水稻XYLP7基因在维管系统发育中的功能.pdf 13页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn#水稻XYLP7基因在维管系统发育中的功能**马腾飞，胡恒进，赵洁（武汉大学生命科学学院，杂交水稻国家重点实验室，武汉430072）5摘要：木质形成素（Xylogen）是一种具有非典型性脂转运蛋白（nsLTP，non-specificlipidtransferprotein）结构域的嵌合型阿拉伯半乳糖蛋白（arabinogalactanproteins,AGPs），具有启动木质部细胞分化的功能。木质形成素由正在分化的维管细胞分泌并被运输到邻近的未分化细胞中启动其向导管分子细胞的分化，在植物维管系统的发育过程中起着重要作用。10为研究水稻XYLP7基因的生物学功能，作者从韩国PFG突变体库中购买了xylp7突变体，研究观察发现xylp7突变体的维管系统发育存在缺陷，表明该基因在水稻维管系统发育中发挥作用。关键词：植物发育学；木质形成素；阿拉伯半乳糖蛋白；水稻；OsXYLP7基因；维管系统中图分类号：Q9415TheroleofOsXYLP7inricevascularsystemdevelopmenMaTengfei,HuHengjin,ZhaoJie(StateKeyLaboratoryofHybridRice,CollegeofLifeSciences,WuhanUniversity,Wuhan430072)20Abstract:Xylogenisakindofchimericarabinogalactanproteins(arabinogalactanproteins,AGPs)containingatypicallipidtransferproteindomain(nsLTP,non-specificlipidtransferprotein),itcaninitiatethexylemcelldifferentiation.Xylogenissecretedbythedifferentiatingvascularcellsandtransportedtotheadjacentundifferentiatedcellsforinitiatingthesecellsdifferentiatetotrachearyelements;therefore,xylogenplaysanimportantroleinthedevelopmentprocessofvascularsystemin25plants.TostudythebiologicalfunctionofOsXYLP7geneinrice,theauthorboughtT-DNAinsertionmutantrelatedtoOsXYLP7genefromSouthKoreaPFGmutantlibrary,andfoundthatthexylp7mutanthavedefectsinthevascularsystemdevelopment,whichindicatedthattheOsXYLP7playsaroleinthedevelopmentofricevascularsystem.Keywords:Plantdevelopmentbiology；Xylogen;AGPs;Rice;OsXYLP7;Vascularsystem300引言阿拉伯半乳糖蛋白（AGPs，arabinogalactanproteins）是一类广泛存在于植物界、高度糖基化且结构非常复杂的高分子量糖蛋白。AGPs由一条核心蛋白骨架和一条或多条阿拉伯35半乳糖糖基侧链组成。根据蛋白骨架的结构特点，AGPs在广义上被分为两大类，经典AGPs[1]（classicalAGPs）和非经典AGPs（Non-classicalAGPs）。经典AGPs（ClassicalAGPs）一般包含3个结构域：N端信号肽，富含羟脯氨酸/脯氨酸、丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸的中间序列和C端GPI锚（Schultz等，2000）；其中一类经典AGPs的成熟蛋白骨架仅包含10-13[2]个氨基酸，被命名为阿拉伯半乳糖多肽（arabinogalactanpeptides）；另一类经典AGPs因基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（20130141130008）作者简介：马腾飞（1986），女，助理研究员，主要研究方向：植物生殖发育的机理通信联系人：赵洁（1959），女，教授、博导，主要研究方向：植物生殖发育的机理.E-mail:jzhao@whu.edu.cn-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn40其C端包含一段短的富含赖氨酸结构域而被命名为富含赖氨酸的AGPs（Lysine-richAGPs）[3,4][1]。非经典AGPs除拥有富含Hyp/Pro的结构域外还有富含天冬酰胺或半胱氨酸的结构域。