TGR5通过抑制S1PS1P2通路、抵抗高糖诱导的肾小球系膜细胞炎症纤维化.pdf 12页

'中国http://www.paper.edu.cn科技论文在线TGR5通过抑制S1P/S1P2通路、抵抗高糖#诱导的肾小球系膜细胞炎症纤维化1,21111**杨志英，熊凤霄，公文艳，黄俊英，黄河清5（1.中山大学药学院，广州5100006；2.广州军区广州总医院，广州510010）摘要：目的：本研究旨在观察TGR5在HG诱导的肾小球系膜细胞(GMCs)中是否能够通过抑制S1P/S1P2信号，进而影响核因子AP-1的活化，从而抑制GMCs炎症纤维化因子的增加。方法：运用si-RNA以及瞬时转染、Westernblot、双荧光素酶报告基因、免疫荧光及免10疫共沉淀等方法观察TGR5对HG诱导的GMCs中相关指标的影响。结果：活化TGR5能够明显抑制HG诱导的GMCs炎症因子（ICAM-1）和转化生长因子（TGF-β1）的表达，细胞外基质主要成分纤维连接蛋白（FN）生成明显减少。进一步结果显示，激活TGR5能够抑制高糖诱导的S1P2表达增多，下调核因子AP-1二聚体中c-Jun/c-Fos的磷酸化水平，降低AP-1的转录活性；同为G蛋白偶联受体家族成员，TGR5与S1P2存在相互作用。结论：15激活TGR5能够抑制HG诱导的肾小球系膜细胞中炎症纤维化因子ICAM-1、TGF-β1、FN的过度生成，其机制可能与TGR5抑制S1P/S1P2通路密切有关。关键词：TGR5；S1P/S1P2通路；肾小球系膜细胞；炎症纤维化中图分类号：R9620TGR5resistshighglucose-inducedinflammatoryfibrosisinglomerularmesangialcellbyinhibitingS1P/S1P2pathway1,21111YangZhiying,XiongFengxiao1,GongWenyan,HuangJunying,HuangHeqing(1.SchoolofPharmaceuticalSciences,SunYat-senUniversity,Guangzhou510006;252.GeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommandofPLA,Guangzhou510006)Abstract:Objective:ThisstudywasdesignedtoinvestigatewhetherTGR5couldsuppresstheincreaseofinflammatoryfibrosisfactorsinducedbyHGviatheinhibitionofS1P/S1P2signalingpathwayandactivationofnuclearfactorAP-1inglomerularmesangialcells(GMCs).Methods:Si-RNA,transienttransfection,Westernblot,Dual-luciferasereporter,immunofluorescenceandco-immunoprecipitation30assayswereperformedtoinvestigatetheeffectsofTGR5onfibrosisrelatedindicatorsinHG-inducedGMCs.Results:ActivationofTGR5significantlyinhibitedtheexpressionofinflammatoryfactors(ICAM-1),andtransforminggrowthfactor(TGF-β1)andtheformationofextracellularmatrix(FN)inHG-inducedGMCs.FurtherresultsshowedthatTGR5activationcouldinhibittheincreasedS1P2expressioninducedbyHG,down-regulatethephosphorylationlevelofc-Junandc-Fosandreducethe35transcriptionactivityofAP-1.Besides,TGR5interactedwithS1P2.Conclusion:TGR5activationcouldsuppresstheoverproductionofICAM-1,TGF-β1andFNinducedbyHGinGMCs,themechanismofwhichmightberelatedtotheinhibitionofS1P/S1P2signalingpathway.Keywords:TGR5;S1P/S1P2;Glomerularmesangialcells(GMCs);Inflammatoryfibrosis400引言糖尿病肾病（Diabeticnephropathy，DN）是糖尿病最严重的微血管并发症，是糖尿病基金项目：教育部博士点基金（NO：20130171110097）作者简介：杨志英（1989－），女，硕士研究生，主要研究方向：内分泌药理学通信联系人：黄河清（1964－），教授，博导，主要研究方向：内分泌药理.E-mail:huangheq@mail.sysu.edu.cn-1- 中国http://www.paper.edu.cn科技论文在线[1,2]致死、致残的主要因素。DN治疗棘手，尚缺乏相对特异性、针对性的治疗药物与方法，积极探索糖尿病肾脏纤维化新的作用靶点及治疗方法，对于DN的防治具有非常现实的意义。TGR5是新型的胆汁酸膜受体，由330个氨基酸组成，包含7个跨膜结构域，是G蛋白[3,4]45偶联受体（GPCR）家族的一员。研究显示：TGR5激活后不仅可以激活肠道内分泌细胞胰高血糖素样肽-1（GLP-1）的分泌，促进胰岛素分泌；还可调控外周组织如骨骼肌、脂肪中能量代谢相关基因表达，增加能量消耗，改善胰岛素抵抗，调节糖脂代谢，抑制炎症反应[5-8]。提示活化TGR5在调节糖尿病糖脂代谢及抗炎方面具有明确的作用。最新研究发现，TGR5激活后能够诱导线粒体增值，减少肾脏氧化应激以及脂质堆积，显示TGR5在抑制肥[9]50胖和糖尿病状态下的肾脏疾病过程中起到关键作用。1-磷酸鞘氨醇（sphingosine1-phosphate,S1P）是细胞膜组成成分磷脂的代谢产物，当受各种刺激，包括高糖、氧化应激、生长因子、细胞因子等，S1P作为具有生物活性的磷脂代[10-13]谢产物，可在多种细胞中生成。近年来研究发现：S1P信号通路的激活参与糖尿病肾[14]脏纤维化的病理进程。我们研究证实：糖尿病模型动物肾组织存在S1P信号通路的活化；55高血糖状态下、肾脏S1P的5个受体亚型以S1P2受体活化表达最明显，高糖活化的S1P信号通路通过促进核因子AP-1的DNA结合活性、显著增加GMC中FN等纤维化成分的表达，[15-17]与肾脏纤维化病变的形成关系密切。TGR5具有显著调节糖脂代谢及抗炎作用，并且能够抑制肥胖和糖尿病状态下的肾脏疾病，然而其具体的分子机制尚未完全明确。TGR5是否通过影响同为GPCR的S1p2信号通60路而发挥调节肾脏炎性纤维化的作用，引起了我们极大兴趣。本研究旨在探讨TGR5在HG诱导的肾小球系膜细胞(GMCs)中是否能够通过抑制S1P-S1P2信号，进而影响核因子AP-1的活化，从而抑制GMCs炎症纤维化因子的增加。为探索将TGR5作为阻抑糖尿病肾脏纤维化病变的新靶点提供初步的实验证据。1材料和方法651.1试剂和抗体INT-777购于DaltonPharmaServices(Toronto,Canada)，S1P购于Sigma–AldrichCo.(St.Louis,USA)，DMEM购于LifeTechnologies(Gibico,Carlsbad,CA,USA)，抗体FN(catalogue:sc-18825)，ICAM-1(catalogue:sc-1511)，TGR5(catalogue:sc-98888)和S1P2(catalogue:sc-31577)购于SantaCruzBiotechnology(SantaCruz,USA)，TGF-β1(catalogue:3709s)，p-c-Jun70ser63(catalogue:#2361P)，p-c-Junser73(catalogue:#3270P)，p-c-Fosser32(catalogue:#5348S)，c-Jun(catalogue:#9165S)，c-Fos(catalogue:#2250S)购于CellSignalingTechnology(Danvers,USA)，α-tubulin(catalogue:sc-18825)购于Sigma–AldrichCo.