Clk1缺失通过AMPKmTORC1信号通路抑制自噬增加多巴胺能神经元死亡.pdf 12页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnClk1缺失通过AMPK/mTORC1信号通路抑制#自噬增加多巴胺能神经元死亡**闫秋婷，镇学初5（苏州大学药学院，苏州215000）摘要：目的：探究在帕金森病模型中，Clk基因缺失对多巴胺能神经元存活的调控作用及其作用机制。方法：用病毒沉默Clk1，Q-PCR检测mRNA水平，MTT法检测细胞活力。Westernblot检测自噬相关蛋白LC3,P62,LAMP1的表达情况。免疫荧光检测自噬体的数量。Western10blot检测AMPK/mTORC1信号通路的蛋白水平。免疫荧光检测TFEB的核转录调控。结果：MPP+会降低Clk蛋白表达，Clk1缺失的神经元活力降低。Clk1缺失通过AMPK/mTORC1信号通路减少TFEB的核转录抑制细胞自噬，增加神经元细胞的死亡。用Metformin处理可以一定程度保护多巴胺能神经元。结论：Clk1通过AMPK/mTORC1/TFEB信号通路调节多巴胺能神经元细胞自噬，增加多巴胺能神经元死亡。15关键词：药理学，Clk1，多巴胺能神经元，自噬，AMPK/mTORC1,Metformin中图分类号：R96Clk1deficiencyinhibitsautophagythroughtheAMPK/mTORC1pathwaythatsensitizeddopaminergic20neuronaldeathYANQiuting,ZhenXuechu(CollegeofPharmaceuticalSciences,SoochowUniversity215000)Abstract:Aim：ToinvestigatethefunctionalroleofClk1intheregulationofdopaminergicneuronssurvival.Methods:ViruswasusedtoknockdownClk1inMN9Dcells,theexpressionofClk1was25analyzedwithWesternblotandQ-PCR.MTTassaywasusedtodetectcellviability.TheexpressionofLC3,P62andLAMP1wasanalyzedwithWesternblot.Theamountofautophagosomewasdetectbyimmunofluorescence.TheexpressionofAMPKandmTORC1wasanalyzedwithWesternblot.ThenucleartranscriptionofTFEBwasdetectbyimmunofluorescence.Results:TheexpressionofClk1wasdecreasedafterMN9DcellsweretreatedwithMPP+,andthisrepressionwastimeanddosedependent.30Clk1deficencyisrelatedtodopaminergicneuronssurvival.Clk1deficiencyinhibitedautophagythroughAMPK/mTORC1pathwayandthenucleartranslocationofTFEBwasdecreased.Clk1deficiencyinfluenceddopaminergicneuronsdeath.Importantly,Metformin(AMPKagonist)treatmentprotecteddopaminergicneuronsinClk1-deficientPDmodels.Conclusion:Clk1deficiencyinhibitedautophagythroughAMPK/mTORC1/TFEBpathwayandinfluenceddopaminergicneuronsdeath.35Keywords:Pharmacology,Clk1,dopaminergicneurons,autophagy,AMPK/mTOR,Metformin0引言帕金森病（Parkinson’sdisease,PD)又称为震颤麻痹，是全球第二大神经退行性疾病，40其主要病理特征为中脑黑质致密部的多巴胺神经元坏死，导致投射至纹状体的多巴胺[1-2]（dopamine，DA)神经递质大量减少，产生静止震颤，肌肉强直，运动迟缓等临床症状。