鼎湖鳞伞菌丝体多糖免疫活性研究.pdf 12页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn#鼎湖鳞伞菌丝体多糖免疫活性研究**邱丽淳，甘聃，谢旻皓，武忠伟，万鹏，叶红，胡冰，曾晓雄（南京农业大学食品科技学院，南京210095）5摘要：药用真菌对人体健康具有多种积极作用，其中的多糖成分具有免疫调节活性。本实验采用DEAESepharoseFastFlow和SephadexG-100柱层析得到鼎湖鳞伞（PholiotadinghuensisBi）菌丝体多糖（PDP）的三个组分PDP-1、PDP-2和PDP-3。通过RAW264.7细胞实验研究了粗PDP及纯化组分PDP-1、PDP-2、PDP-3的体外免疫调节活性。结果显示在各个多糖10组分中，PDP-2和PDP-3表现出较好的体外免疫促进作用，有效地促进了RAW264.7细胞的增殖，并显著提高其吞噬中性红能力及酸性磷酸酶活性。采用环磷酰胺免疫抑制小鼠模型，探讨了PDP-2的体内免疫调节活性及其协同抗氧化作用。结果表明，PDP-2能明显提高环磷酰胺免疫抑制小鼠的脾脏指数、血清溶血素水平及血清、脾脏中的溶菌酶含量，还能协同增强小鼠肝脏中T-AOC、T-SOD、CAT和GSH-Px的酶活，降低MDA的水平。因此，PDP15具有一定的免疫调节活性。关键词：鼎湖鳞伞菌；多糖；免疫调节中图分类号：TS201.4StudyontheImmuneActivityofPholiotadinghuensisBi20myceliapolysaccharidesQIULichun,GANDan,XIEMinhao,WUZhongwei,WANPeng,YEHong,HUBing,ZENGXiaoxiong(CollegeofFoodScienceandTechnology,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China)25Abstract:Medicalmushroomshavepositiveeffectsonhumanhealth,andtheirpolysaccharidespossessimmunomodulatoryactivities.Inthepresentstudy,DEAESepharoseFastFlowandSephadexG-100columnchromatographywereutilizedtopurifythecrudepolysaccharidesfromPholiotadinghuensisBimycelia(PDP)toaffordthreefractionsofPDP-1,PDP-2andPDP-3.TheimmunomodulatorypotentialsinvitroofcrudePDPanditspurifiedfractionsonRAW264.7cellline30wereinvestigated.ThedataindicatedthatPDP-2andPDP-3couldsignificantlystimulatetheproliferationofmacrophages,enhancethecapabilityofmacrophagephagocytosisandincreasetheactivityofacidicphosphatase.Thecyclophosphamide-inducedimmunosuppressionmicemodelwasfurtherusedtoevaluatetheimmunomodulatoryactivityofPDP-2.ItwasfoundthatPDP-2couldincreasethespleenindex,hemolysinlevel,lysozymecontentandtheactivitiesofT-AOC,T-SOD,35CAT,GSH-Px,andreducetheMDAlevel.TheresultssuggestedthatPDPhadimmunomodulatoryactivities.Keywords:PholiotadinghuensisBi;polysaccharide;immunomodulatoryeffect0引言真菌多糖能够调节免疫系统，主要途径有通过激活淋巴细胞、巨噬细胞等活化效应免疫[1,2]40细胞，促进介导体液免疫的可溶性因子（抗体、补体及细胞因子）的生成等。