烯丙基荧光素-丙烯酰胺沉淀共聚荧光分子印迹选择性荧光检测三氟氯氰菊酯残留.pdf 9页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn烯丙基荧光素-丙烯酰胺沉淀共聚荧光分子印迹选择性荧光检测三氟氯氰菊酯残留**高林，郑旭东，刘恩秀，刘恩利，李春香5（江苏大学化学化工学院）摘要：设计并使用沉淀聚合法合成了一种新颖的用于检测蜂蜜中超痕量三氟氯氰菊酯的FMIP微球。本研究以LC为模板分子、丙烯酰胺（AM）为功能单体、烯丙基荧光素为荧光单体、二甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA）为交联剂合成的微米尺寸具有特异识别位点的荧光分子印迹聚合物微球。FMIP微球展现出规则的几何构型，强烈的荧光发光特性以及对目10标分子的高度选择识别性。而且FMIP微球的荧光强度与三氟氯氰菊酯的浓度呈现良好的线性关系，建立了线性回归方程(I0/I)-1=0.29•CC-0.00608，R2=0.9936，检出限（LOD）=0.004nmol/L；实际样品检测结果证明此方法制备的FMIPs可以在复杂样品中有选择性地检测三氟氯氰菊酯浓度；再生实验证明FMIP微球至少可以重复利用五次。关键词：分析化学；荧光传感器；拟除虫菊酯15中图分类号：X131.2DetectionofthreecypermethrinresiduesbyfluorescenceandmolecularimprintingwithallylchlorideandAcrylamideGaoLin,ZhengXudong,LiuEnxiu,LiuEnli,LiChunxiang20(chemistryandchemicalengineeringSchool,JiangSuUniversity)Abstract:Afluorescentmolecularlyimprintedpolymer(FMIP)sensorisfabricatedviaprecipitationpolymerisation.TheMIPsensorisprepareduponcopolymerisationofacrylamidewithasmallquantityofallylfluoresceininthepresenceofLCtoformrecognitionsites.Theas-synthesisedmicrospheresexhibitedsphericalshape,highfluorescenceintensityandhighlyselectiverecognition.Underoptical25conditions,polymermicrospheresaresuccessfullyappliedtoselectivelyandsensitivelydetectLC,andalinearrelationshipdescribedbytheStern-Volmerequation(I0/I)–1=0.29•CC-0.00608withacorrelationcoefficientof0.9936.Alowerlimitofdetection(LOD)isfoundtobe0.004nM.TheresultsofpracticaldetectionsuggestedthatthedevelopedmethodissatisfactoryfordeterminationofLCinhoneysamples.TheFMIPsensorhascertifiedthattheycanbereusedfornotlessthan5timeswithout30remarkablylossofsignalintensity.Keywords:analyticalchemistry;fluorescentsensor;pyrethroid0引言拟除虫菊酯类杀虫剂（Pyrethroidpesticides，PPs）是一类仿生合成的广谱性杀虫剂，具[1-2]35有速效、无臭、低毒、触杀作用强和残留时间长等特点。目前，对环境中PPs残留的监作者简介：高林（1987），男，硕士，荧光单体构筑的分子印迹传感器选择性检测三氟氯氰菊酯和2,4,6-三氯酚残留的行为研究通信联系人：李春香（1964），女，工学博士，江苏大学，化学化工学院化学系，教授，博士生导师。