(St.Louis,USA)。1.2细胞培养[18]大鼠肾小球系膜细胞按照文献方法获得，培养于含青链霉素的10%FBS的DMEM培75养基中，置于37℃含5%CO2孵箱中培养10-15天后传代。取6-12代细胞进行试验。GMCs生长至80%汇合，给予无血清培养基处理14-16h后给予30mMHG的同时加入INT-777（10μ-2- 中国http://www.paper.edu.cn科技论文在线M），继续培养至进行后续实验。1.3质粒，si-RNA以及瞬时转染TGR5过表达质粒购自OriGeneTechnologies(OriGene，USA)，pAP-1-Luc(Beyotime)，80pRL-TK(Promega)，转染按照LipofectamineTMLTX&PlusReagent(LifeTechnologies,Carlsbad,CA)试剂盒说明书进行。TGR5小分子干扰序列购自上海吉玛有限公司（吉玛，中国），转染按照LipofectamineTMRNAiMAXreagent(LifeTechnologies,Carlsbad,CA)试剂盒说明书进行。1.4Westernblotassay85肾小球系膜细胞经处理后用预冷的PBS轻轻洗2遍，吸尽残余PBS，每皿（以30mm培养皿为例）加入细胞裂解液RIPA60ul，用细胞刮将细胞轻轻刮下，转移到1.5mLEP管中，冰上裂解30min。4℃离心，12000g，离心15分钟收集上清。BCA（Pierce,USA）法蛋白定量。收集的蛋白上清液分装后采用8-12%SDS-PAGE胶进行电泳，电转后使用5%脱脂牛奶室温封闭1h，然后进行一抗4℃孵育过夜。用相应的二抗室温孵育1h。增强型化90学发光液（莱德尔试剂有限公司）孵育2min后，应用GEImageQuantLAS4000mini(GEHealthcare,Waukesha,USA)曝光显影。获取的图像采用Quantityone进行灰度分析。1.5双荧光素酶报告基因GMCs接种于96孔板，生长至60%进行瞬时转染。24h后无血清处理12h，给予INT-777预处理2h后再换成HG处理12h。收集细胞采用Dual-Luciferase®reporterassaysystem95kit(Promega)检测荧光素酶活性。1.6免疫荧光GMCs按适当比例接种于铺有载玻片的30mm培养皿内。弃去培养基，用预冷PBS轻轻洗3次，吸尽残余液体。每皿加多聚甲醛1mL，室温固定30min。PBS洗2次，用免疫组化笔在盖玻片上画圈，每孔加100uL羊血清室温封闭30min后进行一抗孵育。湿盒中4℃过100夜，取出样品在室温中再孵育1h。适当洗涤后，每孔加入荧光二抗，湿盒中避光孵育1-2h。PBS洗4次，每次10min。蘸一小滴抗淬灭剂于载玻片上，用青霉素针头撬出盖玻片倒扣于抗淬灭剂上，指甲油封边，避光晾干后使用激光共聚焦显微镜拍照。1.7蛋白质免疫共沉淀GMCs经过处理后使用IP裂解液收集蛋白上清，BCA法进行蛋白定量。取400-500ug105总蛋白，加入2ug对照抗体或相应抗体（抗体用量参照抗体说明书），4℃旋转摇床上过夜。每ug抗体加入15uLagaroseA/Gbeads，4℃摇床上旋转4h。然后4℃离心，12000rcf离心30s，小心去除上清，切勿吸到proteinagaroseA/Gbeads。用washbuffer洗涤沉淀后加入20-40uLLoadingbuffer涡旋重旋沉淀，沸水中煮5min后进行westernblot分析。1.8结果统计110实验数据结果采用Means±SEMs表示，用GraphpadPrism5.0统计软件进行分析比较。