其中T淋巴细胞主要介导特异性的细胞免疫应答，即Ⅳ型或迟发型超敏反应；体液免疫依赖于B淋巴细胞分泌多种抗体介导反应；巨噬细胞既可以通过吞噬病原体、清除异物等参与非特异性基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（20130097110021）作者简介：邱丽淳（1993-），女，硕士，主要研究方向：天然产物与活性通信联系人：曾晓雄（1964-），男，教授、博导，主要研究方向：糖生物学与糖生物工程，食品生物技术.E-mail:zengxx@njau.edu.cn-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn免疫作用，也可以通过处理、传递抗原等来发挥其特异性免疫效应。老年人由于免疫功能下降而导致身体衰老、发病甚至死亡率，免疫系统作为健康的指标[3]45和长寿的象征已被广泛认可。此外，免疫细胞功能有可能影响自由基之间的平衡和抗氧化[4,5]防御系统，即保护细胞不受氧化应激损伤的同时保持一个适当的免疫功能。药用蘑菇对人体健康有着积极的作用，因而在东方已流行了数千年，也逐渐被西方人所认同。经现代医学探究发现，蘑菇多糖具有相当广泛的生物学活性，包括免疫活性调节、抗[6]肿瘤、抗过敏、抗炎、抗氧化、降胆固醇、降血糖、保肝护肝、肠道益生等功能。鼎湖鳞[7-9]50伞菌（PholiotadinghuensisBi）是中国特有的一个品种，鼎湖鳞伞丝体多糖（PDP）值得更多的关注。目前研究发现，PDP的两个纯化组分PDP-2和PDP-3表现出显著的体外抗肿[10-12]瘤活性。大量研究证明，作为生物反应调节剂，蘑菇多糖主要是通过激活机体的免疫调[13,14]节系统来发挥其抗肿瘤作用。因此，本文采用体内外实验来探讨PDP的免疫调节活性。首先通过小鼠RAW264.7腹腔巨噬细胞的增殖实验来考察粗PDP及纯化组分PDP-1、PDP-2、55PDP-3的的体外免疫活性，进一步以环磷酰胺（Cy）建立免疫抑制小鼠模型，通过检测免疫器官指数、血清溶血素、溶菌酶（LZM）及相关抗氧化酶活探讨PDP-2的体内免疫调节活性及其协同抗氧化作用。1材料与方法1.1主要试剂60DMEM高糖培养基、新生牛血清、青霉素-链霉素，美国Gibco公司；脂多糖（LPS），美国Sigma公司；一氧化氮（NO）、LZM、总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（T-SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；噻唑蓝（MTT）、Cy、盐酸左旋咪唑，上海瑞永生物科技公司；2%绵羊红细胞，南京森贝伽生物科技有限公司；10%绵羊红细胞、豚鼠血清，北京博尔西65科技有限公司；其他试剂为国产分析纯。1.2PDP及其各组分的制备将鼎湖鳞伞菌接种于装有适量液体培养基中，置于摇床上培养10-15天（28℃，150r/min）后转接至发酵培养基（葡萄糖45g/L，酵母膏6g/L，KH2PO41.5g/L，MgSO40.5g/L，马铃薯100g/L，麦芽粉2.5g/L）中继续培养10天（28℃，120rpm），抽滤得到鼎湖鳞伞菌丝70体，离子水冲洗多次后冷冻干燥。菌丝体经研磨成粉后，按料液比1:10（w/v）加入去离子水，90℃条件下浸提3小时，过滤后重复提取，将两次收集的提取液合并，离心除杂后，真空浓缩再倒入3倍体积的无水乙醇，玻棒拌匀，4℃条件下静置12h，4000rpm离心20min，沉淀分别用适量的丙酮、乙醚溶液洗涤两次，用去离子水复溶后真空冷冻干燥，得到粗PDP。称取500mg粗PDP冻干样溶于20mL去离子水，4000rpm离心20min，取上层溶液75引入DEAESepharoseFastFlow层析柱(2.5×60cm)。以流速2.0mL/min分别用0、0.1、0.3和0.5MNaCl进行梯度洗脱，釆用硫酸-苯酚法测定各洗脱液的吸光值(490nm)，制作DEAE-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnSepharoseFastFlow层析洗脱曲线。根据洗脱曲线，将不同梯度洗脱得到含量较高的组分合并，减压蒸发后去离子水透析3d（每天换水两次），再次旋转蒸发浓缩，冷冻干燥，分别得到P1、P2和P3三个组分。该三个组分分别采用SephadexG-100柱层析(2.0×60cm)，以80去离子水为洗脱液，流速为0.5mL/min进行洗脱。在硫酸-苯酚法监测下收集多糖含量较高的洗脱液，真空冷冻干燥得三个纯化组分，依次为PDP-1，PDP-2及PDP-3。