主要从事绿色高效分离富集新技术方面的教学和科研工作.E-mail:lcx@mail.ujs.edu.cn(C.Li)-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn控分析、迁移、细菌抗药性等方面的研究已成为环境化学家关注的热点，如美国环境保护局[3]已将环境中PPs残留的最大值限定为0.05μg/g。在本研究中，我们通过沉淀聚合反应合成一个新颖的荧光分子印迹聚合物（FMIP）传[4]感器用于光学检测超痕量三氟氯氰菊酯。以三氟氯氰菊酯为模板，丙烯酸酯作为功能单体，40烯丙基荧光素作为荧光团，EGDMA作为交联剂，偶氮二异丁腈作为引发剂，乙腈作为制孔剂制备FMIP传感器。去除模版分子后，FMIP内部形成了与三氟氯氰菊酯有较强亲和势的[5]选择性识别位点。详细阐述了FMIP微球结构、形貌、光物理等性质，对比FNIP，阐述了FMIP的选择性、抗干扰性、检测范围、检出限（LOD）、目标浓度与荧光强度的线性关系。实际样品的检测结果来说明FMIP传感器的应用情况。451实验部分1.1试剂及仪器（1）试剂：乙醇、乙腈国药集团化学试剂有限公司（上海，中国）提供。三氟氯氰菊酯，氟氯氰菊酯，氢戊菊酯，联苯菊酯购买自应天意标准样品公司（北京，中国）。丙烯酰胺，EGDMA，偶氮二异丁腈均为分析纯购买自阿拉丁试剂公司（上海，中国）。AIBN用50甲醇重结晶后使用。实验用水为二次蒸馏水。（1）试剂：傅立叶变换红外吸收光谱仪（FT-IR），美国，ThemoNicoletNEXUS470型，-1采用KBr压片测试，扫描次数32次，波数范围4000–400cm；扫描电子显微镜（ScanningElectronMicroscopy，SEM），日本，S-4800；荧光分光光度仪，美国，CaryEclipse；激光共聚焦显微镜，LeicaTCSSP5II，固态激发光源波长488nm，德国。551.2荧光分子印迹传感器的制备以EGDMA为交联剂、烯丙基荧光素（0.0053g）作为信号基团、丙烯酰胺作为功能单[6]体、三氟氯氰菊酯作为模板分子共同在60mL乙腈中。具体实验操作过程：称取适量三氟氯氰菊酯、丙烯酰胺、烯丙基荧光素、EDGMA和自由基引发剂偶氮二异丁腈倒入100mL圆底烧瓶中，同时加入60mL乙腈进行溶解。各组分具体用量如表1所示。溶液在超声波60清洗器内脱气5分钟，然后充氮20分钟用以净化空气，然后烧瓶浸入油浴并以最慢速度搅拌（约20转/分钟），随后温度升高到60℃并保持反应24h。反应结束后，采用离心机进行离心分离并在40℃下进行真空干燥。干燥后的微球通过索氏提取器去除模板后40℃下真空AB.干燥。FNIPs微球的制备过程除无模板分子外其他条件与FMIPs相同。通过重量分析，FMIP产率为68%，FNIP产率为64%.65表1制备FMIPs的各组分用量Tab.1DosageofeachcomponentofpreparedFMTPsFMIPs序号AM(g)EGDMA(mL)三氟氯氰菊酯(g)10.28440.80.499520.21330.60.374630.14220.40.2497-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn1.3荧光检测(1)配置FMIPs分散液和不同浓度菊酯农药的溶液。准确称取100mgFMIPs固体加入装有100mL无水乙醇的锥形瓶中，超声分散备用；准备配置0、0.1、0.2、0.5、1.0nmol/L70三氟氯氰菊酯溶液装入容量瓶中备用。(2)分别准确量取5mLFMIPs分散液和不同浓度的三氟氯氰菊酯溶液加入比色管中，超声混合后静置2小时达到吸附平衡。摇匀后，利用荧光分光光度计进行荧光测量。为精确检测数据，此过程重复5次。(3)绘制坐标图，拟合线性关系。751.4选择性识别测试分别配置1nmol/L的氟氯氰菊酯、氢戊菊酯、联苯菊酯的乙醇溶液100mL。分别量取5mL上述三种溶液加入装有5mLFMIPs分散液的比色管中，震荡混合。分别检测荧光强度变化（激发波长496nm）。重复5次。1.5干扰实验80选取与模版分子结构相似的氟氯氰菊酯、氢戊菊酯、联苯菊酯作为干扰化合物。配置1.0nmol/L含有三氟氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、氢戊菊酯和联苯菊酯的乙醇混合溶液100mL，量取5mL上述混合溶液加入装有5mLFMIPs分散液的比色管中，震荡混合。检测荧光强度变化（激发波长496nm）。重复5次。