外周血内皮祖细胞纯化与细胞鉴定.pdf 11页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn#外周血内皮祖细胞纯化与细胞鉴定111231**赵娴，魏韩笑，周箐竹，李杉，王松梅，刘流（1.昆明医科大学第一附属医院；52.云南大学生命科学学院；3.昆明医科大学公共卫生学院）摘要：目的：提取纯化来源于机体本身具有优异新生血管及管腔形成能力的自体外周血内皮祖细胞（EndothelialProgenitorCell），为组织工程血管化的研究提供优质的、取材方10便的、血管化能力强的种子细胞。方法：抽取新西兰大耳白兔外周血，采用密度梯度离心法加贴壁法，提取纯化自体外周血内皮祖细胞，取第三代细胞进行免疫荧光染色检测贴壁细胞CD34、CD133、vWF表面标志，及免疫双标染色鉴定内皮组细胞。结果：抽取的外周血用密度梯度离心法、贴壁培养法提取纯化并进行扩增，获得高纯度的EPCs，第三代外周血EPCs抗原CD34、CD133、vWF免疫荧光鉴定均为阳性；EPCs的免疫双标染色鉴定也证实，经过同15时摄取乙酰化低密度脂蛋白以及荆豆凝集素的免疫荧光复合染色，分离培养的细胞为血管内皮祖细胞。结论：兔外周血经密度梯度离心分离及贴壁法纯化，可获得纯度较高的内皮组细胞。关键词：基础医学；外周血；内皮祖细胞；细胞纯化；免疫双标染色中图分类号：请查阅《中国图书馆分类法》20ThePurificationandIdentificationofEPCsDerivedfromPeripheralBlood111231ZhaoXian,WeiHanxiao,ZhouQingzhu,LiShan,WangSongmei,LiuLiu(1.TheFirstAffiliatedHospitalofKummingMedicalUniverstiy;252.TheLifeScienceofYunnanUniversity;3.ThePublicandHealthCollegeofKummingMedicalUniversity)Abstract:Aim：TheEndothelialProgenitorCellsderivedfromperipheralbloodwithexcellentablityofvascularizationwereisolatedandpurified,toapplyhighqualityandeasilybeobtainedseedcellsfortissueengineeringvascularization.Method:Endothelialprogenitorcells(EPCs)wereisolatedfrom30rabbitperipheralbloodandculturedinEndothelialcellmedium(EGM).TheexpressionofCD34,CD133,vWFonthethirdgenerationadherentcellsweredetectedwithimmunofluorescentstaining;(2)Bonemarrowstemcells(BMSCs)wereisolatedfromrabbitbonemarrowbloodandculturedinmediumadded1%fetalbovineserum.TheexpressionofCD29,CD34,CD90onthethirdgenerationadherentcellsweredetectedwithimmunofluorescentstaining,andCellmorphologicalchangesandthe35EPCstubecavitystructurewereobservedundermicroscope.Result:HigherpurityEPCscouldbeisolatedwithFicoll.TheCD34、CD133andvWFofperipheralbloodderivedendothelialprogenitorcellswerepositivewithimmunofluorescentstainingonweek3weeks,andDiIlabeledacetyllowdensitylipoproteincholesterolandfluoresceinlabeledlectinimmunofluorescencedoublestainingwerepositive,whichwereconsistentwiththeEPCscharacteristic.Conclusion:EPCsisolatedfromperipheral40bloodwithFicolldensitygradientcentrifugationwerehighlypurified.Keywords:FoundationMedicine;PeripheralBlood;EpithelialProgenitorCell;CellPurification;Doubleindirectimmunohistochemistry基金项目：博士点博导基金（20135317110002）；国家自然科学基金（81460296）；云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项基金（2014FB026）；云南省医疗卫生单位内设研究机构科研项目基金（2014NS154）作者简介：赵娴（1981-），女，讲师，硕导，主要研究方向：组织工程血管化通信联系人：刘流（1957-），男，教授，博导，主要研究方向：骨组织工程.E-mail:liuliu3939@126.com-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn450引言构建组织工程材料修复机体组织缺损时，迅速血管化是核心问题。