越来越多的证据表明，帕金森病是由多个因素导致的综合性疾病，这些因素包括遗传因素[3]a-synuclein、parkin、UCH-LI、PINKl、DJ-1、LRRK2等基因的影响，环境因素如除草基金项目：国家自然科学基金（81372688）；国家自然科学基金（81373382）作者简介：闫秋婷（1991-），女，硕士研究生，神经药理学通信联系人：镇学初（1963-），男，特聘教授，神经药理学.E-mail:zhenxuechu@suda.edu.cn-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn[4][5]剂、鱼藤酮、MPTP等化学毒物的作用，这些影响因素都可能会导致线粒体功能的缺陷,[6][7]45a-synuclein沉积，氧化应激,炎症反应和兴奋性中毒等，进而引起帕金森的发病。自噬-溶酶体途径（autophagy-lysosome,ALP)是一种细胞内降解机制,除了参与胞内蛋白和细胞器的质量控制外,也被认为是一种与凋亡、坏死并列的程序性细胞死亡机制。细胞内的长寿命蛋白（包括a-synuclein）和细胞器（如线粒体）是通过自噬途径来循环降解的。大量证据表明自噬与帕金森密切相关,在PD模型中过表达Beclin1诱导自噬能有效的减少[8]50a-synuclein堆积，保护神经元。自噬关键基因Atg7的缺失导致老鼠产生PD样神经退行[9][10]性疾病。MPTP能够通过影响溶酶体功能造成自噬流阻滞。另外，还在死亡的帕金森病人的脑中检测到了大量的自噬体的存在。[11-12]Clk1又称为coq7,是编码位于线粒体内膜上的羟化酶，参与辅酶Q的生物合成。+/-有研究表明，在Clk小鼠中，表现出了一些线粒体功能的改变，如线粒体氧消耗的减少，[13-14]55电子传递的减缓和ATP合成的减少等。Clk缺失会增强LPS诱导的小胶质细胞的炎+/-症反应，并促进有氧糖酵解的发生。无论是体外培养还是Clk小鼠体内，在MPTP诱导[15]的帕金森模型中，Clk1缺失胶质细胞激活程度和多巴胺能神经元死亡数量都是增加的。虽然Clk1参与帕金森的发病，而直接对神经元的调控作用尚未文献报道。在本课题中，我们主要设计探究Clk1在神经元的存活中发挥的作用及其作用机制。60材料与方法1.1材料1.1.1细胞MN9D小鼠多巴胺能神经元永生化细胞系，购于无锡齐氏生物科技有限公司。651.1.2试剂DMEM/HighGlucose培养基购于美国Hyclone公司，胎牛血清，青霉素、链霉素，胰蛋白酶购于美国Gibco公司，RNAisoPlus，SYBRGreen购于日本Takala公司，BCA蛋白定量试剂盒细胞浆/细胞核蛋白提取试剂盒购于美国Thermo公司，MTT粉末，Metformin粉末购于碧云天生物，Lipofectamine2000购于美国Invitrogen公司，ADP/ATP70Ratio试剂盒，嘌呤霉素(puromycin)，Rapamycin，LC3抗体购于美国Sigma公司，Clk1抗体购于美国Proteintech公司，TH抗体购于美国Millipore公司，P62抗体，phospho-AMPK(Thr172)抗体，AMPK抗体，phospho-mTOR(Ser2448)抗体，mTOR抗体，phospho-p70s6k(Thr389)抗体，p70s6k抗体，GFP抗体，Actin抗体购于美国CST公司，LAMP1抗体购于美国abcam公司，LaminB抗体购于武汉博士德公司，荧光二抗购于75美国Life公司。1.1方法1.2.1细胞培养80MN9D细胞培养在DMEM完全培养基中，将细胞培养皿放置在37℃，恒温恒湿，5%-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnCO2培养箱中培养。细胞传代时，弃培液，用PBS清洗细胞1-2次，加入适量的胰酶消化，显微镜下观察有大量的细胞从皿底脱落时，加入少量的完全培养基终止消化，轻轻吹打细胞至完全脱落皿底，收集到离心管中，常温，1100rpm离心3min后，弃上清，重悬成单细胞悬液传入新皿中。根据细胞实验需要接种不同浓度的细胞量于培养板中，供后续实验。851.2.2细胞免疫荧光用预冷的PBS清洗3次，冰甲醇在摇床上固定15min，用封闭液室温封闭1h，用PBS清洗3次，用PBST(PBS+1%Triton)打孔15min。一抗孵育4℃过夜，用PBS清洗3次，二抗室温孵育2h，用PBS清洗3次，加入稀释好的Honchest，置于37℃恒温箱中孵育30min。用PBS清洗3次，将玻片倒扣在滴有荧光淬灭液的粘性载玻片上封片，用激光共90聚焦拍片。1.2.3MTT检测4将细胞按照2x10个/孔接种于96孔板中，次日加药处理24h后，弃上清，每孔加入30uLMTT溶液，置于37℃恒温箱孵育2h。每孔加入100uLDMSO，充分振荡混匀后用酶标仪在590nm波长处测定吸光度值。951.2.4实时荧光定量PCR用RNAisoplus试剂盒提取RNA,用逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA后，将cDNA释10倍，按照SYBR说明书体系进行Q-PCR实验。