1.3PDP对RAW264.7增殖的影响[15]采用MTT法检测PDP对于RAW264.7腹腔巨噬细胞的增殖作用。RAW264.7细胞经活化后，将处于对数生长期状态时，接种至96孔板，接种量为100µL，细胞密度约为58510个/孔。将接种好的96孔板置于37±1℃，CO2浓度5%的细胞培养箱中培养12h后，弃上清，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）清洗以去除未贴壁生长的悬浮细胞。样品组加入100µL不同浓度（12.5,25,50,100,200µg/mL）PDP，空白组用100µL的DEME完全培养基来代替，而阳性对照组加入的则是10µg/mLLPS溶液100µL，于细胞培养箱中放置24h，弃上层清液，然后于各孔加入0.5mg/mLMTT溶液200µL再培养4h，弃上层清液，于各孔90中加入二甲基亚砜（DMSO）溶液150µL，以溶解蓝紫色的甲瓒结晶，在570nm处检测各孔的吸光值。细胞增殖指数具体的计算公式如下：RAW264.7增殖指数=Abs样品/Abs空白1.4吞噬中性红实验[16]RAW264.7细胞吞噬中性红实验参考Dai等报道的方法。RAW264.7细胞的种板及95样品处理同章节1.3。加样处理24h后，弃上层清液，并用PBS溶液清洗两次以去除未贴壁生长的悬浮细胞。每孔混入0.075%（w/v）中性红溶液100µL，在细胞培养箱中放置1h。弃上层清液，PBS溶液清洗多次以去除游离的中性红。每孔中加入100µL细胞裂解液（0.5M的50%乙醇溶液），于室温放置2h后，在540nm处检测各孔吸光值。细胞吞噬中性红指数的具体公式如下：100中性红吞噬指数=Abs样品/Abs空白1.5酸性磷酸酶实验[17]RAW264.7细胞酸性磷酸酶活性的检测参考Wang等报道的方法并作适当调整。RAW264.7细胞的种板及样品处理同上述章节。加样处理24h后，弃上清，于各孔内加入1%的TritonX-100溶液25µL及1mg/mL的150µL对硝基苯磷酸二钠盐（p-NPP）溶液，105于细胞培养箱反应1h后，加入3mg/mLNaOH溶液50µL终止反应，于405nm处测定各孔吸光值。细胞产生的酸性磷酸酶活性的具体公式如下：酸性磷酸酶指数=Abs样品/Abs空白1.6NO释放量的测定RAW264.7细胞的种板及样品处理同前。加入PDP处理24h后，吸取上层清液，按照-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn110ELISA试剂盒的操作说明检测NO的释放量。1.7PDP-2体内免疫调节活性研究6-8周龄SPF级BALB/c小鼠雌雄各占一半，体重均为20g左右，适应性饲养5天后，随机分成6组进行实验，期间为小鼠提供充足的水量和食物，严格控制环境温度和相对湿度，12h昼夜循环的生物节律。整个过程在南京医科大学的医药研究级别实验动物中心进行。具115体分组及给药情况如表1所示：表1动物实验设计Tab.1Animalexperimentaldesign组别腹腔注射样品及剂量（1-3天）注射成分及剂量（4-17天）GroupIntraperitonealinjectioningredientsandIntraperitonealinjectioningredientsanddose(1-3d)dose(4-17d)正常组等体积生理盐水Normal模型组80mg/kg·bw环磷酰胺等体积生理盐水Model阳性对照组同模型组10mg/kgbw盐酸左旋咪唑PositivePDP2-50同模型组50mg/kgbwPDP-2PDP2-100同模型组100mg/kgbwPDP-2PDP2-200同模型组200mg/kgbwPDP-2末次给药后24h，采用眼眶取血法收集小鼠的全血标本，室温静置4h后，4000rpm条件下离心15min，收集血清保存于-20℃。另外收集脾脏、胸腺及肝脏，保存备用。120每只小鼠在称量体重后，采用脱颈法处死后进行解剖，收集脾脏、胸腺，称取重量并记录，且与相应的体重一一对应。计算小鼠免疫器官指数（脾脏及胸腺）的具体公式如下：胸腺（脾脏）指数（mg/g）=胸腺（脾脏）重量/小鼠体重[16]血清溶血素（HC50）的测定参考文献。在给药处理的第10天，腹腔注射2%绵阳红细胞（SRBC）200µL以致敏。末次腹腔注射，小鼠停食不停水处理一天后，摘取眼球取血，125收集到的血清加入5倍的生理盐水；吸取200µL上述稀释液于离心管中，与100L的2%抗体混匀，置于冰水浴中5min后，再加入10%新鲜豚鼠血清200µL，震荡混匀，于37℃下孵化1h，马上置于冰水浴中，以终止反应，4000rpm离心10分钟，取上清，在540nm处检测各管吸光值。