血管内皮祖细胞（EndothelialProgenitorCells，EPCs）是干细胞分支，是血管内皮细胞的前体细胞，亦称为成血管细胞(angioblast),受到生理状态改变或病理疾病因素刺激时,可从外周血动员到损伤血管部位进行修复，为血液供应不良的多种疾病的50治疗研究提供了新思路。近年来，EPCs生物学特性和治疗作用的研究成为这一领域新的热点。作为一种高度活性的干细胞，内皮祖细胞在扩增到三十代仍然有很好的扩增效率和细胞活性，远远超过仅能在传代第八代后细胞活性逐渐下降的血管内皮细胞，因此，未来外周血来源、脐带血来源或骨髓来源的EPCs对血管新生、细胞治疗中具有广泛的应用价值。55对于患者来说，外周血取材来源方便，操作性强。然而，实际操作中外周血中的EPCs含量极低，收获困难，因此必须通过体外纯化、扩增以获得足量的，可以应用于临床治疗EPCs。而目前国内外对外周血来源内皮祖细胞的分离、纯化报道较少。同时，课题组前期研究发现组织工程骨因血管化不良导致成骨效率低，甚至引发坏死、吸收，不仅使骨缺损修复失败，坏死物更可对机体产生不良60损伤，严重阻碍了组织工程骨进入临床研究及运用。因此，构建组织相容性好，血管化良好的组织工程修复材料，是组织工程材料进行临床修复应用的关键。本研究拟采取自外周血，应用密度梯度离心法对EPCs进行分离提取，同时应用贴壁法对内皮祖细胞进行纯化，在体外培养扩增后，采用免疫荧光染色及免疫组织化学双标染色鉴定细胞，为提取纯度较高的外周血内皮祖细胞应用于组织65工程血管化及组织工程移植物存活提供基础支持。1材料1.1实验动物新西兰大耳白兔12只，雌雄不限，由昆明医学院动物科提供，中心实验室进行饲养，对动物的处置根据科技部2006年发布的《关于善待实验动物的指导性意70见》规定执行。-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn1.2材料和仪器ECM（Hyclone），胎牛血清（HyClone），0.25%胰酶+0.02%EDTA液（Sigma），兔淋巴细胞分离液（华精生物），RabbitAnti-CD34RabbitAnti-CD29，RabbitAnti-CD133Rabbit,Anti-vWF,RabbitAnti-75IntegrinAlpha3+Beta1(北京博奥森),Goatanti-RabbitIgG(Jackson),CD34PERCP(Santacruz),CD45FITCBD,CD29PEBD(Pharmigen)，荧光素标记乙酰低密度脂蛋白（DiI-acLDL）（Solarbio），荧光素标记荆豆凝集素-1（FITC-UEA-1）（Vector）等。2方法802.1EPCs分离纯化与培养扩增2.1.1EPCs的分离与纯化水合氯醛2ml/kg腹腔麻醉新西兰大耳白兔，碘伏消毒耳背，无菌条件下采集每只兔子肝素抗凝的外周血约5ml，与PBS按1:1混匀，按照4：1比例与0.5％甲基纤维素混匀，室温静置30min沉降红细胞；吸取上清，缓慢叠加到兔淋巴细胞85分离液上层，2000转离心30分钟；取界面层，加入PBS重悬，1500转离心10分钟2洗涤两次；加入4mLECM培养基，吹打均匀后加入1个底面积为25cm的培养瓶中，置37℃，5％CO2饱和湿度培养。当原代细胞融合并覆盖瓶底70%以上时，用0.25%胰蛋白酶与0.01%的EDTA消化，按1:2传代培养。2.1.2EPCs的培养和扩增90显微镜下观察，待细胞密度达到80%以上时，吸掉EPCs培养瓶内的培养液。2+2+吸取适量的无Ca、Mg的PBS,轻轻把贴壁的细胞洗两遍。加0.25%胰蛋白酶/EDTA0.5mL，室温下消化1min，边消化边观察。细胞消化完毕,加适量含胎牛血清（fetalbovineserum,FBS）的培养液终止消化,吹打细胞,制成均匀的细胞悬液。加适量的培养液,分装到两个新的T25培养瓶中。置于37℃、5%CO295培养箱中继续培养。-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn2.2血管内皮细胞表面标记鉴定：2.2.1应用免疫荧光法检测细胞表面标记表达运用免疫荧光染色法对第三代贴壁细胞的表面抗原CD34、CD133、vWF表达情况进行检测：吸弃六孔培养板内每一孔培养基，贴壁细胞PBS洗两遍，5分钟100/遍，4%多聚甲醛固定2小时，干燥一小时，2％血清白蛋白（BSA）孵育标本30min，分别加入不同Ⅰ抗室温孵育过夜，PBS洗三遍（5分钟/遍），避光条件下分别滴加适量山羊抗兔IgG（H+L）Ⅱ抗，湿盆中37℃孵育1小时，PBS洗三遍（5分钟/次），DAPI(4",6-二脒基-2-苯基吲哚4",6-diamidino-2-phenylindole)染核1min﹐PBS洗三遍（5分钟/次）50％缓105冲甘油封片，荧光显微镜下观察摄片。