Lnc-LEMGC调控ErbB信号通路抑制胃癌浸润、转移的研究.pdf 9页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnLnc-LEMGC调控ErbB信号通路抑制胃癌浸#润、转移的研究122**张慧，马冉冉，高鹏5（1.山东大学齐鲁医院病理科，济南，250012；2.山东大学医学院病理教研室，济南，250012）摘要：目的：探究长链非编码RNAlnc-LEMGC在胃癌转移及浸润中的作用及机制。方法：使用实时定量PCR检测lnc-LEMGC在胃癌标本及细胞株中的表达。体外细胞实验及体内动10物实验验证lnc-LEMGC对胃癌细胞浸润转移能力的影响。基因芯片筛选lnc-LEMGC调控的下游信号通路并利用westernblot实验进一步验证。结果：lnc-LEMGC在发生淋巴结转移的胃癌组织及转移性胃癌细胞株中表达下调。体内外功能学实验证实lnc-LEMGC可以抑制胃癌细胞的浸润、转移能力。信号通路分析发现lnc-LEMGC通过调控ErbB发挥抑癌作用。结论：lnc-LEMGC通过抑制ErbB信号通路发挥抑制胃癌细胞浸润、转移的作用。15关键词：基础医学；胃癌；转移；lnc-LEMGC；ErbB信号通路中图分类号：R3Lnc-LEMGCinhibitsthemetastasisviatargetingErbBsignalingpathwayingastriccancer12220HuiZhang,RanranMa,PengGao(1.DepartmentofPathology,QiluHospital,ShandongUniversity,Jinan,China;2.DepartmentofPathology,SchoolofMedicine,ShandongUniversity,Jinan,China)Abstract:Gastriccancer,headingthelistofdigestivesystemmalignanttumors,iscommonworldwidenow.Invasionandmetastasisofgastriccanceristheleadingcauseofdeathinpatientswithgastric25cancer.Wefoundthatlnc-LEMGCwasoneofthemostdownregulatedlncRNAsingastriccancertissueswithlymphnodemetastasisbyreal-timequantitativePCR(RT-qPCR).Integratedsearchaboutlnc-LEMGCgeneticcharacteristicsinonlinewebsiteshowedthatlnc-LEMGCwaslocatedonchromosome1q-arm,withlittleconservationbetweenspeciesandnoencodingproteinsability.Functionalanalysisrevealedthatlnc-LEMGCinhibitedgastriccancercellmigrationandinvasionboth30invitroandinvivo.Furthermore,mRNAexpressionmicroarrayrevealedthatlnc-LEMGCregulatedErbBsignalingpathway(especiallyTGFα-ErbB1-Src-FAKsignalpathway),whichwereassociatedwithcellmigrationandinvasionincancer.Thedataindicatethatlnc-LEMGCcouldinhibitthemetastasisofgastriccancerviatargetingErbBsignalingpathway.Keywords:preclinicalmedicine;gastriccancer;metastasis;lnc-LEMGC;ErbBsignalingpathway350引言[1]胃癌是全球常见的恶性肿瘤之一，居消化系统肿瘤之首。虽然近年来对胃[2]癌的诊治水平有一定的提高，但是患者的预后仍差。浸润和转移是导致胃癌患40者死亡的主要原因，该过程是多基因、多步骤、多信号传导通路异常的共同结果。深入探索胃癌浸润、转移机制，并在此基础上寻找新的治疗靶点成为当前的研究基金项目：2013年度教育部高等学校博士点专项科研基金（博导类）（20130131110052）作者简介：张慧（1986年-），女，医师，主要研究方向：胃癌浸润、转移通信联系人：高鹏（1972年-）男，教授，博导，主要研究方向：胃癌浸润、转移.E-mail:gaopeng@sdu.edu.cn-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn热点。