HPLC同时测定三黄片中盐酸小檗碱、黄芩苷和大黄素的含量.pdf 7页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnHPLC同时测定三黄片中盐酸小檗碱、黄芩#苷和大黄素的含量**李映，屠鹏飞，王金铃5（北京中医药大学中药学院）摘要：目的:建立HPLC法同时测定盐酸小檗碱、黄芩苷和大黄素素含量的方法并用于测定三黄片中三种主要药效成分的含量。方法:采用AgilentC18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，流动相为乙腈-0.5%磷酸溶液(三乙胺调pH4.0)，梯度洗脱，流速1mL·min-1，检10测波长275nm。结果:盐酸小檗碱、黄芩苷的线性范围为1-30μg∙mL-1、大黄素的线性范围为0.5-15μg∙mL∙mL-1,方法回收率均不低于95%。结论:该方法简便、准确、重复性好，定量限低并且能排除其他成分的干扰，可用于三黄片的质量控制的评价。关键词：三黄片；小檗碱；黄芩苷；大黄素；高效液相色谱。中图分类号：R94315SimultaneousDeterminationofBerberineHydrochloride、BaicalinandEmodininSanhuangTabletsbyHPLCLiYing,TuPengfei,WangJinling(SchoolofChineseMateriaMedica,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing,100102)20Abstract:Objective:ArapidandspecificHPLCmethodwasdevelopedfortheanalysisofberberinehydrochloride,baicalinandemodin．ThemethodwasappliedtostμdythecontentdeterminationofSanhuangTabletscontainingberberinehydrochloride,baicalinandemodin．Method:TheanalysiswascarriedoutonaAgilentC18reversed-phasecolumn(4.6mm×250mm，5μm)bygradientelutionwithacetonitrileand0.5%phosphoricacid(adjustedpH4.0withtriethylamine).Theflowratewas1.025mL·min-1andthedetectionwavelengthwassetat275nm．Results:Linearresponseswereobtainedforberberinehydrochlorideandbaicalinrangingfrom1to30μg∙ml-1,emodinrangingfrom0.5to15μg∙ml-1.Theextractionrecoveryrangedfrom95.83%–100.09%.Stabilitystudiesshowedthatberberinehydrochloride,baicalinandemodinwerestableinpreparationandanalyticalprocess．Conclusion:Theresultsindicatedthatthevalidatedmethodwassuccessfullyusedto30determinetheconcentrationofberberinehydrochloride,baicalinandemodin．Keywords:nanoparticles;oraladministration;gastrointestinalabsorption;transportmechanism;bioavailability350引言三黄片为2010版《中国药典》收藏药物，由盐酸小檗碱、黄芩浸膏及大黄[1]组成，具有清热解毒、泻火通便的作用，为临床常用药物。黄芩苷、小檗碱和大黄素为三黄片中的主要有效成分，但是药典中只规定了三种成分单独测定的方法并未给出三种成分同时测定的方法，文献中报道较多的也是对黄芩苷、盐酸小基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（20130013120008）作者简介：(1990-),女，硕士研究生，主要研究方向：中药制剂新技术与新剂型研究通信联系人：王金铃(1985-),女,助理研究员,主要研究方向:中药制剂新技术与新剂型研究.E-mail:wangjinling22@163.com-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn[2-8]40檗碱及大黄素单一成分或某两个成分的含量测定，对三种成分同时测定的研[9–11]究较少。本研究在文献的基础上对同时测定三种成分的方法进行了改进，为进一步有效控制药品质量，完善质量标准提供依据。