引物序列见表1。表1引物序列GenePrimersSequence（5’-3’）GAPDHForwardTGTGTCCGTCGTGGATCTGAReverseTTGCTGTTGAAGTCGCAGGAGClk1ForwardCTTCCATCAGCATGCGGATCReverseGATTGCATTCAGGGTCCGAC1001.2.5蛋白免疫印迹弃培养基，收集细胞，加入适量的蛋白裂解液，冰上裂解30min，12500g，4℃离心10min后取上清。BCA法测定蛋白浓度后，加入5xloadingbuffer，煮沸10min，-20℃保存。样品制备好后，用SDS-PAGE凝胶电泳并转移到PVDF膜上，置于5%脱脂牛奶中室温封闭2h，一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育2h,在膜上滴加显色液，随即用化学发光仪检105测蛋白条带。1.2.6ADP/ATP比值将细胞种于96孔板中，弃培养基，每孔加入90uLATP检测试剂，混合均匀，室温孵育1min后，用全波长酶标仪检测荧光。继续孵育10min，再次测定荧光。再加入5uLADP检测试剂，混合均匀，室温孵育1min后，用全波长酶标仪检测荧光。按照说明书公式计110算出ADP/ATP比值。1.2.7胞浆和核蛋白的提取按照试剂盒说明书，用CER裂解液提取胞浆蛋白，用NRR裂解液提取核蛋白，用BCA法分别测定浓度后，加入5xloadingbuffer，煮沸10min，-20℃保存。1.2.8Lipofectamine2000转染质粒-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn115将Lipofectamine2000稀释到opti-MEM中，轻混，静置5min。将质粒稀释到opti-MEM中，轻混，静置5min。将两者混匀，静置15min。将混合物加入对应的含opti-MEM的细胞中。转染6-8h后，更换成DMEM完全培养基，24-48h检测RNA水平转染效率，48-72h检测蛋白水平转染效率。1.2.9病毒的感染120按照1x108TU/mL病毒感染量MOI=20加入体积为10uL病毒至细胞中，感染48h后传代，同时加入puromycin（终浓度2.5ug/mL)筛选出成功感染病毒的细胞。1.2.10小鼠MPTP模型的建立本实验采用的小鼠为13-14周的雄性小鼠。小鼠腹腔注射MPTP造帕金森亚急性模型。+/-将Clk小鼠和野生型小鼠分别分成三组：生理盐水组，MPTP组，MPTP和Metformin组，125每组8只。MPTP粉末和Metformin用生理盐水配制成溶液，每天10：00分别腹腔注射NS和MPTP(25mg/kg),Metformin在注射MPTP前1h注射。连续注射7天后，进行训练，注射第七天后24h，检测行为学。检测完行为学，处死小鼠并收集脑组织进行后续实验。1.2.11爬杆实验将一个木制小球安放在表面粗糙的木棍上，木棍的下端放在鼠笼里。将小鼠放在木棍顶130端小球上，使其头朝下单向连续爬行。用秒表记录小鼠从木球爬到木棒底端的时间，每只小鼠测试3次，每次测试时间间隔30min，处理数据时取三次平均时间。1.2.12转棒实验在实验开始前，将小鼠放在疲劳式转棒仪上适应5min，恒速20r/min。正式实验时，将转棒仪转速设置为300s内由4r/min加速到40r/min，记录小鼠在转棒上停留时间。每只135小鼠测试3次，每次测试时间间隔30min，处理数据时取三次平均时间。1.2.13免疫组织化学测完行为学后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉。剪开胸腔，用10mL注射器经左心室插入主动脉，约灌流30mL生理盐水后，换成4%多聚甲醛固定，约灌流30mL后，小鼠全身僵直变硬，取脑置于4%多聚甲醛中后固定6-8h，再转移至30%蔗糖中脱水，脱水完全后140取出。用冰冻切片机连续冠状切片，每片厚度为16-20um。脑片放在30%蔗糖中，4℃保存。将脑片用PBS漂洗3次，每次10min。用封闭液室温封闭2h，弃封闭液，将脑片放在稀释好的一抗中，4℃孵育过夜。回温30min，将脑片用PBST漂洗3次，每次10min。将脑片放在稀释好的荧光二抗中，室温孵育2h。将脑片用PBST漂洗3次，每次10min。将脑片放在稀释好的Hoechst3358,37℃避光孵育30min。将脑片用PBST漂洗3次，每145次10min。将脑片置于载玻片上，滴加荧光封片液封片，用激光共聚焦显微镜拍片。1.2.14统计学处理采用GraphPadPrism5.0软件对实验结果进行统计分析，制作图表。实验以平均值+标准差(Mean+SEM)表示。两组间数据的统计使用t检验，多组间的数据统计使用One-wayANOVA。行为学数据统计分析使用repeatedmeasureANOVA，以p<0.05具有统计学意义。