既往的研究报道了胃癌发生、发展的分子基础，特别是编码基因原癌基因[3]的激活或（和）抑癌基因的失活与肿瘤发生转移密切相关。随着测序技术的发展，占转录本比例更高的非编码RNA，尤其是microRNA（miRNA）和长链非[4]45编码RNA（longnon-codingRNA,lncRNA）逐渐引起研究者的关注。现已证实[5]miRNA在胃癌的浸润、转移过程中发挥重要的调控作用。然而，已发现的功能性lncRNA仍然是少数，胃癌转移相关的lncRNA的研究尚为空白。前期我们利用lncRNA芯片高通量筛选出lnc-LEMGC在未转移的胃癌组织中高表达。本研究在此基础上验证lnc-LEMGC在大样本中的表达水平并研究其50生物学功能及调控胃癌细胞浸润、转移的作用机制。1材料与方法1.1胃癌标本收集及纯化胃癌组织取自山东大学齐鲁医院（2012年9月到2013年12月），共收集转移的胃癌50例、非转移的胃癌标本26例。新鲜样本进行冰冻切片，苏木素染55细胞核后，用1ml注射器在显微镜下挑取胃腺癌细胞收集到无酶EP管中待用。1.2细胞株本实验所用胃癌细胞系MKN28、MKN45、BGC823、SGC7901、KATOIII，人永生化非肿瘤胃粘膜细胞系GES均按常规方法培养。lnc-LEMGC稳定过表达SGC7901细胞株由本课题组构建。601.3RNA提取及实时定量PCR检测在显微切割后的组织标本及胃癌细胞株中加入lmlTrizol进行RNA提取。使用ReverTraAceqPCRRTKit、RocheUniversalSYBRGreenMaster分别进行cDNA模板的合成及实时定量PCR检测。1.4生物信息学预测65LncRNALEMGC编码潜能的在线分析：http://cpc.cbi.pku.edu.cn/LncRNALEMGC开放阅读框在线查找：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html1.5细胞转染真核表达质粒pEGFP-C1（Clontech）由本实验室保存；lncRNAlnc-LEMGC-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn70过表达质粒由本课题组构建，pGPH/RFP/Neo购自上海吉玛生物科技有限公司。对数生长期的BGC823和SGC7901细胞接种在6孔板中，待细胞密度达到50%-60%后，使用Lipofectamine2000按照操作步骤，分别混匀脂质体、无血清1640培养基和质粒(1µg)，或siRNA（终浓度为50nM）及它们各自的阴性对照，室温孵育20min，加入细胞培养孔中，轻轻混匀。孵箱内培养4-6h后，更换新75鲜有血清培养基继续培养后进行下一步实验。1.6细胞迁移、浸润实验[6]迁移浸润实验参照说明书进行，见本课题组已发表的文章。1.7构建稳定表达lnc-LEMGCSGC7901细胞株SGC7901细胞按10%的密度接种到48孔板，将pGPH/RFP/Neolnc-LEMGC80过表达质粒转染到SGC7901细胞系，利用G418筛选过表达lnc-LEMGC的SGC7901细胞。1.8建立裸鼠远处转移模型实验动物购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于动物中心提供的实验动物隔离设备，动物使用遵守《实验动物管理条例》。设立慢病毒感染的85lncRNALEMGknockdownBGC823细胞组和稳定筛选得到的lncRNALEMG5SGC7901两个实验组，选用4周龄雄性Nu/Nu裸鼠。每只裸鼠注射3×10个胃癌细胞准备，0.2mlPBS重悬细胞后接种于裸鼠尾静脉，接种后约6-7周。按照裸鼠体重，腹腔注射10%水合氯醛麻醉裸鼠。利用小动物活体成像系统观察脏器的转移情况。处死裸鼠，分离脏器并分别利用小动物活体成像系统观察各脏器的90转移灶。瘤体用于常规切片制作并进行HE染色，显微镜下观察并记录转移灶的数目及大小。1.9全基因组检测、Westernblot全基因组检测芯片为Roche公司的humangene芯片，使用平台为Aglilent技术平台。Westernblot按常规方法进行，利用扫膜仪曝光扫描拍照。所用抗体95信息如下：ErbB1（1:1000，SangonBiotech，Ab-1071），c-Src（1:800，Proteintech，20583-1-AP），FAK（1:1000，Proteintech，12636-1-AP），磷酸化FAKp-FAK（1:1000，CellSignaling，#3283），β-actin鼠单克隆抗体（1:1000，中杉金桥）。