GDF11在肺癌患者血清中的表达及对肺癌细胞生长的影响.pdf 9页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnGDF11在肺癌患者血清中的表达及对肺癌细胞生长的影响12341**李素素，段卫明，赵晓岚，孙闯，周新文5（1.苏州大学放射医学与防护学院；2.苏州大学附属第一人民医院肿瘤科；3.福建省漳州市第三人民医院放疗科；4.镇江船艇学院装备保障）10摘要：目的研究GDF11在肺癌中的表达及其在肺癌中的功能。方法收集肺癌患者血清样本，ELISA法检测血清中GDF11的含量，并分析其与肺癌病理学的关系。用15%肺癌患者血清与DMEM培养基混合后培养A549、H1299细胞，CCK8法检测细胞在24、48、72h时OD值的变化。转染GDF11表达载体为实验组，转染空载质粒为对照组，使用CCK8法检测A549以H1299细胞的生长，克隆形成实验检测其对克隆形成的影响。结果肺癌患者血15清中GDF11的含量与患者性别（F=1.855，P＞0.05）、淋巴结转移无关（F=0.050，P＞0.05）。而血清中GDF11含量高低与分化程度（F=24.567，P＜0.08）、年龄（F=3.980，P＜0.05）具有显著的相关性。肺癌患者血清培养的结果显示，GDF11含量高的血清组，培养细胞48h(F=3.975P＜0.05)和72h(F=11.900P＜0.05)时显著地抑制了A549细胞的生长，但对H1299细胞的生长无影响。此外，转染GDF11后24h(t=8.3，P＜0.05)、48h（t=4.857，P＜200.05)都显著地抑制了A549细胞的生长。同时，高表达GDF11可以抑制A549细胞的克隆形成，但对H1299细胞无影响。结论肺癌患者血清中GDF11的含量与其病理学恶性程度和病患年龄相关。高表达GDF11可以抑制A549细胞的生长。关键词：肺癌；GDF11；血清；A549；H1299中图分类号：R734.225ExpressionofGDF11inserumofpatientswithlungcanceranditseffectoncellgrowth12341lisusu,duanweiming,zhaoxiaolan,sunchuang,zhouxinwen(1.SoochowUniversity,Instituteofradiationmedicineandprotection;302.Thefirstpeople"shospitalaffiliatedtoSuzhouuniversity,oncology;3.Zhangzhouinfujianprovincethethirdpeople"shospital,departmentofradiotherapy;4.Zhenjianginstituteofboats,equipmentsupport)Abstract:TostudytheexpressionandfunctionofGDF11inlungcancer.MethodTheserumsamplesofpatientswithlungcancerwerecollectedandthecontentofGDF11inserumwasdetectedbymethod35ELISA.CellA549andH1299wereculturedin15%serumofpatientswithlungcancer,andthechangesofODvalueafter24,48and72hweredetectedbymethodCCK8.Effectsofup-regulatedGDF11expressiononthegrowthandcloneformationofcellA549andH1299werestudied.ResultsTheresultsofELISAshowedthatthecontentofGDF11inserumofpatientswithlungcancerwasnotrelatedtosex（F=1.855，P＞0.05）andlymphnodemetastasis（F=0.050，P＞0.05）.Thecontentof40GDF11inserumwassignificantlyrelatedtothedifferentiationdegreeofcancer（F=24.567，P＜0.08）andtheage（F=3.980，P＜0.05）ofpatients.TheresultsofCCK8showedthatintheserumgroupwithhighcontentofGDF11,thegrowthofcellA549wassignificantlyinhibitedafter48h(F=3.975P＜0.05)and72h(F=11.900P＜0.05),butthegrowthofcellH1299wasnotaffected.Inaddition,theup-regulationoftheexpressionofGsignificantlyinhibitedthegrowthofcellAafter24h(t=8.3，P＜450.05)and48h（t=4.857，P＜0.05),whichwasconsistentwiththeresultsofserumculture.ThecloneformationexperimentshowedthatthehighexpressionofGDF11couldinhibittheformationofcell作者简介：李素素（1991）性别：女学历：硕士研究生职称：在读学生主要研究方向：肺癌细胞的生长、侵袭及转移通信联系人：周新文，男，教授，硕导.E-mail:xwzhou@suda.edu.cn-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnA549,butcellH1299wasnotaffected.ConclusionThecontentofGDF11inserumofpatientswithlungcancerisrelatedtothepathologicalchanges.AndthehighexpressionofGDF11hasbeenconfirmedtobeabletoinhibitthegrowthofA549cells.50Keywords:lungcancer;GDF11;Serum;A549;H12990引言肺癌是危害人类健康和生命的恶性肿瘤之一。2010年，世界卫生组织国际癌症研究署发布报告显示，2008年全球肺癌新发病例预测约161万例，死亡约138万例，分别占恶性肿［1－2］55瘤新发病例及死亡病例的13%及18%，居恶性肿瘤第一位。目前，尽管肺癌的研究取得了巨大的进步，但5年的生存率仍然小于15%。因此，迫切需要进一步探究肺癌的发病机制和新的干预治疗技术来改善当前的现状。生长分化因子11(growthdifferentiationfactor11，GDF11)又称为骨形态发生蛋白11(bonemorphogeneticprotein11，BMP11），既属于TGF-β超家族成员,也属于骨形态蛋白亚家族蛋［3］60白。新近的研究表明GDF11不仅能调控胚胎期神经，骨骼等组织器官的发育，而且其还［4～6］具有“返老还童”的功能。其可以逆转心脏，骨骼肌等器官老化，改善大脑认知的功能，［7］且发现GDF11的表达水平随着年龄的增加逐渐降低。而GDF11在肺癌患者血清的含量与细胞的表达水平、病患临床病理之间的关系以及其对肺癌细胞生长的影响，目前，尚未见报道。本研究检测了肺癌患者血清中GDF11的含量并分析其与病理学特征的相关性，且对65肺癌细胞转染GDF11表达载体检测GDF11对肺癌细胞的影响，为进一步阐明其调控机制提供理论基础。1实验方法与材料1.1实验材料1.1.1细胞培养70肺癌细胞A549和H1299均来自苏州大学放射医学与防护学院中心实验室购买和冻存的细胞。采用含10%胎牛血清和1%浓度的青霉素/链霉素双抗的DMEM高糖培养液在37℃，5%CO2的培养箱中常规培养,每2-3天传代一次，取对数生长期细胞用于实验。1.1.2细胞转染根据实验要求接种相应数量的细胞到60mm的细胞培养皿，培养12h后根据75riboFECTTMCPTransfectionKit产品说明书将转染试剂、试剂缓冲液以及质粒混合均匀室温放置15min后加入到细胞皿中，4h后更换培养液，继续培养。1.1.3患者血清样本的收集收集2014年8月1日-2014年9年2日苏州大学附属第一人民医院肿瘤科住院的肺癌患者血液样本180例。纳入条件(1)近期无其他脏器疾患与感染史，均经病理学或细胞学检80查确诊。(2)经病理学或细胞学查实为肺癌。按年龄、性别、转移和癌症类型挑选符合条件的40例，其中男17例，女23例；年龄≤50岁8例，50～65岁16例，≥65岁16例；低分化肺腺癌21例，中高分腺癌19例；无淋巴结转移的16例，淋巴结转移的24例。-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn1.1.4材料与仪器设备85全功能酶标仪（SynergyNEO）莱卡倒置荧光显微镜（DMILLED）台式离心机CO2细胞培养箱（Heraeus）多色荧光化学发光成像分析系统（Alpha美国）。试剂：DMEM培养基、胎牛血清均为Hyclon购自苏州明德科技有限公司、胰蛋白酶（AMRESCO）、购自苏州工业园区博美达试剂仪器有限公司、CCK8购自东仁化学。HumanGDF11ELISAKIT购自苏州工业园区博美达试剂仪器有限公司。riboFECTTMCPTransfectionKit购自广东瑞90博科技有限公司、Anti-GDF11/Myostatinantibody购自艾博抗（上海）贸易有限公司。PEGFP-GDF11表达载体由本实验室所构建并测序。1.2实验方法1.2.1ELISA法检测血清中GDF11含量抽取肺癌患者静脉血２ml，置于生化抗凝管中，4℃，3000r／min,离心15min，分离血95清，置于-80℃冰箱中备用。血清稀释10倍后，ELISA法检测GDF11水平，每个样品重复5个孔，用多功能酶标450nm下检测吸光值，取平均值计算GDF11的含量。（ELISA试剂盒检测的线性范围为5～180ng/L，组内及组间变异系数分别小于9.5%和10%。）。1.2.2CCK8法检测细胞的生长用肺癌患者血清培养液培养A549及H1299细胞40个肺癌患者血清样本（患者血清经1000.02μm的滤膜抽滤后按1：10与DMEM混合）根据ELISA法检测结果将血清样本分为三组，血清中GDF11含量≤700ng/L的低含量组13例，≥1050ng/L的高含量组16例，介于两者之间3的中含量组11例。