2.2.2EPCs的免疫双标染色鉴定3原代EPCs培养至第三代时，将细胞以5×10个/mL的细胞密度接种于24孔板上，倒置显微镜下观察细胞形态良好，增殖活跃。在避光条件下，加入2.4µg/mLDiI-acLDL，37℃孵育1小时后放入PBS冲洗，重复两次冲洗过程。用2%110多聚甲醛对细胞进行固定10min，PBS浸洗3遍，加入10µg/mLFITC-UEA-I，37℃下孵育1h后PBS冲洗。使用荧光倒置显微镜对目标细胞DiI-acLDL与FITC-UEA-1双重染色进行观察。3结果3.1外周血内皮祖细胞的分离纯化及培养传代1153.1.1外周血内皮祖细胞的分离纯化倒置相差显微镜下：第3天见早期外周血内皮祖细胞贴壁，第9天见少量晚期内皮祖细胞贴壁，第14天血管内皮祖细胞呈现鹅卵石样形态，形成大小不同的细胞集落；培养21天左右（图1-4）细胞形成细胞集落或连接成片。-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn120图1原代外周血EPCs培养3天(LM×400)图2原代外周血EPCs培养9天(LM×400)Fig.1PrimaryperipheralbloodderivedEPCsFig.2PrimaryperipheralbloodderivedEPCswerecultured3d(LM×400)werecultured7d(LM×400)125图3原代外周血EPCs培养14天(LM×100)图4原代外周血EPCs培养21天(LM×100)Fig.3PrimaryperipheralbloodderivedEPCsFig.4PrimaryperipheralbloodderivedEPCswerecultured14d(LM×400)werecultured21d(LM×400)3.1.2外周血内皮祖细胞的培养与扩增130第三代外周血内皮组细胞漩涡状生长，形态呈多样化，有梭形和多角形混合生长，梭形多见。细胞活性好，平均传代时间3-5天（图5，6）。-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图5，6.第三代外周血内皮祖细胞Fig.5，6ThethirdgenerationofperipheralbloodderivedEPCs1353.2外周血内皮祖细胞细胞鉴定3.2.1免疫荧光染色检测：第三代外周血内皮祖细胞单个核细胞表面抗原CD34、CD133、vWF染色均呈阳性（图7-12），大量红色颗粒出现在细胞质内，胞核被染成明亮的蓝色；140图7，8第三代外周血EPCs免疫荧光检测CD34(LM×100)Fig.7，8TheimmuoflurescensedetectionofCD34ofthirdgenerationperipheralbloodderivedEPCs(LM×100)145图9，10第三代外周血EPCs免疫荧光检测CD133(LM×100)Fig.9，10TheimmuoflurescensedetectionofCD133ofthirdgenerationperipheralbloodderivedEPCs(LM×100)-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn150图11，12第三代外周血EPCs免疫荧光检测vWF(LM×100)Fig.11，12TheimmuoflurescensedetectionofCDvWFofthirdgenerationperipheralbloodderivedEPCs(LM×100)1553.2.2免疫双标染色鉴定经过同时摄取乙酰化低密度脂蛋白以及荆豆凝集素的免疫荧光复合染色，证实分离培养的细胞为血管内皮祖细胞。在荧光显微镜下观察发现：细胞摄取DiI-acLDL后为红色荧光，细胞与FITC-UEA-1结合后为绿色荧光，重合后细160胞表现为黄色免疫双荧光阳性（图13-16）。.图13EPCs摄取DiI-acLDL后显示红色荧光图14EPCs摄取FITC-UEA-1后显示绿色荧光Fig.13EPCswereconfirmedbytheDiI–acLDLFig.14EPCswereconfirmedbytheUEA-1lectinbindinguptake165-7- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图15EPCs双标染色重合后呈现黄色免疫双荧光图16EPCs免疫双荧光和细胞核蓝染重合显示为三重荧光显色Fig.15EPCspresentedyellowofdoubleFig.16EPCspresentedtriplefluorescencolor170fluorescentcolorcausedbynuclearstaining4讨论内皮祖细胞(gndothelialProgenitorcellS，EPCs)是血管内皮细胞的前体细胞，亦称血管母细胞。近年来EPCs在血管发生、心血管疾病、脑血管意外和修复重建机体缺损等方面的作用受到了研究人员的广泛重视，EPCs同时参与出175生后的血管新生过程和胚胎血管的形成发育，EPCs参与的组织工程材料的应用逐渐成为改善心脑血管病变患者的血液供应及防治移植物缺血坏死的新方法,具有良好的临床应用前景。