参芪解郁方对产后抑郁大鼠TregTh17平衡的干预作用研究.pdf 7页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn参芪解郁方对产后抑郁大鼠Treg/Th17平#衡的干预作用研究1211**曲淼，李净娅，赵瑞珍，唐启盛5（1.北京中医药大学第三附属医院,北京100029；2.浙江省中医院,浙江杭州310006）摘要：目的：观察产后抑郁症模型大鼠Treg/Th17细胞比例的变化，阐明参芪解郁方对Treg/Th17平衡的干预作用。方法：SD雌性大鼠随机分为正常组、假手术、模型组、中药组10和西药组，分设灌胃1、2、4周三个时点。采用流式细胞术检测三个时点各组大鼠外周血Treg细胞和Th17细胞比例，并计算Treg/Th17比值。结果：1w、2w模型组Treg/Th17较正常组明显升高（P<0.01），而4w模型组Treg/Th17较正常组明显降低（P<0.01），4w中药组较模型组升高明显（P<0.01）。结论：参芪解郁方可通过调控Treg/Th17的失衡状态发挥抗抑郁作用。15关键词：产后抑郁症；参芪解郁方；Treg/Th17平衡中图分类号：R285.5ImmunedysregulationonregulatoryTcellsandTh17cellsinpostpartumdepressionandtherolesof20Shen-Qi-Jie-Yu-Fang1211QuMiao,LiJingya,ZhaoRuizhen,TangQisheng(1.ThirdaffiliatedhospitalofBeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029;2.ZhejiangProvicialHospitalofTCM,Hangzhou310006)Abstract:IObjective:Shen-Qi-Jie-Yu-Fang(SJFang),establishedbyourteamleaderDr.Tang,was25oneoftheusefultherapyofpostpartumdepression(PPD)inTraditionalChineseMedicine(TCM).SJFangwastonifyingdeficiency,removingbloodstasis,nourishingbrainandinducingresuscitation.However,theimpactofimmunesystemofSJFangonPPDwasstillunknown.So,thepresentstudywasdesignedtoexploretheimmunomodulationeffectofSJFangonregulatoryTcellsandTh17cells.MaterialsandMethods:NinetyFemaleSprague-Dawleyratsweredividedintofivegroupsrandomly.30PPDratsweremodelingwithhormonesimulatedpregnancy(HSP).RatsinPPDgroupwereovariecImmunedysregulationonregulatoryTcellsandTh17cellsinpostpartumdepressionandtherolesofShen-Qi-Jie-Yu-Fangtomizedbilaterally,butratsinshamgroupwereexteriorizedwithassociatedfatpadnearovary.Theninjectionofprogesteroneandestradiolbenzoatewasadministeredfor23days.Onday24,theinjectionswereterminatedtoinitiatehormonewithdrawal.AfterHSP35modelprocedure,ratsweregavageadministratedfor1week,2weeksand4weeks.Immediately,behavioralassessmentsofsucroseconsumptionandforcedswimtest(FST)wereconducted.ImmuneimbalancestatuswasobservedinanalyzinglevelsofregulatoryTcellsandTh17cellsinperipheralbloodmononuclearcellswithflowcytometry.Results:TheresultssuggestedthatTregcellsdepletionmodulatedalterationsinPPD,SJFangcouldimprovethepostpartumdepressivestatus.Conclusions:40ImbalanceofTregcellsandTh17cellsmaybeapotentpathogenesisofPPD,andSJFangcouldbeaneffectivetherapeuticforregulatingTregcellsandTh17cellsinPPD.Keywords:postpartumdepression;Shen-Qi-Jie-Yu-Fang;Treg/Th17基金项目：教育部博士点基金项目优先发展领域（20130013130002）;北京中医药大学创新团队项目（2011-CXTD-26）作者简介：曲淼(1985-),女,主治医师,主要研究方向:中医药防治脑病的基础与临床研究通信联系人：唐启盛(1956-),男,教授/主任医师/硕导/博导,主要研究方向:中医药防治脑病的基础与临床研究.E-mail:tangqisheng@263.net-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn450引言产后抑郁症（PostpartumDepression,PPD）是一种严重影响母婴身心健康的精神情绪障碍性疾病，因西药可通过乳汁对婴儿产生不良影响，多数患者及家属不愿接受治疗，而中医药治疗PPD的副作用小，且不影响产后哺乳，具有一定的疗效优势。PPD是抑郁症的亚型，其发病机制与抑郁症有较多相似之处。目前50认为PPD的生物学发病机制与神经、生殖、内分泌系统的下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA）轴和下丘脑-垂体-性腺[1]（hypothalamic-pituitary-gonadal,HPG）轴的平衡紊乱密切相关，本课题组的前[2-7]期研究亦发现，参芪解郁方可调节HPA轴、HPG轴的激素水平、受体功能、单胺类神经递质及其代谢产物的变化，改善上述各系统间的失衡状态，从而发挥55治疗PPD的作用。随着抑郁症细胞因子假说的提出，认为PPD发病与细胞的免疫调节有关。目前，PPD发病与Treg/Th17的平衡状态尚不明确。本研究通过观察PPD模型大鼠Treg/Th17的平衡状态，揭示参芪解郁方对Treg/Th17平衡的干预作用，为中医药对PPD的免疫调节作用提供依据。1材料601.1动物SPF级雌性SD大鼠150只，体重210±10g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK（京）2012-0001。1.2试剂苯甲酸雌二醇注射液（140429，杭州动物药品厂），黄体酮注射液（131014，65上海通用药业股份有限公司），外周血淋巴细胞分离液（天津灏洋生物制品科技有限责任公司），CellActivationCocktail(withBrefeldinA)（美国Biolegend公司）®anti-ratCD4PerCP-eFluor710(美国eBioscience公司)，anti-ratIL-17APE(美国eBioscience公司)，FITCanti-ratCD25(美国Biolegend公司)，PEanti-ratFoxP3(美国Biolegend公司)，FoxP3Fix/PermBufferSet(美国Biolegend公司)，Fixation70Buffer(美国Biolegend公司)，PermeabilizationWashBuffer(美国Biolegend公司)，胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），RPMI-1640培养基（美国®InvitrogenGibcobyLifeTechnologies），多聚甲醛（20130815，北京化学试剂公司）。1.3仪器75强迫游泳水缸：直径25cm、高度60cm的圆柱形玻璃缸（自购）。OLYMPUSCKX41SF倒置式生物显微镜（日本奥林巴斯公司）、SW-CJ-ID型单人单面洁净-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn工作台（苏州苏洁净化设备有限公司）、CO2恒温培养箱（美国Thermo公司）、FACSCaliburFlowCytometerSystem型流式细胞仪（美国BD公司）。1.4药物80参芪解郁方中药配方颗粒黄芪、党参等（北京康仁堂药业有限公司）按成人用量（20mg/60kg·d）7倍计算大鼠用量，生药量为1.25g/ml，使用前按灌胃剂量煎药浓缩。盐酸氟西汀胶囊（2090A，礼来苏州制药有限公司），按生药量0.25mg/ml溶于蒸馏水，贮存于4℃冰箱中备用，临用前加热。2方法852.1分组与给药150只雌鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、中药组和西药组，每组设灌胃1w、2w、4w三个时点，每个时点10只大鼠。造模结束后进行药物干预，灌胃体积为1ml/100g体重。中药组予参芪解郁方，西药组予盐酸氟西汀胶囊，正常组、假手术组和模型组予等量双蒸水。各组分别于灌胃1w、2w、4w后进90行行为学测试并取材。实验中动物自由摄食饮水（术前及蔗糖水消耗实验除外），自然光照，室温20-22℃，相对湿度为60%-70%，光照周期为12h（8:00～20:00）。