取对数生长期H1299和A549分别接种96孔板，5×10个细胞/孔，每个样本做三个重复，用含10%FBS的完全培养液培养细胞株6h贴壁后，弃培养液，用pH为7.40的PBS洗涤2次，除去PBS。每孔分别加0.2ml的混合液（15%肺癌患者血清的完全培105养液）。分别培养24、48、72h后，弃培养液，用pH为7.40的PBS洗涤2次，除去PBS，加入CCK8试剂与无血清培养液按1:20混合的混合液0.2ml，培养箱中孵育4h后，用多功能酶标仪450nm处检测其吸光值。条件培养液培养A549及H1299细胞在前期试验中，发现转染GDF11的细胞培养液中存在大量GFP融合的GDF11蛋白（待的数据）。因此，收集转染pEGFP-GDF11后24、48h后的培养液，作为H1299、A549的条件培养液（转染后11024h的培养液为条件培养基1）、转染48h（条件培养基2）），并加入同样的牛血清作为细胞培养液。用胎牛血清作为对照。分别于24、48和72h用CCK8检测细胞生长。1.2.3Westernblot检测GDF11的表达提取A549和H1299细胞分三组，分别为转染PEGFP-GDF11实验组（GDF11组）、转染空载质粒PEGFP的阴性对照组（NC组）和不做任何处理的空白对照组（Control组）。于转115染后48h收集细胞提取蛋白样品，采用Bradford法测定蛋白浓度。按每孔上样量为30μg进行SDS-PAGE电泳，90V恒压转膜90min，5%的脱脂奶粉2h。一抗4℃，恒温摇床16h（anti-GDF111:1000，action1:10000），用TBST室温摇床洗膜6次，每次5min。加二抗（辣根酶羊抗鼠或羊抗兔1:1000），37℃孵育1h，用TBST洗膜3次每次5min。ECL显色试剂盒显影，在多色荧光化学发光成形分析系统拍照。120-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn1.2.4转染GDF11后细胞生长的检测4取对数生长期A549细胞和H1299细胞，以（2～5)×10个/ml的密度接种于96孔板中，每孔200μl。实验分组同1.2.3，每组5个重复孔。37℃常规培养；细胞贴壁后，加质粒进行转染，转染4小时后换液培养。分别在1～6天定时加入CCK8并进行检测吸光值。1251.2.5克隆形成实验取对数生长期A549和H1299细胞，经胰酶消化后制成单细胞悬液，接种于35cm的皿中，实验分组同1.2.3，每组3个重复，置于37℃，5%CO2的培养箱内培养12天。镜下观察细胞克隆形成后，弃去培养液，用PBS冲洗2次，加入甲醇固定，结晶紫染色，计数含50个细胞以上的细胞克隆。克隆形成率（PE，100%）=各组克隆数/接种细胞数×100%。1301.2.6统计学方法实验数据均采用SPSS19.0及GraphpadPrism5.0软件进行分析；重复检测检验的方差分析采用F检验；计量资料的数据采用均数±标准差（x±s）来表示；多组均数比较采用单因素方差分析；两个样本均值比较采用t检验；P＜0.05为差异有统计学义意。2结果1352.1肺癌患者血清中GDF11含量与病理学相关性分析患者血清中GDF11含量与病患的年龄相关（F=3.983,P＜0.05）且年龄越大和越小GDF11的含量就越高，与病患癌症的分化程度相关（F=24.567,P＜0.05）且随着分化程度的降低GDF11的含量逐渐降低，与病患的性别（F=1.855,P＞0.05）、淋巴结转移（F=0.05,P＞0.05）无关。140表1病患血清中GDF11的含量与临床病理特征相关性Table1CorrelationbetweenserumGDF11levelsandclinicopathologicalfeaturesinpatientsPathologicalfeatureGDF11contentNFP(ng/L)（x±s）GengerMale171017±681.8550.191Female23889±62Age≤5081050±4850-6516776±563.9830.039≥65161003±63DegreeofdifferentiationLowdifferentiation833.64±572124.5670.008Middleorhigh1096±2119differentiationLymphnodemetastasisNo16941±600.0500.825Yes24918±47注：不同组血清GDF11含量检测结果分析，P＜0.05有统计学意义2.2CCK8法检测细胞生长的结果患者血清中GDF11含量对肺癌细胞生长的影响结果显示GDF11可以抑制A549细胞的-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn145生长，在48h（F=3.975P＜0.05）、72h（F=11.900P＜0.05）时细胞的生长与GDF11含量相关，且GDF11含量越高抑制效果越显著。而H1299细胞的生长与GDF11的含量不相关性。