以生理盐水代替血清稀释液同法处理作为空白对照组。AbsSRBC（此时抗体数量达到SRBC半数溶血的状态）的测定:取1ml2%SRBC离心去上清，再以950µL130超纯水稀释沉淀，得到0.2%SRBC溶液。10分钟后，加入17%氯化钠溶液50µL。取50µL上述溶液，加入50µL2%绵阳红细胞和400L生理盐水。在4000rpm的转速下离心10分钟，然后吸取上清，于540nm处测定其吸光值。血清溶血素水平的计算公式如下：样品HC50=（Abs样品×血清稀释倍数）/AbsSRBC-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn溶菌酶活性检测按试剂盒说明书进行。称取脾脏置于研钵中，加入19倍的生理盐水，135冰水浴中碾碎，制成5%组织匀浆，在4℃、4000rpm的条件下离心10min后吸取上层清液，按照溶菌酶试剂盒的操作说明来检测脾脏组织中溶菌酶含量。取收集的血清同样按试剂盒操作说明来检测血清中的溶菌酶含量。称取一定量的肝脏置于研钵中，加入19倍的生理盐水，冰水浴中碾碎，制成5%（0.05g/mL）肝脏、心脏、肾脏组织匀浆，于4℃、4000rpm的条件下，离心10min后吸取上层140清液，分别按照总超氧化物歧化酶、丙二醛、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶和总抗氧化能力试剂盒的操作说明，测定肝脏匀浆中T-SOD、MDA、GSH-Px、CAT和T-AOC的水平。1.8统计分析实验结果数据表示为平均值（Mean）±标准差（SD）的形式，并用SPSS22软件中的单因素方差分析（One-wayANOVA）和Duncan多重比较进行显著性分析，P<0.05被认为145差异是显著，P<0.01认为差异极显著。2结果与讨论2.1体外免疫调节活性[18]免疫功效的发挥通过活化效应细胞来启动，如巨噬细胞。从图1可以看出，随着多糖浓度的增加（12.5-200.0g/mL），粗多糖和PDP-1组分的细胞增殖指数逐渐增加到一定150程度后又显著降低，而PDP-2和PDP-3组分则在低浓度时指数显著上升，整体表现出显著的RAW264.7细胞增殖效果。图1PDP-1、PDP-2、PDP-3和粗PDP对RAW264.7细胞增殖的作用*表示与空白对照组差异显著（P<0.05）,**则表示差异极显著（P<0.01）155Fig.1EffectsofPDP-1,PDP-2,PDP-3,crudePDPonRAW264.7cellproliferationinvitro.*meansP<0.05and**meansP<0.01comparedwithcontrol巨噬细胞的吞噬作用是免疫应答的重要步骤，其能力的强弱也是巨噬细胞活化的主要标-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn[19,20]志之一。从图2可以看出，随着多糖浓度的增加，粗多糖和PDP-1、PDP-2组分的细胞吞噬指数逐渐增加到一定程度后又有所降低，而PDP-3组分在浓度大于12g/mL时表160现出较好的细胞吞噬作用。图2PDP-1、PDP-2、PDP-3和粗PDP对RAW264.7细胞吞噬指数的影响*表示相比空白对照组差异显著（P<0.05）,**则表示差异极显著（P<0.01）Fig.2EffectsofPDP-1,PDP-2,PDP-3,crudePDPonphagocytosisindexofRAW264.7cellinvitro.*means165P<0.05and**meansP<0.01comparedwithcontrol作为一种标志酶，细胞组织分泌的酸性磷酸酶的活性变化与巨噬细胞被活化或抑制密切[21]相关。与空白对照相比，随着多糖浓度的增加，粗多糖和PDP-1、PDP-2组分的酸性磷酸酶活力指数逐渐增加到一定程度后又有所降低，但都能够显著提高RAW264.7细胞分泌的酸性磷酸酶活力指数，甚至超过LPS阳性对照组（如图3）。170图3PDP-1,PDP-2,PDP-3,crudePDP对RAW264.7细胞酸性磷酸酶活性的影响*表示差异显著（P<0.05）,**则表示差异极显著（P<0.01）-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnFig.4-3EffectsofPDP-1,PDP-2,PDP-3,crudePDPonacidphosphataseacivityofRAW264.7cellinvitro.