miR-590-3p及TFAM在氡致肺损伤中的表达改变.pdf 10页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnmiR-590-3p及TFAM在氡致肺损伤中的表达#改变**陶立静，裴炜炜，聂继华，童建5（苏州大学公共卫生学院，江苏苏州215000）摘要：目的：探讨miR-590-3p及线粒体转录因子A（MitochondrialtranscriptionfactorA，TFAM）在氡染毒致小鼠肺损伤过程中的表达改变及其机制。方法：以健康雌性Balb/c小鼠和支气管上皮细胞HBE为研究对象，建立氡染毒模型；采用HE染色检测小鼠肺组织的病10理变化；采用Realtime-PCR和Westernblotting检测小鼠肺TFAMmRNA和蛋白含量；采用Realtime-PCR检测miR-590-3p的表达水平；采用双荧光素酶报告基因系统验证miR-590-3p对TFAM的靶向调控关系。结果：HE染色结果显示氡染毒组小鼠肺损伤明显，且随着氡染毒剂量增加损伤加重；miR-590-3p的表达随着氡染毒累积剂量增加而降低；TFAM的蛋白表达水平随氡染毒剂量增加而显著上调。结论：氡染毒致使小鼠肺组织中TFAM随着15miR-590-3p表达的下降而上调，提示miR-590-3p可能通过TFAM信号通路参与氡致肺损伤的调控。关键词：氡；miR-590-3p；TFAM；小鼠肺损伤中图分类号：R11420AlterationinmiR-590-3pandTFAMexpressioninradon-inducedlunginjuryTAOLijing,PEIWeiwei,NIEJihua,TONGJian(MinistryofHealth,SchoolofPublicHealth,SoochowUniversity,Suzhou,JiangSu215000)Abstract:Objective:ToinvestigatetheexpressionchangesandpossiblemechanismsofmiR-590-3p25andmitochondrialtranscriptionfactorA(TFAM)inradon-inducedlunginjuryofmice.Methods:Healthyfemalemice(Balb/c)andbronchialepithelialcells(HBE)wereusedtodetectpathologicalchangesoflungtissuebyHEstaining;theproteincontentofTFAMinmouselungwastestedbyrealtime-PCRandWesternblotting;theexpressionofmiR-590-3pwasdetectedbyreal-timefluorescentquantitativePCR;thetargetedregulationofmiR-590-3ponTFAMexpressionwas30confirmedbydualluciferasereportergenesystem.Results:HEstainingshowedthattheleveloflunginjurywascorrelatedwiththeincreaseofdoseofradonexposure.TheexpressionofmiR-590-3pdecreasedwiththeincreaseofradonexposuredose,andtheproteinexpressionofTFAMsignificantlyincreasedwithradonexposuredose.Conclusion:TheexpressionofTFAMincreasedalongwiththedecreaseofmiR-590-3pinducedbyradonexposure,indicatingthatmiR-590-3pcouldbeanegative35regulatorofTFAMinradon-inducedlunginjury.Keywords:Radon;miR-590-3p;TFAM;mouselunginjury0引言222氡（Rn）是由地壳中的铀和镭衰变而产生的一种放射性惰性气体，广泛存在于人类生[1]40活和工作环境中。