见表2表2GDF11含量与A549和H1299细胞生长之间关系Table2RelationshipbetweenGDF11contentandcellgrowthofA549andH1299GDF11FODvalue(x±s)Pnumbercontent13low2.02±0.11A549Cell24h16middle1.98±0.100.0773.64611high1.89±0.1213low3.80±0.06A549Cell48h16middle3.60±0.060.0153.97511high3.40±0.0213low3.96±0.01A549Cell72h16middle3.93±00111.9000.03511high3.90±0.0113low0.55±0.01H1299Cell24h16middle0.58±0.020.0950.47511high0.53±0.0113low1.08±0.04H1299Cell48h16middle1.04±0.050.1022.38611high0.90±0.0313low2.5±0.11H1299Cell72h16middle2.21±0.040.353.68311high1.94±0.05150注：图中GDF11含量低是小于等于700ng/L，高是大于等于1050ng/L，中是介于两者之间。条件培液1和条件培养液2，培养A549和H1299细胞的CCK8检测结果如图1（A549细胞）、图2（H12299细胞）结果显示，使用条件培养液1(t=8.3，P＜0.05)和条件培养液2（t=4.857，P＜0.05）培养的A549细胞与完全培养液相比，其OD值具有显著降低，这说明条件培养基对A549细胞的生长具有抑制作用，且随着时间的延长抑制作用愈加明显。而H1299细胞的OD值不具有差异。进一步说明GDF11可以抑制A549细胞的生155长。-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图1条件培养基对A549细胞生长的影响Figure1EffectofconditionedmediumongrowthofA549cells160图2条件培养基对H1299细胞生长的影响Figure2EffectofconditionedmediumongrowthofH1299cells-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn2.3Westernblot检测GDF11的表达结果从图三可以看出实验组GDF11与对照组NC和Control相比实组高表达GDF11。A549、H1299细胞转染GDF11后，检测其GDF11的表达其结果可见除GDF11本底表达的45KD165分子的蛋白之外在70KD除还有一条更亮的条带这表明表达载体PEGFP-GDF11在A549和H1299细胞内成功外源表达图3GDF11表达的检测Figure3detectionofGDF11expression170注：GDF11：转染PEGFP-GDF11载体组；NC:转染PEGFP空载质粒组；CON；未做处理组2.4转染GDF11后对A549和H1299细胞生长的影响转染GDF11后对A549和H1299生长的影响结果如图四，从图中可以看出转染GDF11后，A549细胞的生长受到抑制，且会随着时间的延长抑制效应加著。而对H1299细胞的生长影响不大。175图4转染GDF11后细胞的生长Figure4ThegrowthofcellsaftertransfectedGDF11注：*P<0.05；**P<0.01；Control组是没有做任何处理的组，NC组是转染空载质粒的组，GDF11是180转染含GDF11的质粒组。-7- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn2.5克隆形成的结果转染GDF11后A549及H1299细胞的克隆形成率结果如图五，从图五中可以看出转染GDF11后A549细胞的克隆形成降低。而对H1299细胞影响不大。185图5转染给GDF11后细胞的克隆形成率Figure5Colony-formingefficiencyofcellsaftertransfectedGDF11注：**P<0.01；Control组是没有做任何处理的组，NC组是转染空载质粒的组，GDF11是转染含GDF11的质粒组。1903结论与讨论GDF11又称BMP11在许多组织中表达，它通过ⅡB类受体(ActＲⅡB)激活Smad2/3通路［8］。早期胚胎发育过程中，GDF11通过负向调节MAPK/AKT/mTOR信号通路，参与骨骼、肾脏、胰腺、视网膜、嗅神经等组织器官的形成和分化，被认为是胚胎正常发育的关键信号［7］分子之一。它随着年龄的增加而降低，给老年动物补充这种细胞因子能对其肌肉和神经［3］195产生抗衰老的效应，甚至通过异种共生实验恢复机体的GDF11水平。哈佛大学干细胞研［9-11］究团队发现年轻动物血液中GDF11对逆转衰老起关键性作用。GDF11的表达有年龄的［12］差异性,研究发现小鼠和人体GDF11的水平在老年时明显低于年轻时的水平。还有研究［10］［9］表明GDF11可以逆转增龄引起的骨骼肌功能紊乱，逆转因增龄引起的心脏肥大，改［11］善大脑的脉管系统和神经发生能力，使大脑年轻化，促进成骨细胞的形成，抑制骨质疏［12］200松等。但GDF11在肺癌中的功能与作用报道甚少。本研究收集并检了大量肺癌患者的血液样本并检测了各样本中GDF11的含量，统计并分析了其与患者病床病理特征的关系，结果表明病患血清中GDF11的含量与患者的年龄及癌症的分化程度相关。且随着年龄越大与越小GDF11的含量会升高。分化程度越低即恶性程度越高的病人血清中GDF11的含量就越低。