-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn1.10统计分析本研究的统计学分析采用GraphPadPrism5(GraphPadSoftware,Inc.,San100Diego,CA)软件，两组或两组以上计量数据采用Student’st-test或one-wayANOVA分析。所有数据分析以P<0.05有统计学意义。2结果2.1lnc-LEMGC在发生转移的胃癌组织和转移性细胞中表达下调前期本课题组利用基因芯片筛选发现lnc-LEMGC在转移组胃癌组织中表达105水平降低。首先，利用Real-timePCR在大样本中检测lnc-LEMGC的表达水平，与前期芯片结果一致，lnc-LEMGC在转移胃癌组织中表达量低于未转移胃癌组织（图1A）。如图1B，我们进一步检测了lnc-LEMGC在多种胃癌细胞株中的表达情况。lnc-LEMGC在转移性胃癌细胞SGC7901中表达量较非转移性胃癌细胞株低。lnc-LEMGC在临床样本和胃细胞株中的表达情况提示，lnc-LEMGC在110可能抑制胃癌浸润、转移。图1lnc-LEMGC在胃癌中的表达Fig1Expressionoflnc-LEMGCingastriccancertissuesandgastriccancercells2.2不具备编码潜能的lnc-LEMGC是稳定表达在细胞中的长链非编码RNA115我们利用UCSC、NCBI、Ensemble网站对lnc-LEMGC进行基因学特征的综合检索。lnc-LEMGC是基因间长链非编码RNA，位于1号染色体（图2A）。通过在线软件分析，lnc-LEMGC包含小的开放阅读框但全序列不具备编码潜能（图2B-C）。我们利用放线菌素D检测lnc-LEMGC的稳定性，与阳性对照c-Myc相比，lnc-LEMGC在细胞中的稳定性较好，放线菌素D抑制RNA聚合酶的功-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn120能，阻止新的RNA合成，lnc-LEMGC仍能长久稳定的存在于细胞中（图2D）。图2lnc-LEMGC的基因信息Fig2lnc-LEMGCgeneticcharacteristics2.3lnc-LEMGC在体外实验中能够抑制胃癌细胞的迁移、浸润的能力125Transwell小室实验表明，过表达lnc-LEMGC后，SGC7901和BGC823细胞迁移、浸润能力明显降低（图3A-C）；而干扰lnc-LEMGC后，SGC7901和BGC823细胞的转移能力明显增强（图3D-F）。-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图3lnc-LEMGC的体内生物学功能130Fig3Rolesoflnc-LEMGCingastriccancercells2.4lnc-LEMGC在体内实验中能够抑制胃癌细胞的迁移、浸润的能力为了进一步研究lnc-LEMGC在体内的功能，我们构建了lnc-LEMGC高表达的SGC7901稳定细胞系及lnc-LEMGCknockdown的BGC823细胞系。裸鼠尾静脉注射肿瘤细胞后，小动物活体成像记录胃癌细胞远处器官转移的情况。135lnc-LEMGC稳定表达的细胞系和lnc-LEMGCknockdown的BGC823细胞系均出现肺脏转移的现象。与对照组相比，lnc-LEMGC高表达的SGC7901，肺脏转移灶少（图4A-C）。干扰lnc-LEMGC后，BGC823细胞形成的肺脏转移灶增多（图4D-F）。动物实验表明，lnc-LEMGC在体内抑制胃癌细胞的浸润、转移。-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn140图4lnc-LEMGC的体内生物学功能Fig4Rolesoflnc-LEMGCinmousemodels2.5lnc-LEMGCs调控的下游ErbB信号通路为了更全面的了解lnc-LEMGCs调控的下游靶基因（或信号通路），我们选用mRNA芯片检测lnc-LEMGC在SGC7901中过表达48h后，mRNA表达模式145的变化，并根据相关mRNA表达水平的变化与已知的信号通路联系起来。芯片结果显示，在lnc-LEMGC过表达后，有2173条mRNA上调，有2565条mRNA下调（图5A）。对差异表达的mRNA进行Pathway分析，ErbB信号通路被抑制，其中多个标志性蛋白发生差异表达。TGFα-ErbB1-Src-FAK信号通路上出现连续性基因变化（图5B）。我们利用Real-timePCR及其Westernblot在胃癌细150胞中进一步验证了，lnc-LEMGC过表达可以抑制ErbB信号通路中TGFα-ErbB1-Src-FAK通路的活性（图5C-D）。