2结果与讨论852.1FMIPs微球的红外光谱分析FMIPs微球的结构性能通过红外光谱分析得出，如图1（蓝）所示，位于1730、1258、-1-11151cm的特征峰归属于EGDMA中的C=O和C-O键，3440和1613cm特征峰是AM中的亚[7]-1胺基团的伸缩振动峰。同时，1677cm处出现的特征峰为AM中羰基基团中的C=O键的伸-1缩振动峰。此外，1391cm特征峰归因于AM中的C-N键伸缩震动，上述特征峰证明了功能90单体和交联剂聚合反应的成功。红外光谱证明FMIP微球合成成功。-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图1FT-IR谱图：(黑)荧光素；(红)烯丙基荧光素；(蓝)F-MIP微球Fig.1FT-IRspectraof(black)fluorescein,(red)allylfluoresceinand(blue)F-MIPmicrospheres.2.2SEM分析95用SEM分别观察了不同组分的FMIPs形貌特征，结果分别如图2所示。随着交联剂和单体用量的减少（从左至右），微球逐渐呈现规则球形形状。在图2（右）中。可以看到F-MIPs3具有规则球形形状和良好单分散性以及光滑的外表面。在此最优化的条件下，F-MIPs3微球的平均粒径约为2.0μm。在本试验中，微球是通过沉淀聚合反应制备，沉淀聚合反应的原理决定了在聚合反应过程中，只有当发生聚合的聚合物链聚集到足够大的尺寸才会产生沉淀100作用沉降到反应器的底部，因此，通过沉淀聚合反应制备的聚合物粒子理论为500nm至2μm，但通常在1~2μm之间。图2F-MIP微球随单体和交联剂用量变化的SEM图：F-MIPs1(左),F-MIPs2(中),andF-MIPs3(右)105Fig.2SEMimagesofF-MIPmicrosphereswiththedecreaseoftheamountofmonomerandcrosslinker:F-MIPs1(left),F-MIPs2(middle),andF-MIPs3(right)2.3FMIPs微球的光物理性能所有荧光光谱都是在室温条件下，激发波长固定为496nm时进行测量的。图3展示了FMIPs粒子的共焦激光扫描显微镜图像，从图中可以看出FMIPs粒子呈现强烈的绿色荧光发110射，这是因为烯丙基荧光素的荧光发射峰位在520nm处为强的绿色荧光（如图4中红色曲线所示）。同时从图中也可以很明显的看出FMIPs粒子具有较规则的球形几何形状且呈现具有-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn较好的单分散性。为了更好的研究烯丙基荧光素和FMIPs球的发光性质，对其进行了荧光性质表征。从图4中可以看出，不论是烯丙基荧光素还是FMIPs球都具有优良的绿色荧光发光性能。FMIPs微球的荧光最大发射峰在520nm，相对于乙醇中烯丙基荧光素发生了32nm的115蓝移，这是因为烯丙基荧光素由自由状态转变为聚合物层中固定状态而发生的环境变化导致的。因为FMIPs微球的荧光最大发射峰在520nm，所以后续的三氟氯氰菊酯的定量分析通过检测分散在乙醇的FMIPs在520nm处荧光发射强度来所有荧光光谱都是在室温条件下，激发波长固定为496nm时进行测量的。图3展示了FMIPs粒子的共焦激光扫描显微镜图像，从图中可以看出FMIPs粒子呈现强烈的绿色荧光发射，这是因为烯丙基荧光素的荧光发射峰位在120520nm处为强的绿色荧光（如图4中红色曲线所示）。同时从图中也可以很明显的看出FMIPs粒子具有较规则的球形几何形状且呈现具有较好的单分散性。为了更好的研究烯丙基荧光素和FMIPs球的发光性质，对其进行了荧光性质表征。从图4中可以看出，不论是烯丙基荧光素还是FMIPs球都具有优良的绿色荧光发光性能。FMIPs微球的荧光最大发射峰在520nm，相对于乙醇中烯丙基荧光素发生了32nm的蓝移，这是因为烯丙基荧光素由自由状态转变为125聚合物层中固定状态而发生的环境变化导致的。因为FMIPs微球的荧光最大发射峰在520nm，所以后续的三氟氯氰菊酯的定量分析通过检测分散在乙醇的FMIPs在520nm处荧光发射强度来完成。130图3FMIPs的激光共聚焦显微镜图像Fig.3ConfocallaserscanningmicroscopeimageofFMIPsmicrospheres-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图4烯丙基荧光素和FMIPs微球的荧光光谱135Fig.4FluorescencespectraofallylfluoresceinandF-MIPmicrospheres2.4荧光检测实验-线性回归分析回归分析法是根据实验数据建立两个或两个以上变量的数量关系(回归方程)并据此由一个或几个变量的值去估计另一个变量的值的数理统计方法。