2.2模型制备采用目前国际公认的激素模拟妊娠状态后突然停撤法（Hormone-simulated[8]pregnancy,HSP）制备，大鼠行双侧卵巢切除术，假手术组仅摘取卵巢周围少95许脂肪组织。术后连续5天行阴道涂片筛查，存在动情周期者剔除。去势手术合格动物前16天每日皮下注射雌二醇注射液0.1ml（2.5μg）和黄体酮注射液0.2ml（4mg），后7天每日注射雌二醇注射液0.1ml（50μg），假手术组动物前16天每日皮下注射芝麻油0.3ml，后7d每日注射芝麻油0.1ml，第24天停止注射。2.3行为学评价1002.3.1强迫游泳实验将大鼠置于温水缸内预游泳15min。结束后放回鼠笼。24h后进行强迫游泳正式实验，在相同环境条件下记录大鼠5min内的不动状态（在水中停止挣扎呈直立漂浮状态，或仅有偶尔的肢体运动以保持头部浮在水面）时间。2.3.2蔗糖水消耗实验105测试前禁水24h，检测大鼠1h内1%蔗糖水的消耗量。蔗糖水消耗量=测定前瓶重（g）－测定后瓶重（g）。2.4流式细胞术检测Treg和Th17细胞比例取3ml动脉血，离心后加PBS混匀，加淋巴细胞分离液，取淋巴细胞层。-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn6RPMI1640培养基洗涤两次，弃上清，调节细胞浓度到1×10个细胞/100μl。110取PBMC悬液100μl加入PerCP抗大鼠CD4和FITC抗大鼠CD25各2μl混匀，避光孵育后用CellStainingBuffer2ml，离心后弃上清；加1×FoxP3Fix/PermBufferSet1ml，避光20min；加CellStainingBuffer2ml，离心弃上清；加FoxP3PermBuffer(1×)1ml，离心弃上清；加FoxP3PermBuffer(1×)，1ml，室温避光15min，离心弃上清；加FoxP3PermBuffer(1×)，100μl，重悬细胞；115加PE抗大鼠FoxP3，5μl，室温避光30min；再加入CellStainingBuffer，1ml，离心弃上清。加1%多聚甲醛0.2ml固定，锡纸包好，待上机检测。上机分析，+++以CD4、CD25设门区分出CD4CD25双阳性细胞，再测定FoxP3细胞并以散点图表示。取PBMC悬液100μl加入PerCP抗大鼠CD4，2μl，避光孵育30min；加120入RPMI-1640培养基100μ（含l10%胎牛血清）和1×CellActivationCocktail(withBrefeldinA)4μl，放入37℃，5%CO2恒温箱培养6h。用CellStainingBuffer，2ml，离心弃上清；加FixationBuffer，0.5ml，室温避光20min，离心弃上清；加两次1×PermeabilizationWashBuffer，1ml，离心弃上清；加PE抗大鼠IL-17A，1μl，室温避光20min；加两次CellStainingBuffer，2ml，离心弃上清；加1%多聚+125甲醛0.2ml固定，锡纸包好，待上机检测。以CD4直方图设门区分出CD4细胞，+以散点图表示IL-17细胞，用CellQuest软件获取并分析数据。2.5统计学方法统计结果以均数（x）±标准差（s）表示，采用SPSS15.0软件。计量资料符合正态分布者，两组间比较用独立t检验，多组间比较用one-wayANOVA分130析，方差齐采用LSD法进行两组间比较；非正态分布者用非参数检验，用Kruskal-WallisH法进行组间比较，以P<0.05为差异有统计学意义。3结果3.1行为学测试3.1.1强迫游泳不动时间135见表1。灌胃各时点模型组大鼠不动时间比同时点正常组明显增加（P<0.01）；灌胃后各时点中、西药组较模型组显著减少（P<0.01）。140-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn表1三个时点强迫游泳不动时间比较（xs，s，n=10）组别1周2周4周91.63±13.3696.79±9.3994.11±9.35正常组90.58±12.7297.84±11.4796.53±12.94假手术组******144.35±12.47159.21±14.26145.97±8.57模型组**△△△△△△123.47±8.47111.25±11.13100.69±11.35中药组**△△**△△△△119.28±6.38116.31±18.48105.36±7.59西药组**△△注：与同时点正常组比较P<0.01；与同时点模型组比较P<0.01。1453.1.2蔗糖水消耗量见表2。灌胃各时点模型组大鼠蔗糖水消耗量比正常组明显减少（P<0.01）；灌胃2w和4w后，中药组和西药组比模型组增加明显（P<0.05，P<0.01），且各时点间无差异（P>0.05）。