多组比较用方差分析，组间比较、组内比较用t检验。p<0.05被认为差异具有统计学意义。-3- 中国http://www.paper.edu.cn科技论文在线2结果2.1在db/db小鼠肾脏组织及HG诱导的GMCs中，TGR5蛋白水平明显降低115与正常C57BL6J小鼠相比，db/db小鼠肾脏组织中TGR5蛋白水平明显降低（Fig.1A），并且在高糖培养的肾小球系膜细胞中，TGR5蛋白含量也明显减少，并且呈现时间与剂量依赖性（Fig.1B）。图1db/db小鼠肾脏组织及HG诱导的GMCs中TGR5蛋白表达*Ａ：小鼠肾脏组织中TGR5的蛋白表达；B：GMCs中TGR5的蛋白表达（与C57/BL6J组相比，P<0.05；#120与NG组相比，P<0.05）Fig.1ExpressionofTGR5inkidneysofdb/dbmiceandHG-inducedGMCs*#A:ExpressionofTGR5inkidneysofmice;B:ExpressionofTGR5inGMCs(P<0.05vs.C57/BL6J;P<0.05vs.NG)2.2TGR5特异性激动剂INT-777能明显抑制HG诱导的GMCs中FN、ICAM-1125以及TGF-β1的表达30mM的HG能够时间依赖性抑制GMCs中TGR5的蛋白水平（Fig.1B），同时在HG[19]刺激下，FN、ICAM-1以及TGF-1的表达明显升高。INT-777是TGR5强效特异性激动剂，对胆汁酸核受体FXR无活性，能够引起STC-1细胞株GLP-1分泌增多，并且以剂量依[20]赖性方式升高细胞内cAMP水平。给予INT-777能明显抑制GMCs中炎症因子（ICAM-1）130和转化生长因子（TGF-β1）的表达，细胞外基质主要成分纤维连接蛋白（FN）生成明显减少（Fig.2）。-4- 中国http://www.paper.edu.cn科技论文在线图2TGR5特异性激动剂INT-777能明显抑制HG诱导的GMCs中FN、ICAM-1以及TGF-β1的表达A：INT-777对FN和TGF-β1蛋白表达的影响；B：INT-777对ICAM-1蛋白表达的影响（与NG组相比，#*P<0.05；与HG组相比，P<0.05）135Fig.2TGR5-specificagonistINT-777significantlyinhibitedtheexpressionofFN,ICAM-1andTGF-β1inHG-inducedGMCsA:TheeffectsofINT-777onexpressionofFNandTGF-β1;B:TheeffectsofINT-777onexpressionof#*ICAM-1(P<0.05vs.NG;P<0.05vs.HG)2.3过表达TGR5能明显抑制HG诱导的GMCs中FN、ICAM-1以及TGF-β1140的表达如结果显示，TGR5过表达效率达到80%以上，说明我们的质粒过表达是成功的（Fig.3A）。接着我们在正常糖和高糖条件下均过表达了TGR5质粒，均能够不同程度抑制FN、ICAM-1以及TGF-β1的表达（Fig.3B-3E）。TGR5在无外在配体结合时依然表现出受体活性，这可能与TGR5作为G蛋白偶联受体家族具有的内在活性有关。-5- 中国http://www.paper.edu.cn科技论文在线145图3过表达TGR5能明显抑制HG诱导的GMCs中FN、ICAM-1以及TGF-β1的表达A：TGR5转染效率的验证；B：TGR5的蛋白表达；C：FN的蛋白表达；D：TGF-β1的蛋白表达；E：ICAM-1$#*的蛋白表达（与NG组相比，P<0.05，P<0.05；与HG+PCMV6组相比，P<0.05）Fig.3OverexpressionofTGR5significantlyinhibitedtheexpressionofFN,ICAM-1andTGF-β1in150HG-inducedGMCsA:ValidationoftransfectionefficiencyofTGR5;B:TheexpressionofTGR5;C:TheexpressionofFN;D:The-6- 中国http://www.paper.edu.cn科技论文在线$#*expressionofTGF-β1;E:TheexpressionofICAM-1(P<0.05,P<0.05vs.NG;P<0.05vs.HG+PCMV6)2.4在GMCs中，使用小分子RNA干扰TGR5的表达后FN、ICAM-1以及TGF-β1的表达明显升高155首先是TGR5干扰序列的筛选。