使用患者血清分别培养A549细胞和H1299205细胞结果显示GDF11可以抑制A549细胞的生长且具有剂量和时间效应，对于H1299细胞并没有显著的影响。因A549细胞属于P53野生型细胞系，H1299细胞属于P53缺陷性的细胞系，故本实验表明GDF11是P53依赖的。高表达GDF11后A549细胞的生长以及克隆的形成均受到抑制，进一步说明GDF11对A549细胞的生长具有抑制作用。而高表达GDF11后对H1299细胞的生长及克隆的影响不大。目前所有实验结果表明GDF11确实可以抑制210A549细胞的生长而对H1299的作用效果不明显。猜测GDF11对A549细胞生长的抑制作用-8- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn可能是通过促进凋亡来实现的且与P53相关。其作用的具体分子机制有待进一步实验证实。[参考文献](References)[1]JemalA,BrayF,CenterMM,etal.Globalcancerstatistics[J].CACancerJClin,2011,61(2):69-90.215[2]FerlayJ,ShinHＲ,BrayF,etal.Estimatesofworldwideburdenofcancerin2008:GLOBOCAN2008[J].IntJCancer2010,127(12):2893-2917[3]GeG,DelanaR.Hopkins,Wen-BinHo,etal.GDF11FormsaBoneMorphogeneticProtein1-ActivatedLatentComplexThatCanModulateNerveGrowthFactor-InducedDifferentiationofPC12cells[J].MolCellBiol.2005;25(14):5846-58.220[4]WozneyJM,RosenV,CelesteAJ,etal.Novelregulatorsofboneformation:molecularclonesandactivities[J].Science1988,242(4885):1528-34[5]GamerLW,WolfmanNM,CelesteAJ,etal.AnovelBMPexpressedindevelopingmouselimb,spinalcord,andtailbudisapotentmesoderminducerinXenopusembryos[J].DevBiol1999,208(1):222-32[6]LuytenFP,CunninghamNS,MaS,etal.Purificationandpartialaminoacidsequenceofosteogenin,aprotein225initiatingbonedifferentiation[J].JBiolChem1989,264(23):1337-8[7]EgermanMA,CadenaSM,etal.GDF11IncreaseswithAgeandInhibitsSkeletalMuscleRegeneration[J].CellMetab2015,22(1):164-74.[8]NakashimaM,ToyonoT,AkamineA,etal.Expressionofgrowthdifferentiationfactor11,anewmemberoftheBMP/TGFbetasuperfamilyduringmouseembryogenesis[J].MechDev,1999,80(2):185-9JIXG,DENGYY,230WANGP.Charactersofatmospherepressure,pureoxygenfixedbedgasificationofsevenkindscoal[J].CleanCoalTechnology,2004,25(4):50-52.[9]LoffredoFS，SteinhauserML，JaySM，etal．Growthdifferentiationfactor11isacirculatingfactorthatreversesage-relatedcardiachypertrophy[J].Cell,2013,153(4):828-39.[10]SinhaM,JangYC,OhJ,etal.ＲestoringsystemicGDF11levelsreversesage-relateddysfunctioninmouse235skeletalmuscle[J].Science,2014,344(6184):649-52.[11]KatsimpardiL,LittermanNK,ScheinPA,etal.Vascularandneurogenicrejuvenationoftheagingmousebrainbyyoungsystemicfactors[J].Science,2014,344(6184):630-4.[12]ZhangY，ShaoJ，WangZ，etal．Growthdifferentiationfactor11isaprotectivefactorforosteoblastogenesisbytargetingPPAＲgamma[J]．Gene,2015;557(2):209-14.240-9-'