在荧光分析中，先测量一系列不同浓度的标样溶液的荧光强度，作出荧光强度与浓度的关系曲线，即标准曲线，再由计算140机程序绘制回归直线并得出回归方程。然后测定样品溶液的荧光强度，在标准曲线上查出样品溶液中待测物质的浓度，从而求得样品中待测物质的含量。本实验中通过研究三氟氯氰菊酯对FMIPs微球荧光猝灭的规律，绘制标准曲线并且拟合Stern–Volmer方程（公式1）得出回归方程。(I0/I)-1=KSV.CC公式1145(其中，I0为无三氟氯氰菊酯的FMIPs分散液的初始荧光强度，I是存在三氟氯氰菊酯时FMIPs分散液的荧光强度，KSV是猝灭常数)如图5所示，FMIPs分散液的荧光强度随着三氟氯氰菊酯增加而逐渐减少，相对应的FNIPs分散液的荧光强度却未发生明显变化，这说明在印迹过程中，烯丙基荧光素参与了具有选择性的印迹位点的形成，而在FNIPs合成过程中未能形成有效的识别位点，这样从另一150方面证明成功制备了FMIPs微球。在图5中插图可以看出，三氟氯氰菊酯浓度为0到1.0nmol/L时，荧光强度猝灭情况呈线性关系。通过软件Oringin2012拟合Stern–Volmer方程得出FMIP微球的线性回归方程(I0/I)-1=0.29•CC-0.00608，R2=0.9936，检测限LOD为（3s/S，s为标准偏差,S为回归方程的斜率）为0.004nmol/L。-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn155图5FMIPs与FNIPs对0-1.0nmol/L三氟氯氰菊酯的响应Fig.5ResponseoftheFMIPsmicrospheresandFNIPsmicrospherestocyhalothrinintheconcentrationrangefrom0to1.0nM2.5选择性测定160为了深入的研究FMIPs微球的选择性识别特性，选择化学结构与三氟氯氰菊酯相近的氟氯氰菊酯，氰戊菊酯，联苯菊酯作为竞争化合物。通过检测分析每种菊酯溶液对FMIPs微球的乙醇分散液的荧光强度的猝灭程度来评价FMIPs微球的选择识别性能。图6显示三氟氯氰菊酯对FMIPs的猝灭能力高于其它三种竞争化合物，但是对FNIPs的猝灭能力未见明显区别。因此证明，FMIPs内部的选择性识别位点起到了决定性作用。165图61.0nmol/L的四种菊酯对FMIPs和FNIPs的猝灭程度Fig.6QuenchingamountofFMIPsandFNIPsmicrospheresby1.0nmol/Lpyrethroids2.6干扰性评估抗干扰能力是评估一种传感器的重要指标。所以，考察FMIPs传感器的抗干扰能力是初170步评价复杂样品检测中应用的因素。为了更深入的研究FMIPs传感器的抗干扰能力，选择结构相似物氟氯氰菊酯、氰戊菊酯、联苯菊酯作为干扰化合物加入三氟氯氰菊酯溶液中形成混合溶液。如图7所示，三种竞争杀虫剂的加入对于荧光猝灭强度的下降无明显作用，竞争物未展现出明显的猝灭干扰，可以证明FMIP微球对于三氟氯氰菊脂具有高选择性，对于来自相似化合物的干扰具有很高的抗干扰性。-7- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn175图7不同菊酯杀虫剂对FMIPs的干扰性实验：(a)FMIPs,(b)FMIPs+三氟氯氰菊酯(c)FMIPs+三种干扰物的混合液Fig.7TestfortheinterferenceofdifferentpyrethroidsonthefluorescenceresponsetowardLCofFMIPs.(a)FMIPs,(b)FMIPs+cyhalothrin(c)FMIPs+cyhalothrin+interferingpyrethroids.1802.7对蜂蜜样品的应用和再生评估对FMIP微球检测实际食品中三氟氯氰菊酯的适用性进行初步评价，将5.0g蜂蜜样品溶解于三氟氯氰菊酯溶液（0、0.1、0.25、0.5、1.0nmol/L），使用1，4中所述方法进行分析分析，相应结果列于表2。结果清晰的说明FMIPs微球可以有效地应用于检测蜂蜜样品中的三氟氯氰菊酯。185表2.