氡无色、无味、化学性质极不活泼，半衰期为3.8d，经过多次衰变最后稳定为铅并沉积在体内。氡衰变后产生一系列放射性子体，约占人类接触的本底辐射的[1]50%。研究显示氡是目前仅次于吸烟导致人类肺癌的第二大影响因素,而肺是氡及其子体基金项目：国家自然科学基金(81402626)作者简介：陶立静（1989-），女，硕士生，放射毒理学通信联系人：童建，教授，主要从事化学物与辐射的细胞与分子毒性机制研究.E-mail:tongjian@suda.edu.cn-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn[2]的重要靶器官。含氡的放射性气溶胶主要沉积在呼吸道表面，所发射出的α粒子对支气管和肺上皮细胞产生高LET照射，可引起染色体畸变和基因突变，从而导致肺损伤甚至致癌[2]45。因此，研究氡及其子体暴露导致肺损伤的分子机制，对于预防和控制氡对人类健康的危[3]害具有重要的指导意义。微小RNA，即MicroRNA（miRNA），是由22个左右的核糖核苷酸组成的内源性非编[4]码单链RNA分子，近年来发现miRNA是一类重要的调控分子，与特定的靶向基因结合，以完全或不完全结合的互补结合的方式，在转录后发挥着重要的调控作用。研究表明，50miRNA广泛参与调控胚胎的发育、脂肪的代谢、肿瘤、细胞的增殖和凋亡以及干细胞的分[4][5]化等过程。一些研究数据显示，miRNA与肺癌的发生、发展具有密切关系。前期研究发现α粒子能够使人支气管上皮细胞增殖加速，细胞出现异常生长，具有恶性转化趋势，过程[5]中伴随大量miRNA表达的改变，提示这些miRNA参与了细胞恶性转化过程。线粒体转录因子A(mitochondrialtranscriptionfactorA，TFAM)是一类核编码的线粒体55转录调控因子，通过胞浆进入线粒体之后，具有启动线粒体DNA(mitochondrialDNA，[6]mtDNA)转录、复制，以及维持mtDNA的和功能的作用。细胞的生长和增殖需要线粒体产[7][8]生ATP以提供能量，而TFAM在其中起重要作用。栾岚等人发现TFAM高表达与非小细胞肺癌的发生发展相关，且可以作为生物学标记用于预测肿瘤的预后。miR-590-3p是位于人类基因组7号染色体长臂的近端，它的成熟序列为[9][9]60UAAUUUUAUGUAUAAGCUAGU。研究发现miRNA可抑制癌转移扩散，然而miR-590-3p在氡染毒致肺损伤中的作用机制，尚未见报道。本研究探讨miR-590-3p对TFAM的调控关系，以及是否参与氡染毒导致小鼠的肺损伤，从而为氡致肺癌的机制研究提供新的实验资料。1试剂与仪器651.1主要试剂高糖DMEM培养基（Hyclone），SYBRPCRMix（ABApplied，USA），TIANamp血液/细胞/组织基因DNA提取试剂盒；miRNA荧光定量检测试剂盒(吉玛基因)，实时PCR引物(上海吉玛基因)；miR-590-3p-mimics，miR-590-3p-inhibitor，由上海吉玛基因生物设计合成；miRNA转染试剂（Lipofectamine®3000试剂，购自Invirtrogen公司），ATP检测试剂70盒（碧云天生物技术公司）；Tublin一抗(Abcam)，羊抗兔二抗(美国Cellsignaling-Technology)，兔多克隆TFAM抗体。1.2主要仪器多功能生态氡室（HD-3型，华东地质学院），高速离心机（Beckman公司），CO2细胞培养箱(美国ThermoScientificSeries8000)，酶标仪(美国ThermoMultiskanMK3)，7500型实75时荧光定量PCR仪（AppliedBiosystems公司），Western电泳仪（Bio-Rad公司），倒置荧光显微镜(德国AxioObserverZ1)。-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn2实验和方法2.1实验动物及氡染毒处理雌性BALB/c小鼠16只（上海斯莱克实验动物有限公司），8周龄，体重17～23g，随80机分为正常对照组、3个氡染毒组共4组，每组4只。