1仪器与试药1.1仪器45Aglient1260高效液相色谱仪(二极管阵列检测器、四元泵、标准型自动进样器和C181色谱柱(4.6mm×150mm，5μm))；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；DZG-303A超纯水机（艾柯公司）；精密电子天平（0.01mg），购自梅特勒-托利多（METTLERTOLEDO）公司。1.2试药50黄芩苷对照品，购自金测分析技术天津有限公司，纯度98%；盐酸小檗碱对照品，购自中国药品生物制品检定所，纯度98%；大黄素对照品，购自成都曼斯特生物科技有限公司，纯度98%；三黄片，购自山东健民药业有限公司，生产批号为Z37021352。乙腈和甲醇均为色谱纯，购自赛默飞世尔（中国）科技有限公司；、磷酸及三乙胺均为分析纯，市售；水为超纯水，自制。552方法与结果2.1对照品溶液的制备精密称取黄芩苷、小檗碱和大黄素对照品适量，分别用无水甲醇定容，得黄芩苷、小檗碱和大黄素的浓度分别为1.160、1.060及0.750mg/ml的对照品溶液。精密吸取上述单组分对照品溶液黄芩苷1.29ml、小檗碱1.42ml、大黄素601ml混合，并定容至5ml，配成混合对照品，备用。2.2供试品溶液的制备取市售三黄片20片，除去包衣，精密称定，研细过60目筛。精密称取适量（相当于一片的重量)，加入10.0ml无水甲醇，称重，超声处理(功率的250W，频率40kHz)30min，放冷，称重，用无水甲醇不足失去的重量，过滤，并-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn65用无水甲醇定容至10ml容量瓶中，作为样品溶液。2.3阴性对照溶液的制备根据《中国药典》一部规定的处方量和提取方法,按照“2.1.2”项下的方法分别制备缺黄芩、小檗碱和大黄的阴性对照品。2.4色谱条件70色谱柱为C18(4.6mm×150mm，5μm)；流动相为A-乙腈，B-0.5%磷酸（三乙胺调PH值为4.0），梯度洗脱，洗脱程序为：0-14minA(%)25，B(%)75；14-15minA(%)25-90，B(%)75-10；15-20minA(%)90，B(%)10；20-21minA(%)25，-1B(%)75。流速为1ml∙min；检测波长为275nm，进样量为10μl。2.5方法学考察752.5.1方法专属性取适量对照品溶液、样品溶液和阴性溶液，按色谱条件进行测定，记录色谱图，考察方法专属性。对照品、供试品溶液、阴性对照溶液的HPLC见图1，从图中可以看出，各个化合物分离良好，色谱峰的分离度均＞1.5，色谱峰理论塔板数均＞4000，黄芩苷、小檗碱和大黄素的出峰时间分别为5.43，13.41和19.5380min。2.5.2方法专属性精密吸取混合对照品0.03、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1ml于10ml容量瓶内，用无水甲醇定容至10ml，编号为S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7;按“2.1.4”项下的色谱条件，分别进样10μl，以峰面积(Y)对进样浓度(X)进行线性拟合，计算85回归方程。三种化合物的线性方程见表1。表明，盐酸小檗碱、黄芩苷和大黄素在各自浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图1三黄片的HPLC色谱图（A三者对照品；B三黄片样品溶液；C缺少小檗碱的阴性对照；D缺少黄芩苷的阴性对照；E缺少大黄素的阴性对照。1.黄芩苷；2.小檗碱；3大黄素）90Fig.1HPLCspectrumofSanhuangtablets(A:references;B:samplesofSanhuangtablet;C:referenceswithoutberberine;D:referenceswithoutbaicalin;Ereferenceswithoutemodin.1.berberine,2baicalin,3emodin)95-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn表1三黄片中盐酸小檗碱、黄芩苷和大黄素的线性回归方程Table1Theconcentrationrageofberberine,baicalinandemodininSanhuangtablet组分回归方程相关系数线性范围(μg/ml)盐酸小檗碱Y=62.045X-18.8360.99911-30黄芩苷Y=33.798X-18.8360.99931-30大黄素Y=18.111X+4.99120.99900.5-152.5.3精密度考察精密量取混合对照液适量，按上述色谱条件进行分析，重复进样6次，每100次进样10μl，计算小檗碱、黄芩苷和大黄素峰面积的RSD分别为0.66%、0.09%和0.1%，表明精密度良好，满足含量测定要求。