ZBPYR对DACD大鼠海马区线粒体功能障碍作用及其相关机制。1.材料与方法701.1动物与分组SPF级SD大鼠，成年雄性50只，体重（200±20）g，由大连医科大学动物中心提供（许可证号：SCXK（辽）2008—0002）。SPF级环境饲养，温度（22±3）℃，湿度50%，自由饮水，明暗交替12h。大鼠适应性喂养3d后，随机分为空白对照组（Con组）、糖尿病组（DM组）、滋补脾阴方药治疗组（ZBPYR组）、补中益气汤治疗组（BZYQ组）和六味75地黄汤治疗组（LWDH组）5组，每组5只。1.2药物滋补脾阴方药（红参30g，山药15g，茯神15g、白芍15g、丹参12g、扁豆15g、莲肉20g、石菖蒲10g、远志10g、檀香4.5g、橘红9g、甘草9g）、补中益气汤（黄芪18g、人参9g、白术9g、炙甘草6g、升麻3g、柴胡3g、当归9g、陈皮6g）和六味地黄汤（熟地24g、80山萸肉12g、山药12g、茯苓9g、泽泻9g、丹皮9g）由大连同仁堂药房提供。参照动物与人体的体表面积折算系数，计算大鼠等效剂量为滋补脾阴方药0.912/kg/日，补中益气汤0.42g/kg日，六味地黄汤0.5g/kg/日。常规水煎，过滤后4℃保存备用。-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn1.3试剂与仪器85线粒体提取试剂盒购自Abcam公司；BCA蛋白定量试剂盒购自康为世纪公司；线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）购自碧云天生物技术研究所；线粒体活性氧检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；CytoC抗体购自Abcam公司。普通饲料：按照中华人民共和国《实验动物小鼠大鼠配合饲料》（GB14924.3-2001）进行配制生产，购自南京安立默科技有限公[5]司。高脂饲料：参照ShiX的配方，购自南京安立默科技有限公司。冷冻切片机，Leica90公司；台式高速离心机，Thermo公司；多功能酶标仪，MolecularDevices公司；Morris水迷宫，NOLDUS公司；微量核酸蛋白定量仪，NanoVne公司；垂直电泳仪，GE公司；凝胶成像系统，UVP公司。1.4造模及模型评估方法采用高脂饲料联合小剂量链脲佐菌素注射建立2型糖尿病模型，并给予ZBPYR、BZYQ、[5]95LWDH干预7周后进行行为学测试，然后处死取材。1.5线粒体提取海马组织线粒体提取方法参考Abcammitochondrialisolationkit试剂盒。BCA法测定线粒体悬液的蛋白浓度。1.6线粒体膜电位（△Ψm）100检测90μl5倍稀释的JC-1染色工作液中加入10μl蛋白浓度0.5μg/μl纯化的线粒体并混匀。检测JC-1单体（绿色荧光）采用490nm波长激发，测定530nm的发射光强度。检测JC-1聚合物（红色荧光）采用525nm波长激发，测定590nm的发射光强度。计算红绿荧光的相对比值衡量线粒体膜电位的高低。1.7线粒体活性氧检测105190μl蛋白浓度0.5μg/μl纯化的线粒体加入10μl的1mmol/LDCFH-DA工作液充分混匀，37℃孵育30min，485nm波长激发，测定525nm的发射光强度。1.8WesternBlot方法检测蛋白表达变化将制备好的蛋白样品加入10%及12%的凝胶中电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭2h，加入一抗（1:1000），4℃过夜。TBST洗膜，10min×3，加入二抗（1:5000），TBST洗膜，10min×3，110ECL发光显影。1.9统计学方法—所有数据采用X±s表示。实验结果采用SPSS13.0软件处理。多组间均数比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。2.结果1152.1大鼠海马线粒体膜电位变化见表1。ZBPYR组和BZYQ组海马线粒体膜电位高于Model组（P<0.05），LWDH组-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn线粒体膜电位与Model组相比无统计学意义。2.2各组大鼠海马线粒体活性氧变化见表1。ZBPYR组的活性氧含量低于Model组（P<0.05），BZYQ组和LWDH组活性120氧含量与Model组相比无统计学意义。—表1大鼠海马线粒体线粒体膜电位及活性氧水平比较（X±s）组别n线粒体膜电位活性氧含量Con52.13±0.1838.67±11.92Model51.11±0.02##67.12±24.08#ZBPYR51.35±0.13#*52.37±16.16#*BZYQ51.55±0.08#*65.10±21.10####LWDH51.15±0.0860.28±18.65###*注：P<0.05VS.Con;P<0.01VS.Con；P<0.05VS.Model2.3各组大鼠海马线粒体蛋白中CytoC在胞浆/胞核中的表达比较（图1）ZBPYR组组与Model组比较，海马胞核中CytoC蛋白表达水平增高（P＜0.05）；BZYQ125和LWDH组与Model组比较，无明显统计学差异。ZBPYR组、LWDH组与Model组比较，海马胞浆中CytoC蛋白表达水平减低（P＜0.01）；BZYQ组与Model组比较，无明显统计学差异。130135图1.各组大鼠海马胞核/胞浆中CytoC蛋白表达水平的比较##**注：A.WesternBlot电泳结果；B.各组大鼠CytoC平均IOD值。P<0.01VS.Con，P<0.05VS.Model-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn1403.