染毒组小鼠整体暴露在多功能生态氡室，每天染毒12h，每周暴露6d，期间保证动物正常饮水与进食。氡室内浓度设定100000Bq/m3，通过计算机控制保持恒定剂量率，累积受照剂量分别为30、60、120WLM。1WLM是指在1.3×108MeV/m3氡子体α潜能下暴露一个月（170h）接受的照射量。对照组动物在动物房本底水平下饲养。852.2支气管上皮细胞HBE培养及氡染毒处理支气管上皮细胞（HBE）在10%胎牛血清含量的高糖DMEM培养基（添加100U/mL青霉素G和100U/mL链霉素)中培养，培养箱的培养环境为37°C、5%CO2，每2d换一次培养基，每4d传代1次。选取与对照组生长周期一致的细胞作为氡染毒组，将细胞暴露于320000Bq/m氡浓度的多功能生态氡室，染毒30min。连续染毒2次作为染毒1代，分别氡染90毒5代（Rn5）、10代（Rn10）。2.3HE染色和免疫组化(immunohistochemistry，IHC)HE染色步骤为：取小鼠肺组织4%多聚甲醛溶液中固定，常规脱水透明、浸蜡、包埋、切片、贴片、HE染色等步骤之后，中性树胶封片，显微镜下观察。免疫组化步骤为：先将未染色的石蜡样本切片进行常规脱蜡处理，之后在高温高压环境下采用0.01mol/L柠檬酸缓95冲液抗原修复3-4min，内源性过氧化物酶37°C孵育10min，一抗4°C孵育过夜。次日TFAM抗体，辣根过氧化物酶37°C孵育30min，链霉素过氧化物酶37°C孵育30min，DAB溶液显色，苏木素染核处理，再通过二甲苯、乙醇常规脱水透明处理，最后中性树胶封片。在放大100倍和400倍视野下，每张切片观察至少5个视野。2.4荧光定量PCR检测miR-590-3p表达100先用预冷的PBS清洗各组细胞，Trizol法提取小鼠肺组织以及细胞的RNA，使用酶标仪检测RNA的浓度和纯度，A260nm/A280nm比值应在1.8~2.0之间。取RNA2.5μg，使用PrimeScript®RT-PCRKit逆转录合成cDNA。经逆转录后以u6作为内参，使用SYBR®PremixExTaqTM配制PCR反应液，每份含cDNA模板2μg。所有引物在优化实验确定的退火温度下具备良好的特异性(单峰溶解曲线)。使用实时荧光定量PCR仪进行实时荧光定量PCR反105应：循环1:95°C3min，循环2:95°C30s→退火温度30s→72°C30s(荧光强度检测)，循环3:72°C3min，循环4:溶解曲线(由72°C升至95°C，步幅0.5°C)。取Ct值作为测量值，采用2–ΔΔCt法对miR-590-3p和U6基因的表达水平进行定量，计算各基因的相对表达量。每个检测样品均设3个平行样品，重复至少3次，引物由吉玛基因公司设计合成。ΔΔCt=(染毒组目的基因Ct值均数−染毒组GAPDHCt值均数)−(对照组目的基因Ct值均数−对照组110GAPDHCt值均数)。-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn2.5Westernblotting检测TFAM蛋白水平表达用RIPA裂解液提取小鼠肺组织蛋白，提取各组小鼠肺组织和支气管上皮细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，将相同含量的蛋白样品和上样缓冲液按照适当的体积加以混合，再在100°C的水浴锅内煮沸保持5min，使蛋白充分变性，经10%SDS-PAGE分离蛋白，湿转115至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉和TBST混合溶液置于室温下封闭2h，一抗稀释比例均为1：500，4℃孵育过夜；次日TBS洗膜3次/10min，加入1：2000稀释的二抗在室温孵育1~2h，TBS洗膜3次/10min，以β-actin作为内参，最后在暗室用化学发光试剂盒使蛋白条带显色并曝光显影成像。实验重复三次且独立完成。2.6TargetScan预测和双荧光素酶报告基因检测miR-590-3p和TFAM靶向调120控关系通过TargetScan(www.targetscan.org)在线预测miR-590-3p的靶基因（见图4A）。