-7- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图5ErbB信号通路是lnc-LEMGC的下游通路Fig5ErbBpathwayisadownstreamtargetoflnc-LEMGC1553结论原发性未转移的肿瘤和转移性肿瘤的癌细胞生物学异质性是治疗转移的主要障碍。全面了解癌细胞恶性转化的基因调控网络是非常必要的，lncRNA研究的[7,8]广泛开展为胃癌转移分子机制的研究提供新的高度。本研究通过Real-timePCR技术在大样本新鲜组织和胃癌细胞中验证了lnc-LEMGC在转移的胃癌标本160及转移性胃癌细胞中表达降低。体外细胞学实验表明，lnc-LEMGC过表达能够抑制胃癌细胞的浸润、转移的能力，抑制lnc-LEMGC表达促进胃癌细胞的侵袭、转移能力，并且在SGC7901、BGC823两种细胞系中都得到相同的结果。为模拟lnc-LEMGC在体内的功能，我们选择用SGC7901、BGC823两种细胞系建立动物模型。并且两种稳定表达165的细胞系来源于不同的稳筛体系。lnc-LEMGC稳定过表达的SGC7901细胞是由过表达质粒按照常规转染的步骤转染，通过G418筛选后进行流式分选得到的。lnc-LEMGC稳定干扰的BGC823细胞是由LV-shlnc-LEMGC慢病毒感染细胞得到的。动物活体成像仪检测发现，lnc-LEMGC干扰组的荧光强度高于对照组，-8- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnLV-shlnc-LEMGC慢病毒组的荧光强度高于对照组。通过裸鼠肺部HE切片观察170发现，lnc-LEMGC干扰组的肺部转移灶较对照组多，具有统计学意义。综上所述，体外细胞学和体内动物实验一致性证实，lnc-LEMGC能够抑制胃癌细胞的浸润、转移。为更全面了解lnc-LEMGC调控的靶基因，我们将lnc-LEMGC在SGC7901细胞中过表达后得到mRNA表达谱，并通过pathway分析发现ErbB信号通路多175个核心蛋白出现差异表达，Real-timePCR及Westernblot验证了芯片的可靠性。TGFα-ErbB1-Src-FAK信号通路调控肿瘤细胞的浸润转移。因此，lnc-LEMGC通过调控该信号通路的激活抑制胃癌细胞的转移。综上，我们的研究阐明了lncRNA通过调控ErbB信号通路抑制胃癌细胞浸润转移。该课题不仅扩展了lncRNA在胃癌中的研究，也为今后胃癌转移相关180lncRNA的研究建立基础平台。[参考文献](References)[1]AlemanJO,EusebiLH,RicciardielloL,etal.Mechanismsofobesity-inducedgastrointestinalneoplasia[J].Gastroenterology,2014,146:357-373.185[2]JayaveluND,BarNS.Metabolomicstudiesofhumangastriccancer:review[J].WorldJGastroenterol,2014,20(25):8092-8101.[3]GuptaGP,Massague′J.Cancermetastasis:buildingaframework[J].Cell,2006,127:679-695.[4]AndersonSK.Probabilisticbidirectionalpromoterswitches:noncodingRNAtakescontrol[J].MolTherNucleicAcids,2014,3:e191.190[5]MukherjiS,EbertMS,ZhengGX,etal.MicroRNAscangeneratethresholdsintargetgeneexpression[J].NatureGenet,2011,43:854-859.[6]GaoP,WongCC,TungEK,LeeJM,WongCM,NgIO.DeregulationofmicroRNAexpressionoccursearlyandaccumulatesinearlystagesofHBV-associatedmultistephepatocarcinogenesis[J].JHepatol,2011,54(6):1177-1184.195[7]PontingCP,OliverPL,ReikW.EvolutionandfunctionsoflongnoncodingRNAs[J].Cell,2009,136(4):629-41.[8]MitchellGuttman,JohnL.Rinn.Modularregulatoryprinciplesoflargenon-codingRNAs[J].Nature,2012,482(7385):339-346.-9-'