高效液相色谱法测定野生和人工种植库鲁木提草中柚皮苷和木犀草素的含量.pdf 7页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn高效液相色谱法测定野生和人工种植库鲁#木提草中柚皮苷和木犀草素的含量**楚刚辉，木合塔尔·吐尔洪，尹学博，木尼热·阿布都克力木5（新疆特色药食用植物资源化学重点实验室，喀什大学化学与环境科学学院，新疆喀什844006）摘要：本文建立了库鲁木提草中两种活性成分柚皮苷和木犀草素的提取方法，优化了高效液相色谱法同时测定两种活性成分的色谱条件，并实现了野生及人工栽培库鲁木提草中柚皮苷和木犀草素的检测。采用AgilentHC-C18色谱柱（250mm×4.6mm,5μm），并以甲醇-0.2%10乙酸水溶液作为流动相，在室温柱温和流速1.00mL/min的条件下进行梯度洗脱，实现了两种活性成分之间以及和干扰组分之间的良好分离。柚皮苷和木犀草素的线性范围分别为120∼1440mg/L(r=0.9998)和17.5∼210mg/L(r=0.9999)，加标回收率分别为95.3%(RSD=3.5%,n=6)和99.2%(RSD=1.9%,n=6)。本文成功实现了同时测定库鲁木提草中两种活性成分柚皮苷和木犀草素，结果表明野生库鲁木提草中柚皮苷和木犀草素的含量更高。该工作将为库鲁15木提草有效成分质量评价及开发应用提供了一定的科学指导。关键词：高效液相色谱法；柚皮苷；木犀草素；库鲁木提草中图分类号：O658DeterminationofnaringinandluteolininHymenolymananabyhighperformanceliquidchromatography20CHUGanghui,MUHETAER•Tu’erhong,YINXuebo,MUNIRA•Abudukeremu(XinjiangLaboratoryofNativeMedicinalandEdiblePlantResourcesChemistry,CollegeofChemistryandEnvironmentalScience,KashgarUniversity,Kashgar844006,China)Abstract:HerewedevelopedakindofextractionmethodfornaringinandluteolininHymenolymanana.Thetwoactivecomponentsinwildandcultivatedsamplesweredeterminedbyhighperformance25liquidchromatography(HPLC)withAgilentHC-C18column(250mm×4.6mm,5μm),andthemobilephaseofCH3OH-0.2%HAcforthegradientelutionwithflowrateof1.0mL/minunderroomtemperature.Naringinandluteolinwereseparatedverywellwitheachotherandthecoexistingcomponents.Undertheoptimalchromatographicconditions,linearcorrelationwereobtainedintheconcentrationrangeof120∼1440mg/L(r=0.9998)fornaringinand17.5∼210mg/L(r=0.9999)for30luteolin.Therecoveriesofnaringinandluteolinwere95.3%(RSD=3.5%,n=6)and99.2%(RSD=1.9%,n=6),respectively.TheseresultsillustratedthattheircontentinwildHymenolymananaarehigherthanthatincultivatedsample.ThemethodachievedsuccessfullythedeterminationofnaringinandluteolininHymenolymanana,andtheresultscouldprovidetheguidanceforthequalityassessment,developmentandutilizationofHymenolymanana.35Keywords:highperformanceliquidchromatography(HPLC);naringin;luteolin;Hymenolymanana基金项目：本论文由国家自然科学基金项目（21665013），高校博士点基金（20