验证miR-590-3p是否靶向调控TFAM，我们构建TFAM3’-UTR克隆及TFAM3’-MUT-UTR载体，与miR-590-3p-mimics共转染HBE细胞，用双荧光素酶报告基因检测荧光素酶活性，以验证miR-590-3p与TFAM是否具有靶向调控关系。荧光素酶报告基因检测采用上海吉玛基因125生物设计合成双荧光报告基因检测试剂盒进行，启动子的转录活性根据萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性的比值校正转染效率后计算。2.7统计学分析以上所有试验均重复3次以上，结果来源于代表性的实验。数据以均数±标准误表示，用GraphPadPrism5.0处理统计结果。用one-wayANOVA分析对照组与试验组间的统计学130差异，并用posthocanalysis分析组间差异。统计学分析用SPSS软件分析，P<0.05，则数据有统计学意义。3结果3.1氡染毒致小鼠肺组织的病理变化在图1可见小鼠肺组织在光镜下HE切片染色可见，对照组小鼠肺泡间隔正常，肺组织135结构未出现异常，支气管腔内视野干净清晰，基底膜正常。各氡染毒组小鼠肺组织出现不同程度的炎性细胞浸润及纤维组织增生，并随氡染毒剂量的增加，炎症细胞浸润逐步增加（黑色箭头表示），泡腔面积减少，120WLM出现显著的肺泡断裂（红色箭头表示），肺大泡形成，肺间质充血水肿，肺巨噬细胞大量增生；提示氡及其子体引起了肺组织的炎症损伤（图1）。1403.2氡染毒小鼠肺组织及支气管上皮细胞HBE中TFAM的蛋白表达变化realtime-PCR结果显示，氡染毒5、10代HBE细胞中TFAMmRNA的表达显著增加，并呈现一定的剂量效应关系（如图2A）。Westernblotting检测结果显示：在蛋白表达水平，TFAM蛋白的表达也显著增加（如图2B）。免疫组化结果检测显示，氡染毒组小鼠肺组织中TFAM阳性表达细胞数显著高于对照组，同时120WLM氡染毒组阳性细胞数又显著高于145其他剂量染毒组（图2C）。-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnA.对照组（×100）B.氡染毒30WLM（×100）C.氡染毒60WLM（×100）D.氡染毒120WLM（×100）E.对照组（×400）F.氡染毒30WLM（×400）G.氡染毒60WLM（×400）H.氡染毒120WLM（×400）图1氡染毒小鼠肺组织病理变化（HE染色）150Fig.1Pathologicalchangesinlungtissueofradonexposedmice(HEstaining)a.对照组（×100）b.氡染毒30WLM（×100）c.氡染毒60WLM（×100）d.氡染毒120WLM（×100）e.对照组（×400）f.氡染毒30WLM（×400）g.氡染毒60WLM（×400）h.氡染毒120WLM（×400）155图2氡染毒对小鼠肺组织及支气管上皮细胞HBE中TFAM的表达影响2A支气管上皮细胞HBE中TFAM的mRNA表达变化2B小鼠肺组织Westernblotting中TFAM的蛋白表达改变-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn2C小鼠肺组织TFAM蛋白免疫组化染色结果Fig.2EffectsofradonexposureontheexpressionsofTFAMinmouselungandbronchialepithelialcells1602AexpressionsofTFAMmRNAinbronchialepithelialcells(HBE)2BexpressionsofTFAMproteininlungtissuesofmicebyWesternblotting2CimmunohistochemicalstainingofTFAMproteininmicelungtissues3.3miR-590-3p在小鼠肺组织及支气管上皮细胞HBE中的表达变化在小鼠肺组织及支气管上皮细胞HBE中，氡染毒组的miR-590-3p表达量均低于对照组，165其中120WLM氡染毒剂量组小鼠肺组织的miR-590-3p表达水平与对照组相比降低了50%，支气管上皮细胞氡染毒10代HBE的miR-590-3p比对照组下降了80%（图3）。