讨论线粒体是细胞内氧化磷酸化与能量产生的主要场所。当细胞处于正常代谢状态时，线粒体产生适度的活性氧，通过氧化还原调控蛋白酪氨酸磷酸化和胰岛素受体来提高胰岛素敏感[6]性。当细胞活性氧过量产生时，电子传递链及氧化磷酸化受损，线粒体膜电位发生改变，引发线粒体内环境改变，同时参与电子传递和质子梯度建立的线粒体内膜标志酶cytochrome[7]145c向胞浆中大量释放，导致线粒体ATP合成受阻，引发胰岛素抵抗。2型糖尿病，其特点是胰岛素应答组织发生胰岛素抵抗或细胞胰岛素分泌不足，通常还[8]常伴有高血压、脂代谢紊乱、心血管疾病及神经退行性疾病发生。糖尿病相关认知下降(diabetes-associatedcognitivedecline，DACD)，临床表现为逐渐出现的认知功能下降，是糖尿病在脑部的一种慢性进展性并发症。从中医角度，糖尿病认知功能障碍的临床表现，本病150应归属消渴病合并健忘或呆病的范畴，并且在一些中医古籍中有关消渴病的兼症中亦有所认识。《圣济总录》中就已有“消渴日久，健忘怔忡”的症状记载。消渴病机以阴虚为本，治疗[9]思路有从益气健脾入手，临床上应用补中益气汤加味治疗；有从肾虚论者，认为肾虚精亏[10]是发病之本，多采用六味地黄丸治疗；还有认为脾为太阴，乃三阴之长，故治疗阴虚当[11-12]以滋养脾阴为主。ZBPYR全方以培补后天、滋补脾阴为立方原则，既能滋补脾阴而不155滞腻，又兼化痰通瘀、安神益智，是针对糖尿病认知损伤中的脾阴虚损、痰瘀阻窍病机治疗的良好方剂。本研究通过采用滋补脾阴法干预糖尿病认知功能障碍大鼠，同时与补中益气法和滋补肾阴法进行比较，探讨滋补脾阴法干预糖尿病认知功能障碍的线粒体相关机制。实验结果显示，DACD大鼠海马线粒体活性氧含量增加，线粒体膜电位明显降低，胞核内CytoC降低而胞浆中CytoC水平增加，表明DACD大鼠海马线粒体功能出现紊乱。160ZBPYR组较其他补益类方药干预组表现出明显的活性氧降低，线粒体膜电位水平升高，CytoC在胞浆中表达水平降低而胞核内表达水平增多。提示海马线粒体功能紊乱与DACD密切相关，ZBPYR较BZYQ、LWDH药物能有效改善海马组织线粒体功能障碍，恢复海马神经元细胞能量代谢水平，提高认知功能，综上可能是ZBPYR治疗DACD的重要作用机制。165[参考文献](References)[1]SheenYJ,SheuWH,etal.Associationbetweenhypoglycemiaanddementiainpatientswithtype2diabetes.DiabetesResClinPract.2016;116:279-87.[2]PugazhenthiS1,QinL2,ReddyPH3,etal.Commonneurodegenerativepathwaysinobesity,diabetes,andAlzheimer"sdisease.BiochimBiophysActa.2016.pii:S0925-4439(16)30097-7.170[3]曲明阳,战丽彬.滋补脾阴方药对衰老大鼠学习记忆能力的影响及脑内机制.中药药理与临床,2002,18(6):32-35.[4]战丽彬,徐枫,董玉宽,等.滋补脾阴方药对老龄大鼠脑线粒体膜ATP酶活性的影响.中药药理与临床,2000,1:24-25[5]ShiX,LuXG,ZhanLB,etal.TheeffectsoftheChinesemedicineZibuPiYinRecipeonthehippocampusin175aratmodelofdiabetes-associatedcognitivedecline:aproteomicanalysis.Diabetoloiga,2011;54:1888-1899[6]Elevatedriskoftype2diabetesfordevelopmentofAlzheimerdisease:akeyroleforoxidativestressinbrain.BiochimBiophysActa,2014,1842(9):1693-706[7]ZephyD,AhmadJ.Type2diabetesmellitus:Roleofmelatoninandoxidativestress.DiabetesMetabSyndr.2015;9(2):127-31.180[8]PetrovD,PedrósI,ArtiachG,SuredaFX,BarrosoE.High-fatdiet-inducedderegulationofhippocampalinsulinsignalingandmitochondrialhomeostasisdeficiencescontributetoAlzheimerdiseasepathologyinrodents.BiochimBiophysActa.2015;1852(9):1687-99.[9]尹冰,都群,李杭,李吉彦.异病同治—补中益气汤的临床应用举隅.中医临床研究.2015;7(34):31-32.[10]杜亚明,李祥华,张家均.六味地黄丸对2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗的影响.中药药理与临床.2012;18528(6):6-9.-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn[11]梁丽娜,战丽彬,胡守玉.糖尿病脾阴虚大鼠下丘脑内质网应激及滋补脾阴方药调节作用研究.糖尿病脾阴虚大鼠下丘脑内质网应激及滋补脾阴方药调节作用研究.2015;38(8):519-523.[12]孙铮,姜如娇,战丽彬，滋补脾阴方药对糖尿病认知功能障碍大鼠皮质线粒体功能障碍预防作用机制.世界科学技术—中医药现代化.2015;18(8):1639-1645.190-6-'