*meansP<0.05and**meansP<0.01comparedwithcontrol175[22]经活化的巨噬细胞释放的NO，能够发挥杀伤靶细胞的效应，以参与机体的免疫反应。由图4可知，在剂量为12.5~200g/mL的范围内，随着多糖浓度的增加，PDP-3处理组RAW264.7细胞的NO生成量逐渐增加到一定程度后又略微降低，在100g/mL的剂量下达到最大值为108.42mol/L，已超过LPS(10.0g/mg)阳性对照组的NO生成量。180图4PDP-3组分对RAW264.7细胞NO释放量的影响。柱形图上标的不同字母表示各数据间具有显著性差异（P<0.05）Fig.4EffectsofPDP-3onproductionofNOofRAW264.7macrophagesinvitro.Meanvaluesinthesamecolumnwithdifferentlettersweresignificantlydifferent(Duncantest,p<0.05)1852.2PDP-2多糖组分的体内免疫调节活性T淋巴细胞是免疫系统的重要成员，主要介导特异性的细胞免疫应答，包括Ⅳ型、DTH反应（delayedtypehypersensitivity），而胸腺作为T淋巴细胞分化、成熟的主要场所，其退化标志着机体免疫系统的老化，表现为由胸腺退化导致的从中心到周围老化免疫系统退化的过程。而脾脏作为人体最大的免疫器官，可以为滤血、清除异物、免疫反应等提供场所。因[23]190此，胸腺和脾脏指数与免疫功能密切相关。Cy作为高效的免疫抑制剂，能够介导淋巴细胞百分比、外周血白细胞数目、巨噬细胞[24]吞噬作用、胸腺/脾脏指数、DTH反应中耳肿涨度等下降，常用于建立免疫抑制模型。表2PDP-2组分对小鼠体重以及胸腺、脾脏指数的影响Table2.EffectsofPDP-2onbodyweightandindexofthymus,spleeninmice组别体重(g)脾脏指数（mg/g）胸腺指数（mg/g）GroupBodyWeightIndexofSpleenIndexofThymus正常组22.7±2.565.76±0.63b1.64±0.29bNormal模型组20.93±3.34.76±0.37a1.14±0.19a-7- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnModel阳性对照组22.18±2.046.53±0.45b1.43±0.16abPositivePDP2-5021.96±2.557.63±0.89c1.21±0.33aPDP2-10021.48±2.099.3±0.64d1.37±0.33abPDP2-20021.24±2.38.99±0.46d1.15±0.22a195注：不同字母表示各数据间具有显著性差异(Duncantest,p<0.05).Differentlettersmeanssignificantlydifferentbetweenvalues(Duncantest,p<0.05).从表2可以看出，小鼠注射Cy后脾脏及胸腺指数均比正常组显著降低(p<0.05)，表明免疫抑制小鼠模型已成功建立。而PDP-2低中高剂量组的脾脏指数得到了显著提高。至于胸腺指数，除了腹腔注射100mg/kg/dPDP-2时有所提高，其它剂量组对它均无显著影响，200表明鼎湖鳞伞菌丝体多糖PDP-2组分能显著提高脾脏指数，却难以在短时间内恢复Cy导致的胸腺的免疫损伤。[25]体液免疫在宿主抗肿瘤免疫和感染中发挥关键作用。当外物入侵时，B淋巴细胞在抗原的刺激下，会分泌溶血素抗体至血清中。因此，溶血素抗体可作为可靠指标，准确地反映[26]体液免疫水平。本研究将SRBC作为抗原诱导B淋巴细胞释放血清溶血素，抗原抗体结205合后形成复合物，与补体接触后，SRBC溶解，进而检测抗体即溶血素的含量，可以反应出小鼠的体液免疫调节能力。如图5，注射Cy后，模型组小鼠血清溶血素HC50值比正常组得到了明显降低。而PDP-2低中高剂量组小鼠的HC50值均得到显著提高，特别是在中剂量时接近正常组水平，然而在最大剂量(200mg/kg/d)时HC50值有所降低，说明剂量超过时存在一定的副作用。210图5PDP-2组分对小鼠血清中溶血素的影响。