在胚胎形成初期，中胚层的间充质细胞包含血岛，血岛中央细胞形成造血干[1]细胞，外周则分化为血管内皮祖细胞。这种细胞在离体的情况下，经诱导培养180分化成内皮细胞，同时增殖能力较高。研究发现，内皮损伤导致内皮祖细胞的迁移和聚集，提高内皮祖细胞的增殖和分化潜能，同时促进血管形成。EPCs也属[2][3]于干细胞，可以从骨髓、外周血、脐静脉血、脾脏等组织中提取。分离鉴定的外周血内皮祖细胞在出生后血管新生过程中有很强的促血管生成作用，并且以[4,5]血管发生方式形成机体新生血管，运用此机制可治疗多种缺血性疾病、预防[6]185血管再狭窄、促进血管创伤愈合等，EPCs同时参与了多种机体器官损伤后的血-8- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn[7]管再生与修复。Asahara等在1997年首先报道在外周血液中存在一类干细胞，它能分化形成血管内皮细胞，他们给这种前体细胞命名为“血管内皮祖细胞”，随着研究的不断深入，研究人员发现脐带血和骨髓液中同样也存在EPCs，含量比外周血多得多。但骨髓中分离的EPCs往往混杂其他细胞导致纯度不高、需要190人为诱导，脐带血获取困难。而人外周血取材便利、用量易于控制以及纯度高等特点，使外周血EPCs的未来应用前景优于其他来源EPCs。同时，按照目前的研究进展，可以根据以下几方面来判断目标细胞是否为EPCs：（1）良好自我增殖分化能力；（2）分化后的细胞表面表达内皮细胞系典型标志；（3）具有分化成为新生血管潜能；（4）分化出新生血管和再生的血管195内皮与正常血管和相应血管组织的内皮生理功能相同。二外周血内皮祖细胞的提取、纯化及扩增成年机体中的EPCs在生理状态下存在于骨髓液内，而在外周血中含量较低，临床上对体外分离EPCs方法种类相对多，其中包括密度梯度离心法和免疫磁珠[8]分选法等。免疫磁珠分选法早期采用CD34或CD133抗体，但是EPCs特异性200的表面标志物不明确，同时流式细胞分选各方面限制较多，价格昂贵，且造成一定的细胞损失，目前尚难以推广。密度梯度离心法操作简单，使用方便，但分离的特异性不强，不仅分离出血液中整个单核细胞群，同时时掺杂一定数量的血小板、成纤维细胞等。为增加可应用于实验与临床的EPCs的数量，本实验采集外周血液，运用密度梯度离心法结合贴壁法提取纯化EPCs，用含胎牛血清的ECM205培养基进行培养。本研究结果显示，混杂细胞由于其悬浮在液体中，通过换液逐渐被去除，贴壁细胞在ECM培养基中迅速增殖，形成大小不等的细胞集落，其活性良好，多次传代后细胞增殖率没有明显衰减。目前，仍然要通过表面标志物检测对EPCs进行鉴定，CD34、CDl33、vWF是重要的识别EPCs的表型特征，同时具备以上表[9]210型特征的细胞才能确认为EPCs。CD34是造血干细胞的重要标志，在胚胎早期血管就有表达，外周血中分离出的CD34阳性细胞在体外能够向内皮细胞分化，[10]在体内能够参与新生血管形成，因此常被用作识别EPCs的重要标志。近年来，更多研究表明，CDl33能表达于EPCs上，是比CD34更有价值的EPCs表面标志，而且CDl33在EPCs的分化过程中迅速下调，成熟内皮细胞则无表达，这使越来215越多的学者乐于采用CDl33来分离EPCs，并成为排除成熟内皮细胞的EPCs的细-9- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn[11]胞标记，进而成为分离EPCs的最常用细胞表面标志。在二十世纪初通过研究，认为EPCs表面分布着大量的CD34、CD133、VEGFR2等标志物，能够同时摄取荆[12，13][14]豆凝集素和乙酰化低密度脂蛋白且形成管状结构的的一类单核细胞。针对外周血取材方便，我们在本实验采集外周血液，运用密度梯度离心法结220合贴壁法提取纯化EPCs，对培养第三代的贴壁细胞进行免疫荧光检测。结果显示，培养细胞的CD34、CDl33、vWF因子的几项检测指标在试验组均呈阳性，表明分离提取的EPCs纯度较高，同时通过EPCs的免疫双标染色鉴定，得到同时摄[15，16]取荆豆凝集素和乙酰化低密度脂蛋白的EPCs。获取了组织工程修复材料优质的血管化种子细胞。2255结论本研究采取新西兰大耳白兔外周血，运用运用密度梯度离心法结合贴壁法提取纯化EPCs，通过免疫荧光检测，获得表达CD34、CDl33、vWF因子的高纯度EPCs，同时通过免疫双标染色鉴定，对EPCs进一步鉴定。表明外周血采用Ficoll密度梯度法结合贴壁培养法分离、提纯细胞并进行体外扩增，可获得足量高纯度EPCs，230为组织工程血管化及组织工程材料血管化的研究及应用提供了来源丰富、对取材者创伤小、成血管化能力优良的种子细胞[参考文献](References)[1]SudaT,TakakuraN,OikeY.Hematopoiesisangiogenesis.IntJHematol2000,71(2):99-107[2]ReyesM,DudekA,JahagirdarB,KoodieL,MarkerPH,VerfaillieCM.Originofendothelialprogenitorsin235humanpostnatalbonemarrow.JournalofClinicalInvestigation,2002,109(3)337-382.