130031110016）和新疆维吾尔自治区重点实验室开放课题（2015KL030）项目资助作者简介：楚刚辉（1973‐），男（汉族），副教授，主要研究方向：药物分析通信联系人：木尼热·阿布都克力木(1963-)，女，教授，研究方向为天然产物有效成分提取分离及纯化研究.E-mail:munira818@163.com-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn0引言库鲁木提草，又称矮膜苞芹(Hymenolymanana)，主要产于塔什库尔干和叶城等帕米尔[1,2]高原高海拔地区，属于维族地区传统民族药物中的珍稀药材，可用于防治糖尿病。近年40来研究发现，库鲁木提草不仅具有明显的降血糖的作用，而且能使糖尿病多饮多食的症状逐[3]渐缓解并存在一定的剂量依赖关系。柚皮苷又名柚苷、柑橘苷或异橙皮苷，全称为柚皮素-7-O-新橙皮糖苷，属于双氢黄酮[4]类化合物。现代药理研究表明，柚皮苷具有多种药理作用，柚皮苷在降血脂、抗氧化、抗[5,6]肿瘤和抗菌等方面显示较强的生物活性。木犀草素化学名为3,4,5,7－四羟基黄酮，具有45抗炎、抗氧化和保护神经系统的作用。研究表明木犀草素还能够保护肝脏和心血管系统，预防和减少骨质疏松，同时具有良好的抗肿瘤作用，起到抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋[7,8]亡等作用，能有效促进机体抑制胃癌、肝癌、前列腺癌和乳腺癌等恶性肿瘤细胞的增殖。中药的质量标准控制在中药研究中具有重要的作用，可确保中药的科学性、规范性和前瞻性，对于中药的质量控制、产地鉴别、药品监管、维护公众用药安全和公众健康等方面具[9]50有重要的意义。中药及成药中多种成分同时测定比单组分的测定更能够反映出它们的总体[10-18]质量，因而近年来得到广泛关注。目前，有关库鲁木提草的研究报道较少，缺乏相关质量研究的报道。本文以新疆南疆民族药物中的珍稀药材库鲁木提草为研究对象，通过高效液相色谱法检测其中的两种活性成分柚皮苷和木犀草素的含量，希望为库鲁木提草的质量评价及开发应用提供了重要的理论依据。551实验部分1.1仪器、试剂与材料高效液相色谱仪，SPD-M20A二极管阵列检测器、DGU-20A5在线脱气机、LC-20AT高压泵、LC-solution工作站（日本岛津公司）；AgilentHC-C18柱(4.6mm×250mm,5μm，美国Agilent公司)；KQ3200DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；WJS-100型60高速多功能粉碎机（上海缘沃工贸有限公司）。甲醇(色谱纯，天津光复)，冰乙酸（分析纯，天津赛孚瑞科技），柚皮苷、木犀草素对照品(纯度均≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，其他试剂为国产分析纯。水为超纯水，并经0.22μm微孔滤膜过滤。选择新疆南疆产野生和人工种植的库鲁木提草，并经由叶尔羌绿洲生态与生物资源重点65实验室司马义教授鉴定。将两种库鲁木提草样品60℃烘干后，进行粉碎，并过40目分样筛，在样品瓶中储存备用。-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn1.2色谱条件色谱柱：AgilentHC-C18柱；以甲醇为流动相A，以0.2%（v/v）的乙酸水溶液为流动相B；流动相流速为1.0mL/min；柱温为室温；进样量为10μL。梯度洗脱条件：0~40min，7035%A~100%A。检测波长为254nm。1.3溶液的配制混合对照品溶液的配制：精确称取柚皮苷对照品和木犀草素对照品，加甲醇溶解并定容至100mL，制成柚皮苷和木犀草素浓度分别为2400mg/L、350mg/L的标准储备溶液。供试品溶液的配制：准确称取1.000g库鲁木提草，置于具塞锥形瓶中，精确加入50.0075mL80%（v/v）甲醇水溶液，密塞，精密称量，浸泡过夜，超声20min，放冷至室温。用上述甲醇溶液补足减失的质量，摇匀，过滤，得到库鲁木提草供试品溶液。2结果与讨论2.1色谱条件的选择为了获得库鲁木提草提取液良好的色谱分离效果，分别考察了甲醇-水和甲醇-0.2%乙酸80水溶液为流动相对分离效果的影响。结果发现，使用甲醇-水作为流动相时，两种被测组分峰拖尾现象较严重。甲醇-0.2%乙酸水溶液为流动相，可以得到相对较为满意的分离效果。采用二极管阵列检测器选择检测波长，发现吸收波长为254nm时库鲁木提草提取液中两种组分均有较高的响应信号，而且色谱峰形良好，与其他组分分离较好，故选择254nm作为本实验的检测波长。