柱形图上标的不同字母表示各数据间具有显著性差异（P<0.05）Fig.5EffectofPDP-2onhemolysininserum.Differentlettersineachcolumnmeanssignificantlydifferentbetweenvalues(Duncantest,p<0.05)215-8- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn溶菌酶是一种碱性酶，能水解致病菌细胞壁中不溶性黏多糖，使细胞壁破裂、细菌溶解[27]。因此，溶菌酶在正常防御及非特异性免疫反应中有着极其关键的作用。图6PDP-2组分对小鼠血清中溶菌酶活性的影响.柱形图上标的不同字母表示各数据间具有显著性差异（P220<0.05）Fig.6EffectofPDP-2onactivityoflysozymeinmiceserum.Differentlettersineachcolumnmeanssignificantlydifferentbetweenvalues(Duncantest,p<0.05)图7PDP-2组分对小鼠脾脏中溶菌酶含量的影响.柱形图上标的不同字母表示各数据间具有显著性差异（P225<0.05）Fig.7EffectofPDP-2onactivityoflysozymeinmicespleen.Differentlettersineachcolumnmeanssignificantlydifferentbetweenvalues(Duncantest,p<0.05)如图所示（图6、7），与正常组相比，Cy模型组小鼠血清的和脾脏中的溶菌酶含量均显著降低(p<0.05)。而低中高剂量组（PDP-2）及阳性对照组的溶菌酶含量都显著增加并甚230至超过正常水平(p<0.05)。此外，与其他剂量组相比，PDP-2高剂量组（200mg/kg/d）可以提高小鼠血清中溶菌酶含量，而脾脏中溶菌酶含量则随着剂量的增加而增加。以上结果与李-9- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn[28]作美得到粗PDP体内免疫调节活性相一致。2.3PDP-2组分对免疫抑制小鼠抗氧化能力的影响作为解毒器官，肝脏能将在体内累积的各种的有毒物质及废物转化成无害成分，继而通235过胆汁分泌或血液而排出去。经过肝脏的新陈代谢作用，毒性物质会产生超氧阴离子、H2O2、[29]羟基等氧自由基，浓度较高时能直接损伤细胞。在生物活性实验中，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶以及血液和器官中丙二醛等含量经常被用来评价体内的抗氧化能力[30]。如表3所示，注射Cy后，模型组小鼠肝脏T-AOC水平与正常组比得到了显著下降（P240<0.05）。与模型组相比，PDP-2中、高剂量组都能够明显提高小鼠肝脏T-AOC水平（P<0.05），特别是在剂量为100mg/kg/d时超过了正常组水平，说明PDP-2能够促进小鼠的非酶促抗氧化等防御系统的能力。抗氧化酶在保护宿主组织免受超氧化物阴离子等引起的氧化应激中起到关键作用。其[31]中，SOD可以将超氧化物转化为过氧化氢，并保持低浓度的过氧化物。作为一种普遍的245还原酶，CAT能将过氧化氢降解生成水和O2，且广泛分布在几乎所有生物体内。GSH-Px[32]作为抗氧化剂，同样能把过氧化氢降解成水和O2，具有保护细胞膜结构的功能。如表3，表3PDP-2对小鼠肝脏组织中T-SOD、MDA、GSH-Px、CAT和T-AOC含量的影响Table3EffectsofPDP-2onactivitiesofT-SOD、MDA、GSH-Px、CAT和T-AOCinliverofmice组别T-SODMDAGSH-PxCATT-AOCGroupU/mgprotnmol/mgU/mgprotU/mgprotU/mgprotprot正常组784.55±39.44ab0.98±0.29ab988.92±58.17ab16.63±0.28ab1.24±0.08bNormal模型组681.87±19.22a1.35±0.13b796.78±56.6a14.56±0.09a0.95±0.13aModel阳性对照组812.47±136.38ab1.26±0.17b1165.14±116.27bc20.68±3.56bc1.38±0.14bcPositivePDP2-501059.11±102.07c1.09±0.54ab1103.86±23.96b28.8±1.58e1.39±0.07bcPDP2-1001090.13±164.37c0.59±0.1a1400.45±187.29c27.17±4.43de1.76±0.16dPDP2-200937.68±33.42bc1.08±0.42ab1018.5±299.68ab23.67±0.74cd1.35±0.32c注：数据上标的不同字母表示各组间具有显著性差异（P<0.05）。