150-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn2结果+2.1Clk1缺失促进MPP诱导的多巴胺能神经元的死亡为了探讨Clk1与多巴胺能神经元死亡的关系，我们选用了小鼠的多巴胺能神经元细胞+系MN9D进行实验。首先我们用MPP处理多巴胺能神经元MN9D，发现能产生明显的+155毒性作用（图1A），并且用不同剂量和时间点的MPP处理MN9D细胞，发现Clk1和酪氨酸羟化酶(TH)下调（图1B,C）。+为了进一步探究在MPP诱导的帕金森模型中，Clk1对多巴胺能神经元死亡的调控作用。我们用LV2-shClk1慢病毒感染MN9D细胞，同时用阴性对照慢病毒(LV2-NC)感染细胞。感染48小时后，用puromycin筛选出稳定表达的细胞系，通过Q-PCR和WB验证感染160效率，与NC组相比，LV2-shClk1慢病毒感染后细胞内Clk1的mRNA水平和蛋白水平均明+显降低（图1D,E）。在沉默Clk1后，再用MPP处理细胞，发现Clk1沉默组的细胞活力下+降更多（图1F）。说明在MPP诱导的帕金森模型中，Clk1缺失加重多巴胺能神经元的损伤。+165图1.Clk1缺失促进MPP诱导的多巴胺能神经元的死亡。(A)细胞活力实验(B,C)Clk1,TH蛋白水平(D,E)Clk1的mRNA和蛋白水平干扰效率（F)细胞活力实验2.2Clk1调控多巴胺能神经元自噬自噬对于维持神经元细胞内环境稳态至关重要，它的功能紊乱会导致异常折叠的蛋白质170和破损的细胞器无法降解并产生细胞毒性作用，进而引发一系列的神经退行性疾病，包括[16-17]PD。因此我们想知道Clk1是否参与调控多巴胺能神经元自噬。结果表明，Clk1缺失的MN9D细胞中LC3和溶酶体蛋白LAMP1下调，P62蛋白水平上调（图2A）。接着我们用细胞免疫荧光验证了Clk1缺失的MN9D细胞LC3点状颗粒明显减少（图2B,C）,说明Clk1缺失抑制多巴胺能神经元自噬，过表达Clk1激活多巴胺能神经元自噬（图2D-F）。为了++175观察Clk1在帕金森病模型中对自噬的调控，我们首先观察MPP对自噬的作用，发现MPP阻碍神经元自噬流（图2G）。Clk1敲除后LC3蛋白水平降低更多，说明在帕金森模型中-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnClk1缺失的神经元自噬水平降低（图2H）。图2.Clk1调控多巴胺能神经元自噬。(A)LC3,P62和LAMP1蛋白水平(B，C)LC3免疫荧光(D)LC3,P62180和LAMP1蛋白水平(E,F)LC3免疫荧光（G,H)LC3,P62蛋白水平2.3Clk1调控AMPK/mTORC1信号通路[15]有文献报道参与Clk1调控代谢。ADP/ATP比值是反映细胞能量状况的一项重要指[18]标，直接影响AMPK的活性。因此我们检测了Clk1缺失的MN9D的ADP/ATP比值，185结果表明Clk1缺失MN9D细胞的ADP/ATP比值降低（图3A）。Clk1缺失的MN9D细胞AMPK的Threonine172位点磷酸化水平下调。mTORC1是AMPK下游的信号分子，并且是自噬调控关键分子，我们检测到mTOR的Serine2448位点磷酸化水平升高，及其下游核糖体蛋白p70s6k的Threonine389位点磷酸化水平也升高（图3B）。-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn190图3.Clk1调控AMPK/mTORC1信号通路。(A)ADP/ATP比值(B)p-AMPK,p-mTORC1,p-p70s6k蛋白水平2.4Clk1通过AMPK/mTORC1信号通路调控神经元自噬为了进一步确认Clk1缺失引起的自噬抑制依赖于AMPK/mTORC1信号通路，我们分195别用AMPK激动剂metformin和mTORC1抑制剂rapamycin处理细胞，发现Clk1缺失的神经元细胞自噬水平有一定程度的上升（图4A,B）。[19]有文献报道，在PD模型中，AMPK激动剂metformin可以保护神经元，我们想知+道metformin是否可以保护Clk1缺失的神经元细胞。细胞活力实验表明，在MPP诱导的PD模型中，metformin可以一定程度的减少Clk1缺失的神经元细胞死亡（图4C）。因此，200Clk1是通过AMPK/mTORC1信号通路调控神经元细胞自噬，并且metformin可以保护多巴胺能神经元。-7- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图4.Clk1通过AMPK/mTORC1信号通路调控神经元自噬。(A,B)LC3,P62,LAMP1,p-AMPK,p-205mTORC1和p-p70s6k蛋白水平(C)细胞活力实验2.5Clk1调控TFEB核转录TFEB是mTORC1下游转录因子，它是在转录水平调控自噬和溶酶体功能的关键分子。