有些非经典的AGPs除了拥有AGP结构域，还包含其他保守的功能结构域，被命名为嵌合型的AGPs（chimericAGPs），分为三类：类似成束蛋白的AGPs（FLAs，fasciclin-likeAGPs）[5,6][7,8]；类似植物蓝素的AGPs（PLAs，phytocyanin-likeAGPs）；类似木质形成素的AGPs[9]45（XYLPs，xylogen-likeproteins）。Motose等在百日菊体外叶肉细胞培养基中分离出一种大小在25~300kD的AGP蛋白，该蛋白参与细胞间信息交流，因其可诱导叶肉细胞向导管分子（TE，trachearyelements）分[10,11]化，将其命名为木质形成素（Xylogen）。木质形成素从分化中的维管细胞分泌并传导[9]到相邻未分化细胞中，启动其向TE分子的分化。在木质部中，木质形成素极性地分布在50分化中的导管分子的细胞壁上。拟南芥缺失木质形成素基因（AtXYP1和AtXYP2）的双突变体显现出维管束发育方面的明显缺陷：维管束脉不连续且极其简单化，维管束脉之间存在不正常连接。研究者认为木质形成素在维管系统的发育中作为协同作用者来形成次生脉，以保[9]证维管系统的完整性。这些研究证明了木质形成素蛋白在植物维管系统发育中具有重要的生物学功能。55本课题组在早期研究中利用生物信息学手段在水稻中预测、鉴定并命名了21个木质形成素类基因。为进一步研究木质形成素蛋白在水稻生长发育过程中的功能，本文作者对其中OsXYLP7基因及其编码蛋白的结构进行了详细分析，并通过观察研究其突变体产生的表型，对该基因进行了初步的生物学功能研究。1材料和方法601.1材料的种植与胁迫处理粳稻品种日本晴（OryzasativaL.japonicacv.Nipponbare）及T-DNA突变体种子浸没于水中，置于37℃恒温暗培养箱中催芽2天，萌发后转移至湿润蛭石上光照条件下生长，约14天后移栽于土壤中，种植于武汉大学生命科学学院温室内，生长条件为：光照16h/黑暗8h，室温25-30℃。水稻T-DNA插入突变体购买自韩国浦项工科大学（POSTECH-Pohang65UniversityofScienceandTechnology）的PFG（PlantFunctionalGenomicsLaboratory）突变体库。水稻各发育时期的材料于冰上被收集，包括：萌发后7天（DAG）的根（R）和叶（L），60DAG的茎（St），5-10cm的花穗（P3）和22-30cm的花穗（P6），每种材料均取3-5个生物学重复样品。7DAG发育正常均一的水稻幼苗被用于处理实验。非生物胁迫处理：幼70苗被转移至400mM氯化钠溶液、4℃环境中或者吸水纸上，处理3h后取材，分别作为高盐、低温和干旱处理3h的材料。激素处理：幼苗被转移至含1µM萘乙酸（NAA，-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn1-naphthylaceticacid），5µM6-苄氨基腺嘌呤(6-BA，6-Benzylaminopurine)或者5µM赤霉素（GA3，GibberellinA3）的去离子水中，处理3h后取材，每种处理均取5个生物学重复。所取材料于液氮中速冻，保存于零下80℃冰箱，备用。751.2方法1.2.1T-DNA突变体的三引物法鉴定本研究中利用三引物法对T-DNA插入突变体进行纯杂合的鉴定。在没有T-DNA插入的野生型中，只能得到由基因组侧翼序列上的特异引物FP和RP扩增得到大的条带；纯合体可得到由T-DNA插入片段上的边界引物LB或RB与基因组侧翼序列FP或RP组合所得80到小的条带，即两条同源染色体均有T-DNA片段的插入；而杂合体则两种条带都可以获得，即两条同源染色体只有一条上有T-DNA片段的插入。利用PCR方法鉴定出携带有T-DNA插入的纯合或杂合株系后，对其三引物鉴定结果中的小带PCR产物进行产物回收或胶回收，并将回收的片段作为模板，以插入的T-DNA片段上对应的边界引物LB或RB作为引物送去测序。将测序得到的结果在RGAP网站85（http://rice.plantbiology.msu.edu/）公布的水稻全基因组据库中进行比对，即可获得突变体中T-DNA的具体插入位点。1.2.2实时荧光定量PCR对不同发育时期的组织和器官、非生物胁迫和激素处理分别取样，每个样品至少3个生物学重复，各生物学重复在进行qRT-PCR过程中均进行3次技术性重复。使用Invitrogen90公司的PlantRNAPurificationReagent试剂提取以上各样品的总RNA，取4µL总RNA利用ReverTraAce反转录酶（TOYOBO）进行反转录实验合成cDNA的第一条链。选用水稻看[12,13]家基因UBQ5对各样品的表达进行一致化，利用双标准曲线法计算各个基因的相对表达量，以混合cDNA的3倍稀释梯度，即分别为原液、稀释3倍、9倍、27倍的cDNA溶液为模板构建了每个基因的标准曲线。951.2.3引物本研究中所用引物均使用GeneTool设计，并委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成。