混合标样、样品和加标样品的色谱图见图1，从图1可以看出，样品中85的两种活性成分柚皮苷和木犀草素相互之间及与其他组分之间均实现了良好的色谱分离。图1（a）混合对照品、（b）供试品和（c）加标样的色谱图-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnFig.1Chromatogramsof(a)mixedreferencesubstance,(b)sampleand(c)itsspikedsample2.2样品提取方法考察90为了得到被测组份良好的提取率，分别以70%和80%的甲醇水溶液以及纯甲醇分别对库鲁木提草样品中的目标物进行提取，发现纯甲醇对柚皮苷和木犀草素的提取效果欠佳，而甲醇中适当添加纯水可以有效提高两种组分的提取率，但当用70%甲醇水溶液提取时，提取率有所降低，而且提取液较难通过微孔滤膜过滤，这可能是由于样品溶出多糖的影响。80%（v/v）的甲醇水溶液对于两种组分的提取效果良好，而且易于过滤膜。因此，选择80%（v/v）95的甲醇水溶液用于库鲁木提草样品中两种有效成分的提取。为了保证样品中有效成分的充分溶出，干燥粉碎的样品经浸泡过夜后再超声，超声时间为20min。2.3色谱峰的确定在标准品和样品提取液的色谱图中（见图1），混合标准溶液中柚皮苷、木犀草素的保留时间分别为13.415、21.924min，样品提取液中柚皮苷、木犀草素的保留时间分别为13.326、10021.786min。经过保留时间的对比可初步确认两个色谱峰组分的归属。为了进一步验证两个色谱组分，通过样品提取液的二极管阵列3D图得到两个组分的吸收光谱图。再将两个组分对应色谱峰的光谱图与它们标准品的紫外吸收光谱图比对，两个吸收光谱的主要吸收峰位能够基本吻合。从图2可以看出，两种光谱图仍存在一定的差异，这可能是由于溶剂的影响与杂质组分的干扰以及二极管阵列检测器本身光谱采集精度问题引起的。总之，通过混合105标准样和样品提取液中两个组分色谱峰的保留时间，以及它们吸收光谱主要峰位的吻合程度，可以确认样品色谱图中这两个组分的归属。图2（A）提取色谱峰和（B）对照品的紫外－可见吸收光谱图Fig.2UV-Visabsorptionspectraof(A)Chromatographicpeaksand(B)standardsample1102.4线性关系准确吸取适量混合标准储备溶液，分别置于10mL容量瓶中，配制含有浓度为120、240、360、480、720、1200、1440mg/L的柚皮苷和浓度为17.5、35、52.5、70、105、175、210mg/L的木犀草素的混合标准系列溶液，按实验部分提供的色谱条件进行检测。两组分分别以峰面-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn积(A)为纵坐标、对照品质量浓度(C，mg/L)为横坐标绘制标准曲线，其回归方程、相关系数115和线性范围见表1。结果表明柚皮苷和木犀草素均具有良好的线性关系。表1两种组分的回归方程、相关系数、线性范围Tab.1Linearregressionequation,correlationcoefficient,andlinearrangeoftwocomponentsComponentRegressionequationsCorrelationLinearrangecoefficient/(mg/L)Naringin/柚皮苷A=4125.1C-6816.70.9998120～1440Luteolin/木犀草素A=25912C-2028.80.999917.5～2102.5精密度和重复性试验混合对照品溶液（720mg/L柚皮苷和105mg/L木犀草素），按实验部分提供的色谱条120件下连续进样5次，测定柚皮苷和木犀草素峰面积的相对标准偏差，结果分别为1.06%和0.31%，表明色谱仪器精密度良好。准确称取同一种库鲁木提草样品5份，每份约1.0g，按实验部分的提取方法制备库鲁木提草供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，计算库鲁木提草提取液中的柚皮苷和木犀草素质量分数的相对标准偏差分别为1.64%和0.54%，实验结果表明提取方法和测定重复性良好。1252.6稳定性试验同一种库鲁木提草样品溶液，分别放置0、2、4、6、8、12、24h后，按优化的色谱分离条件下进样检测。计算柚皮苷和木犀草素峰面积的相对标准偏差，结果分别为1.86%和0.73%。结果表明样品提取溶液在24h内稳定性良好。2.7回收率试验130准确称取野生库鲁木提草样品粉末6份，每份0.5g，分别按低、中、高量精密加入柚皮苷和木犀草素的标准品溶液，按实验部分制备加标样品溶液和优化的色谱条件检测，通过标准曲线法计算回收率。