蜂蜜样品中不同浓度三氟氯氰菊酯的检测结果Tab.2DetectionresultsofdifferentconcentrationsofthreeCyhalothrininhoneysamples三氟氯氰菊酯浓度(nmol/L)检出浓度(nmol/L)检出率(%)10.000.00-20.100.1310330.250.2610440.500.499851.000.9797为了评价FMIPs微球的荧光再生性，将100mgFMIP微球加入100mL三氟氯氰菊酯溶液静置2h后进行荧光测试。测试后，使用甲醇和醋酸的体积比9:1混合溶液洗脱FMIPs微球中190吸附的三氟氯氰菊酯，使用离心机收集，并用乙醇清洗三次，检测分散液的荧光强度，如此重复5次。结果如图8所示，经过5次的重复使用后，FMIPs的荧光强度未有大幅度的降低，因此FMIPs微球进行多次的重复使用。-8- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图8FMIPs微球重复使用后的荧光强度195Fig.8EffectofreuseofFMIPsmicrospheresonfluorescenceintensity致谢对论文有帮助的有关人士或单位表示谢意，感谢教育部博士点基金项目20133227110010对本文的支撑。200[参考文献](References)[1]HughesMichaelF.,RossDavidG.,EdwardsBrendaC..TissuetimecourseandbioavailabilityofthepyrethroidinsecticidebifenthrinintheLong-Evansrat.Xenobiotica,2016,46,430-438.205[2]FazolinMurilo,VidalEstrelaJoelmaLima,MonteiroMedeirosAndreFabio.Synergisticpotentialofdillapiole-richessentialoilwithsyntheticpyrethroidinsecticidesagainstfallarmyworm.EnciaRural,2016,46,382-388.[3]BarroRuth,Garcia-JaresCarmen,LlompartMaria.Activesamplingfollowedbysolid-phasemicroextractionforthedeterminationofpyrethroidsinindoorair.JournalofChromatographyScience.2006,44,430-437.210[4]JinYongzhu,HiroseKeiji,NakamuraTakashi.Preparationandevaluationofachiralstationaryphasecovalentlyboundwithachiralpseudo-18-crown-6etherhavingaphenolichydroxygroupforenantiomerseparationofaminocompounds.JournalofChromatographyA.,2006,1129,201-207.[5]LiuHoumei,ZhangMingliang,GuoYong.Solid-phaseextractionofflavonoidsinhoneysamplesusingcarbamate-embeddedtriacontyl-modifiedsilicasorbent.FoodChemistry,2016,204,56-61.215[6]RubertJosep,LacinaOndrej,ZachariasovaMilena.Saffronauthenticationbasedonliquidchromatographyhighresolutiontandemmassspectrometryandmultivariatedataanalysis.FoodChemistry,2016,204,201-209.[7]YanWenwu,WangNani,ZhangPeimin.Simultaneousdeterminationofsucraloseandrelatedcompoundsbyhigh-performanceliquidchromatographywithevaporativelightscatteringdetection.FoodChemistry,2016,204,358-364.220-9-'