2.5.4稳定性考察精密吸取同一样品溶液10μl，分别于0、2、4、6、8、10和24h进样测定，计算得黄芩苷、小檗碱及大黄素峰面积的RSD分别为0.53%、0.16%、1050.71%。说明供试品溶液在24h内稳定。2.5.5重复性考察取同批号的样品6份，按“2.1.2”项下方法制成供试品溶液，在上述色谱条件下进样10μl，测定，计算得黄芩苷、小檗碱及大黄素的RSD值分别为0.38%、0.05%和0.17%，表明本法重复性良好。1102.5.6回收率实验准确称取已测知含量的三黄片样品粉末6份，质量分别为19.97mg、19.18mg、20.03mg、19.85mg、19.63mg、19.78mg分别加入黄芩苷、小檗碱及大黄素对照品溶液适量，按“2.1.2”项下处理制备供试品溶液，按照2.1.4项下色谱条件进样10μl，计算平均回收率和RSD。结果小檗碱的平均回收率为100.09%，115RSD为2.67%；黄芩苷的平均回收率为95.83%，RSD为4.24%；大黄素的平均回收率为96.65%，RSD位3.77%。2.6样品的含量测定取三黄片，按“2.1.2”项下的方法制备样品溶液，并按色谱条件进行HPLC分析，测定三黄片中黄芩苷、小檗碱和大黄素的含量。结果见表2。120表2三黄片中小檗碱、黄芩苷和大黄素的含量测定结果（n=3）-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnTable2thecontentdeterminationofberberine,baicalinandemodininSanhuangtablet(n=3).组分平均含量（mg/片）RSD(%)小檗碱21.780.27黄芩苷4.723.29大黄素0.331.663讨论3.1检测波长的选择本实验所测定的3种指标成分具有不同的化学结构,其紫外吸收亦不相同,125为了保证各成分都具有适宜的灵敏度和精密度,我们研究了黄芩苷、小檗碱及大黄素在流动相中的紫外区吸收特性,通过全波长扫描发现黄芩苷在200nm及275nm波长处有最大吸收，小檗碱在220nm及280nm处有最大吸收，而大黄素在200及275nm处吸收较大，三种成分在275nm左右均具有最大吸收，并且在275nm时检测的峰形、分离度、各色谱峰之间的距离、峰强度及图谱的基线最佳,且130在此波长下阴性样品没有干扰。因此本研究采用275nm作为检测波长。3.2流动相的选择由于本实验所测定的指标成分大黄素为游离蒽醌,极性较小,不溶于水,而黄芩苷、盐酸小檗碱分别为黄酮类和生物碱类化合物,极性较大,不易溶于极性小的溶剂,因此为了同时得到3种指标成分满意的提取结果,选择甲醇为提取溶剂,根[2]135据文献,选择了超声30min的提取方法,方法回收率表明该提取方法符合分析的要求。4研究的意义与创新之处本研究的意义在于：1、建立了测定三黄片中黄芩苷、小檗碱和大黄素含量的高效液相色谱法，经方法学验证该方法的的精密度、稳定性和回收率均符合要求，适合测定3种化140合物的含量。2、实现了黄酮类、生物碱类、蒽醌类三类化合物的同时测定。[9-11]与文献相比本研究的创新之处在于：1、降低了对仪器的要求，只需要二元梯度洗脱，在一般的紫外检测器上就能完成；2、通过梯度洗脱，缩短了测定时间，又保证了良好的分离。-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn致谢（可选）145感谢高等学校博士学科点专项科研基金（20130013120008）的支持。[参考文献](References)[1]国家药典委员会．中华人民共和国药典．一部［S］.北京:中国医药科技出版社,2010:243–215.[2]祝忠民,卢晓荣.HPLC法同时测定三黄片中4种成分的含量[J].西北药学杂志,2008,23(5):300-301.150[3]李文霞,宋平顺.HPLC法同时测定三黄片中黄芩苷和盐酸小檗碱的含量[J].药学进展,2013,35(4):178.[4]李建勋,张亮,王淑珍.HPLC法同时测定三黄片中盐酸小粟碱与黄等普的含量[J].中国药师,2005,8(6):479.[5]霍永昌,高卫东.HPLC测定三黄片中黄芩苷的含量[J].中国现代中药,2010,12(7):36.[6]李淑盈,郭增军,王利.HPLC测定三黄片中大黄素、大黄酚及黄芩苷的含量[J].中成药,2001,23(6):445.155[7]刘翠哲,刘喜纲,陈大为,等.RP-HPLC测定三黄片中黄芩苷的含量[J].中成药,2005,27(9):1116.[8]张宇洁,井艳.RP-HPLC法测定三黄片中黄芩苷和小檗碱的含量[J].安徽农业科学,2013,41(17):7456–7458.[9]田书霞，蒋晔.RP-HPLC同时测定三黄片中4种有效成分的含量[J].中国药学杂志,2006,41(3):220.[10]解军波,张彦青,戚务勤.RRLC-MS/MS法测定三黄片中小檗碱、黄芩苷和大黄素[J].中草药,2010,16041(5):740.[11]冯有龙,余伯阳,董小平.高效液相色谱法同时测定三黄片中的蒽醌类、黄酮类及生物碱类化合物[J].药学学报,2006,41(3):285–288.-7-'