表2三个时点蔗糖水消耗量比较（xs，g，n=10）组别1周2周4周13.67±1.4613.59±1.8813.47±1.59正常组12.97±1.7612.79±1.6712.77±1.28假手术组******8.01±1.686.32±1.654.58±1.76模型组****△*△△8.87±1.658.55±0.989.87±1.86中药组***△△*△△9.65±1.5910.87±1.499.58±1.49西药组***△△△注：与同时点正常组比较P<0.05，P<0.01；与同时点模型组比较P<0.05，P<0.011503.2外周血Treg/Th17比值见表3，1w、2w模型组较正常组Treg/Th17明显升高（P<0.01），而4w模型组较正常组Treg/Th17明显降低（P<0.01）；1w和2w中、西药组较模型组降低，2w西药组较模型组降低明显（P<0.05）；4w中、西药组较模型组明显升高（P<0.01）。表3三个时点Treg/Th17比值（xs，n=10）组别1周2周4周正常组3.08±0.452.89±0.546.65±0.78假手术组3.03±0.162.93±0.616.73±0.83******模型组5.36±1.275.21±1.943.12±0.58*△△中药组4.45±1.333.97±0.895.86±0.66*△△△西药组4.41±0.993.14±0.695.48±1.47***△△△155注：与同时点正常组比较P<0.05，P<0.01；与同时点模型组比较P<0.05，P<0.01。-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn4讨论HSP后激素停撤模型目前已被国内外多数学者公认，PPD模型大鼠的行为学评价通过观察大鼠强迫游泳的不动时间进以评价其行为绝望状态，利用蔗糖水消耗实验评价大鼠的快感缺乏状态。本研究表明PPD大鼠模型制备成功，参芪160解郁方可以改善PPD大鼠的抑郁行为。近年来，随着Th17细胞亚群的发现，Treg/Th17对机体免疫平衡的调节机+制得到关注。Treg细胞是一类具有负调节功能的CD4T细胞亚群，参与自身免疫调节，控制免疫应答强度，维持机体内环境的稳定，是机体内以主动方式获得[9-10]和维持自身耐受的重要方式。与此相反，Th17细胞在炎症反应、先天性免疫165和获得性免疫疾病等过程发挥重要作用。Treg/Th17比例在一定程度上反映了机体免疫系统的状态。一旦Treg/Th17平衡受到破坏，则诱导机体发生免疫抑制及炎症反应，引起相关疾病的发生。本实验结果显示，PPD大鼠Treg/Th17失衡，表明Treg/Th17失衡与PPD发病密切相关，参芪解郁方可通过调控Treg/Th17平衡发挥治疗作用。170[参考文献](References)[1]朱跃兰,唐启盛,杨歆科,等.产后抑郁症生物学相关病因及发病机制研究进展[J].北京中医药,2013,32(3):168-176.[2]侯秀娟,唐启盛,杨歆科,等.参芪解郁方对产后抑郁大鼠行为学与脑组织形态学改变的干预研究[J].北京175中医药,2013,32(3):177-182.[3]侯秀娟,唐启盛,杨歆科,等.参芪解郁方对产后抑郁大鼠单胺递质及其代谢产物变化的干预研究[J].北京中医药,2013,32(3):182-188.[4]杨歆科,唐启盛,朱明瑾,等.参芪解郁方对产后抑郁大鼠神经内分泌系统相关激素变化的干预研究[J].北京中医药,2013,32(3):188-194.180[5]赵瑞珍,杨歆科,唐启盛,等.参芪解郁方对产后抑郁大鼠脑组织ER表达分布的干预研究[J].北京中医药,2013,32(3):195-199.[6]ZhaoR,QuM,TangQ,etal.RolesofShen-qi-jie-yu-fanginPostpartumDepressionRats:EthologicalEvaluationofAnhedoniaandUnderlyingMotivation[J].EuropeanJournalofIntegrativeMedicine,2014,6(2014):737-738.185[7]TangQ,ZhaoR,QuM,etal.OpenFieldTest:BehaviorsResponsetoExperimentalTimingDuringCircadianVariationinPostpartumDepressionRats[J].EuropeanJournalofIntegrativeMedicine,2014,6(2014):737.[8]GaleaLA,WideJK,M.barrA.Estradiolalleviatesdepressive-likesymptomsinanovelanimalmodelofpost-partumdepression[J].BehaviouralBrainResearch,2001,1(122):1-9.[9]SP,HC.RegulatoryTCellsandAutoimmuneDisease[J].ImmunolRev,2005,204(1):195-207.-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn190[10]刘清泉,黄长形.CD4+CD25+调节性T细胞和感染免疫[J].医学研究生学报,2006,19(8):741-744.-7-'