近年来有很多文献报道，TFEB在被降解物识别以及自噬体和溶酶体的融合中发挥作用，进[20]210而参与神经退行性疾病。我们想知道Clk1是否能调控TFEB核转录。免疫荧光的结果表-8- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn明，在Clk1缺失的神经元细胞中，TFEB的入核减少（图5A）。过表达Clk1，TFEB的入核增加（图5B）。我们使用细胞浆与细胞核蛋白分离试剂盒提取胞浆蛋白和核蛋白，结果表明Clk1缺失的神经元细胞，细胞核中的TFEB下调，胞浆中的TFEB上调（图5C）。为了进一步确认Clk1缺失造成的TFEB入核减少是通过AMPK/mTOR信号通路调控的，我们215用metformin处理Clk1缺失的神经元细胞，免疫荧光的结果表明metformin可以恢复Clk1缺失引起的TFEB核转录减少。图5.Clk1调控TFEB核转录。(A,B,D)TFEB免疫荧光(C)胞浆蛋白和核蛋白+/-2202.6在MPTP诱导PD模型中，metformin保护Clk1小鼠的多巴胺能神经元+/-为了确定Clk1在体内的作用，首先我们检测Clk1小鼠的黑质和纹状体中自噬相关蛋+/-白的表达，结果表明自噬水平降低(Fig.6A)。我们采用Clk1和野生型(WT)小鼠构建MPTP诱导的PD模型，将两种小鼠分别分成三组：生理盐水组；MPTP组；MPTP+metformin组；连续给药七天后，在最后一次给药后进行行为学训练，并在24h后进行爬杆和转棒的行为学+/-225检测(Fig.6B)。结果表明，MPTP可以使Clk1小鼠比WT小鼠的爬杆时间延长和转棒时间-9- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn+/-减少，但是预给药metformin可以减轻Clk1小鼠行为学损伤(Fig.6C&D)。免疫组化的结+/-果表明，MPTP诱导的PD模型中，Clk1小鼠黑质部位的TH阳性神经元细胞数目少于WT+/-小鼠，metformin可以增加Clk1小鼠黑质部位TH阳性神经元细胞数目(Fig.7D)。-10- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn230图6.在MPTP诱导PD模型中，metformin保护Clk1+/-小鼠的多巴胺能神经元。(A)黑质和纹状体自噬相关蛋白表达(B)给药流程图(C,D)转棒和爬杆实验(E)TH免疫组织化学3讨论很多证据表明，自噬与PD发病密切相关，自噬活性异常在PD的发病中有着至关重要235的作用。细胞内的大分子蛋白（包括a-synculein）和受损细胞器（包括线粒体和溶酶体等）都经由大自噬降解。所以通过调控自噬活性来找到PD治疗的潜在靶点是未来研究的重要方向。基于此，在本课题中主要阐明了在PD模型中，Clk1缺失通过抑制自噬增加多巴胺能神经元死亡。Clk1，又称为coq7，是辅酶Q合成的关键酶，参与线粒体呼吸链中电子传递。有文献240报道，Clk1基因缺失会导致线粒体代谢改变，包括线粒体耗氧量降低，ATP合成受损等。+/-有文献报道Clk1缺失通过增加有氧糖酵解导致炎症反应增强以及Clk1小鼠对MPTP诱导[15]的PD模型更敏感。在本课题中，我们发现Clk1可以直接调控多巴胺能神经元的存活。机制研究表明，Clk1通过AMPK/mTORC1信号通路抑制自噬，调控TFEB核转录。AMPK是维持机体能量代谢的关键蛋白，在自噬和神经系统中的作用也受到广泛关注[21]245。在本文中，我们发现Clk1缺失ADP/ATP比值降低（图3A），说明Clk1缺失会导致代谢失调。我们在Clk1缺失的MN9D细胞也检测到AMPK磷酸化水平的降低（图3B）。。mTORC1在AMPK下游，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是自噬调控的关键位点，近[22]年很多研究表明mTORC1信号通路与神经退行性疾病包括帕金森密切相关，我们发现Clk1缺失，mTORC1以及下游p70S6k磷酸化水平升高（图3B），自噬蛋白LC3和溶酶体250蛋白LAMP1降低，自噬底物P62升高，免疫荧光水平自噬体减少（图2A-C），自噬水平明显受到抑制。过表达Clk1或者用rapamycin处理后，自噬水平升高（图2D-F）。最近的研究表明mTORC1通过溶酶体的调控蛋白参与调控TFEB的核转录，并且mTORC1的[23]负性调控也可能通过TFEB在帕金森病中起关键的作用。我们又检测了Clk1对TFEB核转录的调控作用，发现Clk1缺失TFEB入核减少，过表达Clk1后TFEB入核增加（图5A,B）。255我们可以得出结论，Clk1缺失通过调控AMPK/mTORC1/TFEB信号通路抑制自噬。