我们一共对三条TGR5干扰序列进行筛选，其中si-TGR5-152这条干扰序列的干扰效率达到70%，并且其稳定性最高，因此后续实验我们均采用si-TGR5-152这条干扰序列进行实验（Fig.4A）。从结果可以看出，敲低TGR5能够明显升高GMCs中FN、ICAM-1以及TGF-β1的表达（Fig.4B-4E）。-7- 中国http://www.paper.edu.cn科技论文在线图4在GMCs中，使用小分子RNA干扰TGR5的表达后FN、ICAM-1以及TGF-β1的表达明显升高160A:TGR5干扰序列的筛选；B：TGR5的蛋白表达；C：FN的蛋白表达；D：ICAM-1的蛋白表达；E：TGF-β1#*的蛋白表达（与NG组相比，P<0.05，P<0.05）Fig.4InGMCs,theexpressionofFN,ICAM-1andTGF-β1wassignificantlyincreasedbytheuseofsmallRNAinterferenceinTGR5expressionA:ScreeningofTGR5siRNA;B:TheexpressionofTGR5;C:TheexpressionofFN;D:Theexpressionof#*165ICAM-1;E:TheexpressionofTGF-β1(P<0.05,P<0.05vs.NG)2.5TGR5对S1P2受体的影响在正常的GMCs细胞中，干扰TGR5的表达能够引起S1P2蛋白水平的上调。显示在基础状态下存在TGR5抑制S1P2活性的可能。S1P2受体在HG培养的GMCs中明显上调，170INT-777或者过表达TGR5均能明显抑制S1P2的蛋白水平（Fig.5A-5B）。过表达TGR5后，给予外源S1P发现，由S1P引起的FN、ICAM-1及TGF-β1表达上调受到了抑制。说明TGR5能够影响S1P-S1P2信号通路，调控FN、ICAM-1及TGF-β1的表达（Fig.5C-5D）。以上部分结果说明S1P-S1P2信号在TGR5调控FN、ICAM-1及TGF-β1的表达过程中起到了关键的介导作用。175图5TGR5对S1P2受体的影响A和B：过表达或者抑制TGR5对S1P2蛋白表达的影响；C和D：过表达TGR5抑制外源性S1P诱导的#&FN、ICAM-1及TGF-β1蛋白表达上调（与NG组相比，P<0.05；与HG+PCMV6组相比，P<0.05；与$*对照组相比，P<0.05；与S1P处理组相比，P<0.05）Fig.5EffectsofTGR5onS1P2receptor-8- 中国http://www.paper.edu.cn科技论文在线180AandB:EffectsofoverexpressionorinhibitionofTGR5onS1P2proteinlevel;CandD:Overexpressionof#&TGR5inhibitedexogenousS1P-inducedup-regulationofFN,ICAM-1andTGF-β1proteins(P<0.05vs.NG;P<$*0.05vs.HG+PCMV6;P<0.05vs.control;P<0.05vs.S1P)2.6INT-777能够明显抑制GMCs中c-Jun/c-Fos磷酸化水平，并且激活TGR5能明显抑制AP-1转录活性185GMCs生长至80-90%后无血清处理14-16h，然后给予INT-777预处理2h后换成HG处理45min，收取蛋白进行westernblot检测c-Jun/c-Fos磷酸化水平。结果显示，INT-777能明显抑制p-c-Junser63/73以及p-c-Fosser32蛋白水平（Fig.6A-6B），并且给予INT-777或者过表达TGR5均能抑制HG条件AP-1转录活性（Fig.6C）。