[3]BruntKR,HallS,WardCA,MeloLG.Endothelialprogenitorcellandmesenchymalstemcellisolation,characterization,viraltransduction.MethodsMolMed.2007,139:197-210[4]kawanotoA,GwonHC,IwaguroH,etal.Therapeuticpotentialofexvivoexpandedendothelialprogenitorcellsformyocardialischemia.Circulation,2001,103(5):634-637240[5]ZhangZG,LiZ,QuanJ,etal.Bonemarrowderivedprogenitorcellsparitcipateincerebralneovascularizationafterfocalcerebralischemiaintheadultmouse.CirResearch,2002,90(3):284-288[6]BrendanD,PatM,NoelM.C.EndothelialProgenitorCells.Endothelium,2006,13(6):403-410.[7]AsaharaT,MumharaT,SuilivanA,etal.Isolationofputativeprogenitorendothelialcellsforangiogenesis.Science,1997,275(5302):964-967.245[8]TepperOM,CaplaJM,GalianoRD.Adultvasculogenesisoccursthroughinsiturecruitment,proliferation,andtubulizationofcirculatingbonemarrow-derivedcells.Blood.2005,150(3):1068-1077[9]LiuP,ZhouB,GuD,etal.Endothelialprogenitorcelltherapyinatherosclerosis:adouble-edgedsword.AgeingResRev,2009,8(2):83-93.[10]DevanesanAJ,LaughinnKA,GimHR,etal.Endothelialprogenitorcellsastherapeuticoptioninperipheral250arterialdisease.EurJVascEndovascSurg,2009,38(4):478-481.[11]FadiniGP,CoracinaA,BaessoL,etal.PeripheralbloodCD34+endothelialprogenitorcellsaredeterminantsofsubclinicalatherosclerosisinamiddleagedgeneralpopulation.Stroke,2006,37(9):2277-2282.[12]SchattemanGC,DunnwaldM,JiaoC.Biologyofbonemarrow-derivedendothelialcellprecursors.AmericalJournalofPhysiology-HeartandCirculatory.Physiology.2007,292(1):H1-H18.255[13]PebayA,BonderCS,PitsonSM.Stemcellregulationbylysophospholipids.Prostaglandinsotherlipidmediat.2007,84(3-4):83-97.[14]BraberCL,Iruela-ArispeML.Theever-elusiveendothelialprogenitorcell:identities,functionsandclinical-10- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnimplications.Pediatricresearch,2006,59:26-32.[15]BenameurT,Tual-ChalotS,AndriantistohainaR,MartinezMC.PPARalphaisessentialformicroparticle-260induceddifferentiationofmousebonemarrow-derivedendothelialprogenitorcellsandangiogennesis.PlosOne.2010,5(8):e12392.[16]KogaM,SudoR,AbeY,YamamotoK,AndoJ,IkedaM.Contributionofratendothelialprogenitorcellsonthree-dimensionalnetworkformationinvitro.TissueEngPartA.2009,15:2727-2739.-11-'