250DifferentlettersmeansignificantlydifferentbetweenValues.(Duncantest,p<0.05).模型组小鼠肝脏中SOD，CAT和GSH-Px的酶活均低于正常组，而不同剂量的PDP-2处理组的酶活均能得到明显上升(P<0.05)，并恢复到正常水平。另外，MDA含量的增加则标志着内源性脂质过氧化产生。小鼠注射Cy后，肝脏中的MDA含量上升，而PDP-2给药处255理后，小鼠的MDA水平得到明显的降低。结果表明，PDP-2能协同提高免疫抑制小鼠的抗氧化活性，在剂量为100mg/kgbw时表现出较好的抗氧化效果，这与体内免疫实验结果一致。-10- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn3结论本文通过RAW264.7细胞实验研究了粗PDP及纯化组分PDP-1、PDP-2、PDP-3的体外260免疫调节活性，结果显示在各个多糖组分中，PDP-2和PDP-3表现出较好的体外免疫促进作用，有效地促进了RAW264.7细胞的增殖，并明显增强其吞噬中性红能力及酸性磷酸酶酶活。采用Cy免疫抑制小鼠模型，探讨了PDP-2的体内免疫调节活性及其协同抗氧化作用。结果表明，PDP-2能明显提高免疫抑制型小鼠的脾脏指数、血清溶血素水平及血清、脾脏中的溶菌酶含量，还能协同增强小鼠肝脏中T-AOC、T-SOD、CAT和GSH-Px的酶活，降低265MDA的水平。因此，PDP具有一定的免疫调节活性。[参考文献](References)[1]YiY,ZhangMW,LiaoST,etal.Structuralfeaturesandimmunomodulatoryactivitiesofpolysaccharidesoflonganpulp[J].CarbohydratePolymers,2012,87(1):636-643.270[2]YuanQ,ZhaoL,ChaQ,etal.StructuralcharacterizationandimmunostimulatoryactivityofahomogeneouspolysaccharidefromSinonovaculaconstricta[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2015,63(36):7986-7994.[3]WayneSJ,RhyneRL,GarryPJ,etal.Cell-mediated-immunityasapredictorofmorbidityandmortalityinsubjectsover60[J].JournalsofGerontology,1990,45(2):M45-M48.275[4]DeLaFuenteM.Effectsofantioxidantsonimmunesystemageing[J].EuropeanJournalofClinicalNutrition,2002,56:S5-S8.[5]KnightJA.Review:Freeradicals,antioxidants,andtheimmunesystem[J].AnnalsofClinicalandLaboratoryScience,2000,30(2):145-158.[6]RatheeS,RatheeD,RatheeD,etal.Mushroomsastherapeuticagents[J].RevistaBrasileiraDe280Farmacognosia,2012,22(22):459-474.[7]田恩静.中国鳞伞属[Pholiota（Fr.）Kummer]真菌分类学研究[D].吉林农业大学,2005.[8]毕志树，李泰辉，郑国杨，等.伞菌目的四个新种[J].真菌学报，1985,(3)：155-161.[9]毕志树，李泰辉.广东鳞伞属的研究初报[J].真菌学报,1989，(2)：94-97.[10]甘聃.鼎湖鳞伞菌丝体多糖的发酵条件优化、分离纯化、抗肿瘤活性及其机制的研究[D].南京农业大285学,2012.[11]GanD,MaL,JiangC,etal.Production,preliminarycharacterizationandantitumoractivityinvitroofpolysaccharidesfromthemyceliumofPholiotadinghuensisBi[J].CarbohydratePolymers,2010,84(3).