表1本文研究所用引物Table1Primersinthisstudy引物名称序列（从5’端到3’端）定量PCR所用引物-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnUBQ5-FPACCACTTCGACCGCCACTACTUBQ5-RPACCACTTCGACCGCCACTACTOsXYLP7-FPGTGGCTGTTTGTTTGTATGGOsXYLP7-RPGTCATGGAATCCAGCAAGT突变体鉴定所用引物xylp7-FP1GCAGTAGCAGCAGCACTCTCxylp7-RP1TTGCGTGTATAAGGCAAAGCxylp7-FP2TTTGGTGAGGGTATTTGCTTTTGAxylp7-RP2CCTGCCTTAGCCATCACTGACAALBACGTCCGCAATGTGTTATTAARBAACGCTGATCAATTCCACAG1.2.4形态学观察及照相100从水稻温室取成熟时期的水稻植株，进行必要的处理后进行测量株高及各节长度，获得所需参数，之后放置于黑色背景布上；对于需要完全生活状态照片的植株，则在其生长的盆中进行照相，以黑色背景布为背景，用单反照相机（尼康，D5000）及微距镜头（尼康，MicroNIKKOR60mm）进行拍照。2结果1052.1OsXYLP7的基因和蛋白质结构分析OsXYLP7基因在RGAP（RiceGenomeAnnotationProject）和RAP-DB（RiceAnnotationProjectDatabase）中的位点分别是LOC_Os05g41030和Os05g0489200。对OsXYLP7的基因序列进行分析，发现其存在3个外显子和2个内含子，对OsXYLP7的开放阅读框进行翻译，获得一个长度为210个氨基酸的蛋白质序列。在蛋白质中，N端信号肽的存在对前体蛋白在110内质网中的合成、糖基修饰和GPI锚的添加等过程是必需的。参考SignalP3.0预测的结果，OsXYLP7蛋白存在N端信号肽。将OsXYLP7蛋白序列分别上传到Big-PIPlantPredictor分析，发现该蛋白具有GPI锚定信号，暗示这些蛋白极有可能定位在质膜上。在NetNGlyc1.0Server网站上检测N连接的糖修饰位点，发现OsXYLP7蛋白的N连接的糖修饰位点出现在nsLTP结构域和富含PAST的区域中；其AG糖单元和阿拉伯糖基侧链修饰位点参考前人报[14-17]115道的标准分别标识出来；在OsXYLP7蛋白中，AG糖单元均分布在富含PAST的区域内。信号肽和AG糖单元的存在说明OsXYLP7蛋白是嵌合型的AGP蛋白，既含有AGP典型的结构域，又含有类似非特异性脂转运蛋白的结构域（nsLTPdomain）。作者将该基因的基因组序列和蛋白质骨架进行了总结，绘制其结构简图（图1）。-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn120图1OsXYLP7基因组和蛋白质结构简图Figure1thesketchmapofgenomeandproteinstructureA．OsXYLP7基因结构简图。上方的倒三角表示表示T-DNA在基因上的插入位点。基因按其长度绘制，下方标尺表示500bp的长度。E（Exon）：外显子；Intron：内含子。B.OsXYLP7蛋白质结构简图。Signalpeptide：信号肽；Glycomodules：糖单元；GPI-anchoredsignal：GPI锚定信号；Cysteine：半胱氨酸；Aminoacidsbetween125cysteines：半胱氨酸之间的氨基酸；Hydrophobicaminoacid：疏水氨基酸；PAST-richregion：富含PAST的区域。2.2OsXYLP7在各个发育时期器官及组织中的表达分析基因表达模式的研究对进一步解析基因的功能至关重要，为了揭示OsXYLP7的生物学功能，作者利用qRT-PCR技术研究了该基因在水稻不同发育时期的器官和组织中的表达（图1302）。图2OsXYLP7基因在水稻不同器官和组织中的表达Figure2ExpressionprofilesofOsXYLP7genesinvariousorgansandtissuesofrice.-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnR：萌发后7天幼苗的根；L，萌发后7天幼苗的叶；St：萌发后65天植株的茎；P3：5-10cm的花穗；P6：22-30cm的花穗。误差线表示3次生物学重复样本结果之间的标准偏差（n≥3）。1352.3OsXYLP7在非生物胁迫处理下的表达分析为了研究OsXYLP7基因对非生物胁迫的应答反应，作者利用qRT-PCR方法检测了该基因在处于这3种处理条件下三个小时后的7天幼苗中的表达量（图3）。qRT-PCR结果显示，在干旱和寒冷处理下，OsXYLP7的表达量仅有略微上升，与对照组并无显著性变化（图3）；在高盐胁迫下，该基因的表达量与对照组相比出现显著性的上升。这些结果暗示OsXYLP7140基因可能参与非生物胁迫信号通路，并且在非生物胁迫特别是对高盐的应答中起着一定的作用，这为水稻耐受非生物胁迫的研究提供了有价值的资料。图3在非生物胁迫条件下OsXYLP7基因的表达模式Figure3DifferentialexpressionprofilesofOsXYLP7underabioticstresses.CK，对照；DS，干旱处理；SS，高盐处理；CS，寒冷处理。利用Origin7.5软件检测对照和胁迫处理下差145异的显著性，一个星号和两个星号分别表示显著性差异（*，0.01