表明随着氡染毒累积剂量的增加，miR-590-3p的表达呈下降趋势。图3氡染毒对小鼠肺组织及支气管上皮细胞HBE中miR-590-3p的表达水平的影响1703A小鼠肺组织中miR-590-3p的表达变化3B支气管上皮细胞HBE中miR-590-3p的表达变化Fig.3EffectsofradonexposureontheexpressionsofmiR-590-3pinmouselungandbronchialepithelialcells3AexpressionsofmiR-590-3pinmicelungtissues3BexpressionsofmiR-590-3pinbronchialepithelialcells(HBE)1753.4miR-590-3p对TFAM靶向关系的预测及验证采用miRNA靶基因预测软件TargetScan预测显示：miR-590-3p可以作用于TFAM的3’-UTR（图4A）。为了验证该预测，构建了TFAM3’-UTR克隆及TFAM3’-MUT-UTR载体，与miR-590-3p-mimics共转染支气管上皮细胞HBE，再通过双荧光素酶报告基因检测荧光素酶活性，从而验证miR-590-3p与TFAM的靶向调控关系。在图4B中，共转染TFAM3’-UTR180野生重组质粒和miR-590-3Pmimics的细胞样本中，双荧光素酶活性强度较对照组显著增加；但在共转染TFAMmut-3’-UTR重组质粒和miR-590-3Pmimics的细胞样本中，双荧光素酶活性强度与对照组的差异无统计学意义，提示miR-590-3P与TFAM基因3’-UTR区确实存在着靶向作用关系。-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn185图4miR-590-3p对TFAM靶向关系的预测及验证结果4A双荧光素酶验证miR-590-3p对TFAM靶向关系4BTargetScan预测miR-590-3p对TFAM的作用关系Fig.4predictionandverificationofmiR-590-3ptargetedTFAM4AtherelationshipofmiR-590-3ptargetingtoTFAMwasconfirmedbydoubleluciferaseassay1904BthepredictsofmiR-590-3pregulatesonTFAMbyTargetScan4讨论肺癌是威胁人类健康的主要杀手之一，流行病学及临床研究表明，氡及其子体是诱导肺[10]癌发生发展的重要影响因素，但其具体的致癌机制还未完全阐明。本实验将小鼠整体暴露于多功能生态氡室，吸入氡气达到一定累积剂量后，在30wlm、60wlm、120wlm组的小195鼠肺组织中，均出现不同程度的细胞浸润及肺泡断裂，并且随氡染毒剂量的增加，肺组织的[10]损伤逐渐加重，与以往的报道一致。发生炎症的细胞会释放一些有害物质(如自由基和炎[11]症因子等)从而影响肺组织的功能。[12]已知miRNA参与细胞的生长、增殖、侵袭、凋亡等多个环节的生物学过程，以及肿[13][14]瘤细胞的发生发展。同时，也有报道miRNA的异常表达与氡致肺损伤的发生相关。本200实验结果证实，在氡染毒小鼠肺组织和支气管上皮细胞中，miR-590-3p表达显著减少，提示miR-590-3p可能参与了氡致小鼠肺损伤的过程。[15]TFAM是线粒体DNA的核心转录因子，调控线粒体转录和复制的重要因子。在线粒体氧化呼吸功能处于缺陷或氧化应激的状况时，TFAM可刺激线粒体的生成以及mtDNA的[15]转录增加。糖的有氧代谢水平降低和无氧酵解升高是肿瘤细胞的普遍现象，因此对缺氧205的耐受是肿瘤细胞的代谢特点。在肺癌、结直肠癌癌、子宫内膜癌等肿瘤细胞中，TFAM蛋-7- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn[16,17,18,19]白表达水平均显著降低；对TFAM进行过表达之后，可改变癌细胞的侵袭及迁移能[16,17,18,19]力，提示TFAM与肿瘤的发生发展过程密切相关。