我们在实验中使用了AMPK激动剂metformin，这种药物在临床上主要用于治疗II型糖尿病，能激活AMPK通路，因此被用于AMPK激动剂使用。有研究表明metformin能[24]够缓解帕金森病症状、减少II型糖尿病中帕金森并发的概率。我们发现，在Clk1缺失的MN9D细胞中，metformin可以增加多巴胺能神经元的存活。在体内，通过metformin预+/-260给药可以一定程度改善Clk1小鼠的行为学损伤以及多巴胺能神经元死亡。综上所述，本文研究发现Clk1通过AMPK/mTORC1信号通路调控多巴胺能神经元自噬，进而调节多巴胺能神经元的死亡。因此，调控Clk1活性可能成为帕金森病治疗的潜在靶点。2654结论本本文研究表明，Clk1缺失调控AMPK/mTORC1信号通路，减少TFEB核转录，抑制++/-自噬-溶酶体途径，增强Clk1对MPP的敏感性。metformin可以一定程度改善Clk1小鼠的行为学损伤以及多巴胺能神经元死亡。-11- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn[参考文献](References)270[1]PATHAKA,SENARDJM.BloodpressuredisordersduringParkinson"sdisease:epidemiology,pathophysiologyandmanagement[J].ExpertRevNeurother,2006,6(8):1173-80[2]DELAULM,BRETELERMM,EpidemiologyofParkinson"sdisease[J].LancetNeurol,2006,5(6):525-35[3]GASSERT.GenomicandproteomicbiomarkersforParkinsondisease[J]．Neurology,2009,72(7Suppl):S27-31275[4]DAUERW,PRZEDBORSKIS.Parkinson"sdisease:mechanismsandmodels[J].Neuron,2003,39,889-909[5]HATTORIN.EtiologyandpathogenesisofParkinson"Sdisease:frommitochondrialdysfunctionstofamilialParkinson"Sdisease[J]．RinshoShinkeigaku,2004,44(45):241-262．[6]YORITAKAA，HATTORIN，UCHIDAK，TANAKAM，STADTMANER，MIZUNOY.Immunohistochemicaldetectionof4-hydroxy-nonenalproteinadductsinParkinsondisease[J].ProcNatlAcadSci,2801996,93(7):2696-2701[7]IMAMURAK.DistributionofmajorhistocompatibilitycomplexclassII-positivemicrogliaandcytokineprofileofParkinson"sdiseasebrains[J].ActaNeuropathol,2003.106(6):518-26[8]SPENCERB,MASLIAHE.Beclin1genetransferactivatesautophagyandamelioratestheneurodegenerativepathologyinalpha-synucleinmodelsofParkinson"sandLewybodydiseases[J].JNeurosci,2009,29(43):28513578-88[9]KOMATSUM,TANAKAK,etal.Lossofautophagyinthecentralnervoussystemcausesneurodegenerationinmice[J].Nature,2006,441(7095):880-4[10]HARIHARANN,SADOSHIMAJ.DeacetylationofFoxObySirt1PlaysanEssentialRoleinMediatingStarvation-InducedAutophagyinCardiacMyocytes[J].CircRes,2010,107(12):1470-82290[11]LEVAVASEURF,MIYADERAH.Ubiquinoneisnecessaryformouseembryonicdevelopmentbutisnotessentialformitochondrialrespiration[J].JBioChem,2001,276(49):46160-4[12]NAKAIiD,YUASAS.Mousehomologueofcoq7/clk-1