图6INT-777能够明显抑制GMCs中c-Jun/c-Fos磷酸化水平，并且激活TGR5能明显抑制AP-1转录活性190A：c-Fos(ser32)和c-Jun(ser63)磷酸化水平；B：c-Jun(ser73)磷酸化水平；C：AP-1的转录活性（与NG#*组相比，P<0.05；与HG组相比，P<0.05）Fig.6INT-777significantlyinhibitedthephosphorylationofc-Jun/c-FosinGMCs,andactivationofTGR5significantlyinhibitedAP-1transcriptionactivityA:Thephosphorylationofc-Fos(ser32)andc-Jun(ser63);B:Thephosphorylationofc-Jun(ser73);C:#*195TranscriptionalactivityofAP-1(P<0.05vs.NG;P<0.05vs.HG)2.7TGR5和S1P2蛋白相互作用为了进一步探讨TGR5与S1P2的关系，我们猜测两者间存在直接或间接相互作用。结果显示，TGR5和S1P2在肾小球细胞细胞膜上存在共定位（Fig.7A），这为两者能够发生相互作用提供了分子基础。免疫共沉淀结果显示，TGR5与S1P2存在蛋白间相互作用200（Fig.7B）。-9- 中国http://www.paper.edu.cn科技论文在线图7TGR5和S1P2蛋白相互作用A：TGR5和S1P2在肾小球细胞细胞膜上存在共定位；B：TGR5与S1P2蛋白相互作用Fig.7TGR5interactedwithS1P2205A:TGR5andS1P2co-localizationonthemembraneofGMCs;B:TGR5interactedwithS1P23讨论近来研究表明，胆汁酸不仅可以助消化，还可以作为体内的信号分子，与体内胆固醇水平、脂类和糖类的代谢，以及炎症免疫反应的调控有密切的关系。在胆汁酸调控这些行为的210过程中，其细胞膜受体TGR5发挥了及其关键的作用。正常生理状态下，胆汁酸与膜受体[21]TGR5结合后G蛋白α亚基解离，激活腺苷酸环化酶，催化ATP生成第二信使cAMP。细胞内cAMP生成增多激活PKA，PKA进一步激活转录因子CREB，从而调控相关靶基因[22]的表达。激活TGR5能够促进GLP-1的分泌，引起胰岛素分泌增多，抑制胰高血糖素释[23,24]放，减慢胃排空的速度以及抑制食欲。血浆GLP-1升高能够加速血糖处置速率，降低[25]215血糖值。此外TGR5参与棕色脂肪组织和骨骼肌能量消耗的代谢调节过程。另有研究显[7]示：TGR5能够通过减少巨噬细胞炎症反应和脂质吞噬而预防动脉粥样硬化。同样LPS刺激的TGR5-/-和WT小鼠，喂以TGR5激动剂后的WT组小鼠，能够抑制炎症反应，从而保[8]护肝脏，而TGR5-/-组炎症加剧。TGR5活化后，激活Gs-蛋白，进而升高细胞内cAMP的[4]浓度，激活PKA蛋白激酶，从而抑制炎症通路的激活、炎症因子的表达。因此，TGR5[26]220激动剂在治疗2型糖尿病、调节糖脂代谢与抑制炎症反应方面存在相当广阔的前景。糖尿病状态下机体糖脂代谢紊乱、肾脏慢性炎性反应是糖尿病肾脏纤维化的重要的病因病机；而TGR5有明确的调节糖脂代谢及抗炎效应，肾脏亦是TGR5高表达的组织之一。我们实验结果表明：在糖尿病肾损伤模型动物肾组织及高糖培养的肾小球系膜细胞中，TGR5的表达与正常组相比明显低下；而激活TGR5能够明显抑制HG培养的GMCsFN、ICAM-1225以及TGF-β1的表达。提示TGR5在阻抑糖尿病肾脏纤维化病变进程中具有重要的调节作用。近年来研究发现：S1P可促进GMC的增殖，AGEs处理肾小球系膜细胞（GMC）后，-10- 中国http://www.paper.edu.cn科技论文在线[11,13,27]发现S1P增高，诱使GMC增殖、细胞外基质积聚；观察STZ诱导大鼠糖尿病模型后肾脏中SphK活性和S1P量的变化，结果发现随着肾小球系膜细胞增殖，肾脏中SphK活[28]性和S1P量均显著增加。