[12]GanD,ZengXX,LiuRH,etal.PotentialmechanismofmyceliumpolysaccharidefromPholiotadinghuensisBiinregulatingtheproliferationandapoptosisofhumanbreastcancerMCF-7cellsthrough290p38/MAPKpathway[J].JournalofFunctionalFoods,2015,12:375-388.[13]FujimiyaY,SuzukiY,KatakuraR,etal.Tumor-specificcytocidalandimmunopotentiatingffectsofrelativelylowmolecularweightproductsderivedfromthebasidiomycete,AgaricusblazeiMurill.[J].AnticancerResearch,1999,19(1A);113-118.[14]AdachiY,OkazakiM,OhnoN,etal.Enhancementofcytokineproductionbymacrophagesstimulatedwith(1295~>3)-beta-D-glucan,grifolan(GRN),isolatedfromGrifolafrondosa,[J].Biological&PharmaceuticalBulletin,1994,17(12):1554-1560.[15]LiJE,NieSP,XieMY,etal.IsolationandpartialcharacterizationofaneutralpolysaccharidefromMoslachinensisMaxim.cv.Jiangxiangruanditsantioxidantandimmunomodulatoryactivities[J].JournalofFunctionalFoods,2014,6:410-418.300[16]DaiZQ,SuD,ZhangY,etal.Immunomodulatoryactivityinvitroandinvivoofverbascosefrommungbeans(Phaseolusaureus)[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2014,62:10727-10735.[17]WangMC,JiangCX,MaLP,etal.Preparation,preliminarycharacterizationandimmunostimulatoryactivityofpolysaccharidefractionsfromthepedunclesofHoveniadulcis[J].FoodChemistry,2013,138:41-47.[18]LiaoWZ,LuoZ,LiuD,etal.StructurecharacterizationofanovelpolysaccharidefromDictyophora305indusiataanditsmacrophageimmunomodulatoryactivities[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2015,63:535-544.[19]BaiYG,ZhangPY,ChenGC,etal.Macrophageimmunomodulatoryactivityofextracellularpolysaccharide(PEP)ofAntarcticbacteriumPseudoaltermonassp.S-5[J].InternationalImmunopharmacology,2012,12:611-617.310[20]ChengAW,WanFC,WangJQ,etal.MacrophageimmunomodulatoryactivityofpolysaccharidesisolatedfromGlycyrrhizauralensisfish[J].InternationalImmunopharmacology,2008,8:43-50.-11- 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