结果表明柚皮苷和木犀草素平均回收率分别为95.3%和99.2%，相对平均偏差分别为3.5%和1.9%，实际样品分析结果如表2所示。表2库鲁木提草样品的加标回收率135Tab.2SpikedrecoveriesoftheHymenolymananasamplesAverageComponentAdded/mgFound/mgRecovery/%RSD/%recovery/%Naringin12.0040.9091.595.33.5柚皮苷12.0041.5096.518.0046.7793.618.0046.4691.924.0053.6098.724.0053.8499.7Luteolin1.754.2796.699.21.9木犀草素1.754.35101.12.635.1597.72.635.1898.93.506.13101.43.506.0699.4-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn2.8样品测定分精密吸取按实验部分萃取方法制备的野生和人工栽培库鲁木提草供试品溶液10μL进样，注入色谱仪，按优化的高效液相色谱分离条件测定，平行做5次。记录柚皮苷和木犀草素的峰面积并计算含量，分析结果见表3，可以看出野生库鲁木提草中柚皮苷为人工栽培140样品含量的1.75倍，木犀草素含量是人工栽培样品含量的2.97倍。两种被测物含量结果表明野生库鲁木提草的品质由于人工栽培库鲁木提草。表3样品中柚皮苷和木犀草素的测定结果Tab.3ContentresultsofnaringinandluteolininsampleSampleNaringin/（mg/g）Luteolin/（mg/g）野生样品59.83±1.055.16±0.03Wildsample人工栽培样品34.11±0.621.74±0.01Cultivatedsample3结论145本文建立了库鲁木提草中柚皮苷和木犀草素两种活性成分的提取和检测方法，选择新疆南疆野生及人工栽培库鲁木提草，以80%甲醇水溶液为提取剂，通过浸泡、超声处理实现高效提取。同时，优化了柚皮苷和木犀草素的高效液相色谱检测条件，两种活性成分在40min内实现良好的基线分离。建立的分析方法简便、重现性好、准确较高，能够同时用于库鲁木提草中柚皮苷和木犀草素含量的测定，实验结果发现这两种活性成分在野生库鲁木提草比在150人工栽培库鲁木提草的含量更高，说明野生库鲁木提草具有更高的药用价值。本工作为库鲁木提草的质量评价提供了一个可靠的依据，并为库鲁木提草资源的深度开发利用及药用研究提供一定的数据支持。建立的方法对其他民族药物分析和检测具有一定的借鉴意义。[参考文献](References)155[1]费勇，夏榆，吴玉虎．喀喇昆仑山－西昆仑山地区的药用植物资源[J]．中国野生植物，1990，7(2):26-27．[2]武素功，费勇，夏榆，等．喀喇昆仑山－昆仑山植物区系的一般特征及植物资源的保护与开发利用[J]．自然资源学报，1990，5(4)：376-382.[3]朱光辉，张磊，牛新民，等.矮膜苞芹的降血糖作用研究[J].新疆农业大学学报2015,38(3):237～240.[4]王海燕，梁利香，李娟，等.柚皮苷脂质体凝胶的处方制备工艺及质量控制研究[J].中国药房，2015，16026（34）：4856-4859.[5]陈锦杭，区硕俊，杨展鹏，等.柑橘皮柚皮苷提取工艺研究[J].应用化工,2016,45(3):508-510[6]许方驰，潘思轶.响应面分析溪蜜柚果皮中柚皮苷的醇提取工艺[J].食品工业科技，2016，37（11）:238-241.[7]王月华，李爱峰，付崇罗，等.木犀草素抗肿瘤活性研究[J].时珍国医国药，2016，27（7）：1587-1590.[8]王继双，何焱，张文静，等.木犀草素的药理作用研究进展[J].生命科学，2013，25（6）:560-565.165[9]石上梅.逐步完善中药质量标准体系和质量控制模式解读2015年版中国药典(一部)[J].中国药学杂志2015，50（20）：1752-1753.[10]牛晓雪，崔旭盛，苏贺，等.高效液相色谱法同时测定忍冬中7种成分[J].色谱，2012，30（2）：211-214.[11]木合塔尔吐尔洪，热萨莱提.伊敏，楚刚辉，等.液相色谱法同时测定维药蜀葵花中芦丁槲皮素和山柰酚[J].色谱，2015，33（12）：1269-1273170[12]叶晓岚，宋粉云，范国荣，等.高效液相色谱法同时测定广陈皮药材中的11种化学成分[J].色谱，2015,33（4）：423-427.-6- 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