提示S1P信号通路的激活参与糖尿病肾脏纤维化的病理进程。230如前所述：高血糖状态下、肾脏S1P的5个受体亚型以S1P2受体活化表达最明显，高糖活化的S1P信号通路通过促进核因子AP-1的DNA结合活性、显著增加GMC中FN等纤维化成分的表达，与肾脏纤维化病变的形成关系密切。鉴于与TGR5同为GPCR相关的S1P2信号通路的激活在糖尿病肾脏纤维化病变进程中的重要作用，TGR5抑制高糖诱导的GMC中ICAM-1、TGF-β1、FN、等炎性纤维化成分表达的机制是否可能与影响S1P/S1P2信号235通路相关联？据此开展了相关观察。结果发现：激活TGR5能够明显抑制HG引起的S1P2蛋白水平的上调，并且给予INT-777能够抑制AP-1活性，包括c-Jun/c-Fos磷酸化水平明显下调，AP-1转录活性明显降低。其次，免疫共沉淀的结果提示TGR5与S1P2存在蛋白间相互作用。当细胞长期暴露在某种形式的刺激下，细胞对刺激的反应将会降低或终止。如果细胞外240环境较长时间地维持高水平的激素水平，那么细胞通常要发生脱敏。对于大多数GPCR而言，GProtein-CoupledReceptorKinase（GRKs）磷酸化GPCR后促使β-arrestin结合到GPCR[29]上，导致GPCR内化失活。GPCR内化引起信号传递的中断，细胞外信号无法向细胞内[30]传递，而GPCR本身则进入溶酶体降解途径或者内体循环途径。本实验结果显示，在正常的生理状态下，TGR5和S1P2存在蛋白质相互作用，而给予INT-777激动TGR5后，发245现S1P2在细胞表面表达减少。免疫荧光结果进一步证实了INT-777激活TGR5后能够促使S1P2内化失活并且TGR5的这种作用能够维持较长的一段时间（达到24小时）。推测TGR5激活后能促使S1P2受体内化，阻止S1P/S1P2信号的传递，延缓糖尿病肾纤维化的发生发展。以上结果提示我们，激活TGR5能够抑制HG培养的肾小球系膜细胞AP-1的活化，进250而抑制FN、ICAM-1、TGF-β1的过度生成，其分子机制可能与TGR5抑制S1P2的活性有关。4结论从上述实验结果，我们初步得到了激活TGR5通过抑制S1P/S1P2通路、抵抗高糖诱导的GMCs相关炎性、纤维化成分表达的重要信息。TGR5可能在延缓、阻止糖尿病肾脏纤维255化的病理进程中起到积极作用，有望成为抑制糖尿病肾脏纤维化、抗DN的潜在作用靶点，值得进一步的研究证实。[参考文献](References)[1]Ichinose,K.,E.Kawasaki,andK.Eguchi,Recentadvancementofunderstandingpathogenesisoftype1260diabetesandpotentialrelevancetodiabeticnephropathy.AmJNephrol,2007.27(6):p.554-64.[2]Cove-Smith,A.andB.M.Hendry,Theregulationofmesangialcellproliferation.NephronExpNephrol,2008.108(4):p.e74-9.[3]Maruyama,T.,etal.,Identificationofmembrane-typereceptorforbileacids(M-BAR).BiochemBiophysResCommun,2002.298(5):p.714-9.265[4]Kawamata,Y.,etal.,AGprotein-coupledreceptorresponsivetobileacids.JBiolChem,2003.278(11):p.9435-40.[5]Katsuma,S.,A.Hirasawa,andG.Tsujimoto,Bileacidspromoteglucagon-likepeptide-1secretionthrough-11- 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