,longevitygeneinCaenorhabditiselegants,isessentialforcoenzymeQsynthesis,maintenanceofmitochondrialintegrity,andneurogenesis[J].BiochemBiophysResCommun,2001,289(2):463-71295[13]LIUX,JIANGN,HUCHESB.Evolutinaryconservationoftheclk-1-dependentmechanismoflongevity:lossofmclk1increasescellularfitnessandlifespaninmice[J].GenesDev,2005,19(20):2424-34[14]HEKIMIS.Enhancedimmunityinslowlyagingmutantmicewithhighmitochondrialoxidativestress[J].Oncoimmunology,2013,2(4):e23793[15]GuR,ZHANGF,ZHENGLT,ZHENX.Clk1deficiencypromotesneuroinflammationandsubsequent300dopaminergiccelldeaththroughregulationofmicroglialmetabolicreprogramming[J].BrainBehavImmun,2016,60:206-219[16]LIUHY,HANJ,CAOSY.Hepaticautophagyissuppressedinthepresenceofinsulinresistanceandhyperinsulinemia:inhibitionofFoxO1-dependentexpressionofkeyautophagygenesbyinsulin[J].JBiolChem.2009;284(45):31484-92305[17]MEDEMARH,JAATTELAM.CytosolicFoxO1:aliveandkilling[J].NatCellBiol.2010;12(7):642-3[18]HARDIEDG.AMP-activated/SNF1proteinkinases:conservedguardiansofcellularenergy[J].NatRevMolCellBiol,2007,8(10):774-85[19]LUM,HUG.MetforminPreventsDopaminergicNeuronDeathinMPTP/P-InducedMouseModelofParkinson"sDiseaseviaAutophagyandMitochondrialROSClearance[J].IntJNeuropsychopharmacol,2016,31019(9)[20]DECRESSACM,MATTSSONB.TFEB-mediatedautophagyrescuesmidbraindopamineneuronsfromalpha-synucleintoxicity[J].ProcNatlAcadSci.U.S.A.2013,110(19),E1817-26[21]GUOZ,CAOG.Acombinationoffouractivecompoundsalleviatescerebralischemia-reperfusioninjuryincorrelationwithinhibitionofautophagyandmodulationofAMPK/mTORandJNKpathways[J].JNeurosciRes,3152014,92(10):1295-306[22]GAN-ORZ,DIONPA,ROULEAUGA.Geneticperspectiveontheroleoftheautophagy-lysosomepathwayinParkinsondisease[J].Autophagy,2015,11(9):1443-57[23]SETTEMBREC,ZONCUR,BALLABIOA.()Alysosome-to-nucleussignallingmechanismsensesandregulatesthelysosomeviamTORandTFEB[J].EMBOJ,2012,31(5):1095-108320[24]WAHLQVISTML,TSAIHN.Metformin-inclusivesulfonylureatherapyreducestheriskofParkinson"sdiseaseoccurringwithType2diabetesinaTaiwanesepopulationcohort[J].Parkinsonism&relateddisorders,2012,18(6),753-8-12-'