本实验中通过免疫组化和Westernblotting显示，TFAM的表达随氡染毒剂量增加而增加，其蛋白表达水平也随之上升，为证[20]实TFAM在肿瘤发生中作用提供了新的实验资料。210氡致小鼠肺损伤中miR-590-3p表达量的降低与TFAM表达量的上调之间是否存在关联，我们采用TargetScan预测miR-590-3p和TFAM的潜在靶向关系，通过双荧光素酶报告[21]基因检测系统，验证两者之间具有靶向调控关系，与宫伟强等人的文献报道一致，说明miRNA参与细胞各种生理活动，如细胞的生长、增殖和凋亡，并且炎症因子对癌细胞的转[20]]移能力有重要的影响。TFAM是一类调控线粒体活性功能的重要因子，可通过特异性的215方式与变异或受损的线粒体DNA序列结合，使线粒体DNA结构保持稳定，从而避免DNA[20]受损引起细胞的凋亡。研究显示，TFAM是参与线粒体能量代谢的重要因子，为细胞的[22]各种生物学反应源源不断地提供能量。在细胞内线粒体数量改变时，将会改变细胞的能[22]量代谢水平，这会导致细胞出现一些生理生化状态的变化，本实验结果提示TFAM含量变化可参与氡染毒导致的肺损伤现象。由于细胞的生长和增殖需要线粒体产生ATP提供能220量，因此本实验结果为氡致肺损伤的分子机制提供了实验依据。5结论综上所述，本实验结果提示miR-590-3p和TFAM在氡致肺损伤过程的异常表达，该两[23,24]者可作用于线粒体的调控通路，从而影响线粒体mtDNA的生成和线粒体的能量代谢，最终对氡染毒对肺损伤产生一定的调控作用。miR-590-3p和TFAM的相互调控可影响线粒225体的能量代谢水平从而参与氡致肺损伤的发展过程。miR-590-3p的降低和TFAM的上调改变，对于研究氡染毒致肺损伤的具体作用机制开拓了新的思路，其损伤和致癌可能机制，还需要更深入的研究加以阐明。[参考文献](References)[1]童建，洪承皎，王静等.氡及其子体对大鼠外周血淋巴细胞DNA的损伤效应[J].辐射研究与辐射工艺230学报，2001（03）：236-238.TONGJ,HONGCJ,WANGJ,etal.DNAdamageofperipheralbloodlymphocytesinrats[J].Radiat.Res.Radiat.Process.2001（03）：236-238.[2]聂继华，武彦文，陈志海，童建等.氡吸入染毒对大鼠肺组织的DNA氧化损伤效应[J].辐射研究与辐射工艺学报，2011，(06)：29-03.NIEJH,WUYW,CHENZH,etal.OxidativeDamageInducedbyRadonInhalationinLungTissueofRats[J].Radiat.Res.Radiat.Process,2011，(06)：29-03.235[3]顾超，聂继华，陈志海，等.α粒子照射致人支气管上皮细胞恶性转化中的线粒体改变[J].辐射研究与辐射工艺学报，2013，(04)：37-41.GUC,NIEJH,CHENZH,etal.Mitochondrialchangesduringmalignanttransformationofhumanbronchialepithelialcellsbyirradiate[J].Radiat.Res.Radiat.Process.2013，(04)：37-41.[4]薛逸荃,曹雪涛.RNA异常与肿瘤调控研究进展[J].中国肿瘤生物治疗杂志2013;20(1):1-12.XUEYQ,CAOXT.ResearchProgressofRNAAbnormalityandTumorRegulation[J].ChineseJournalofCancer240Biotherapy2013;20(1):1-12.[5]NieJH,ChenZH,ShaoCL,etal.AnalysisofthemiRNA-mRNAnetworksinmalignanttransformationBEAS-2Bcellsinducedbyalpha-particles.[J].ToxicolEnvironHealthA.2016;79(9-10):427-35.doi:10.1080/15287394.2016.1176628.-8- 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