利用番茄红素提高细胞重编程效率的研究.pdf 7页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn#利用番茄红素提高细胞重编程效率的研究1,234**李荔，况二胜，柯琼（1.中山大学中山医学院药理学教研室，广东广州510080；52.哥伦比亚大学医学中心肺、过敏和重症监护内科肺生物学实验室，美国纽约10032；3.中山大学中山医学院人类病毒学研究所，广东广州510080；4.中山大学干细胞与组织工程中心教育部重点实验室，广东广州510080）摘要：目的：前期研究证实缝隙连接蛋白43（Connexin43，CX43）能促进细胞重编程效率，10而番茄红素被证实能促进CX43的表达，本研究进一步探讨番茄红素是否能促进诱导多能干细胞的形成。方法：利用荧光定量PCR及Westernblot观察番茄红素对人成纤维细胞表达CX43的影响，利用碱性磷酸酶染色及TRA-1-60免疫组化染色的方式检测番茄红素对诱导多能干细胞形成效率的影响。结果：番茄红素能有效增加人皮肤成纤维细胞中CX43蛋白的表达，其表达量为对照组的2倍（10μM）。在细胞重编程过程中，番茄红素（10μM）实验15组AP阳性克隆数增加，克隆形成率约为对照组的2.8倍；TRA-1-60免疫组化染色显示TRA-1-60阳性克隆数提高至对照组的2.3倍。结论：利用番茄红素可以促进诱导多能干细胞的形成效率，其作用机制可能与促进CX43的表达有关。关键词：诱导多能干细胞；番茄红素；细胞重编程；缝隙连接蛋白43中图分类号：R31820StudiesonthePromotionofCellReprogrammingbyLycopene1,234LILi,KUANGErsheng,KEQiong25(1.DepartmentofPharmacology,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-SenUniversity,Guangzhou,510080;2.LungBiologyLaboratory,DepartmentofMedicine,DivisionofPulmonary,AllergyandCriticalCare,ColumbiaUniversityMedicalCenter,NewYork,NewYork,10032.;3.InstituteofHumanVirology,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-SenUniversity,30Guangzhou,510080;4.KeyLaboratoryforStemCellsandTissueEngineering,MinistryofEducation,SunYat-SenUniversity,Guangzhou,510080)Abstract:Aim:Ourpreviousreportconfirmedthatconnexin43(CX43)isinvolvedinthegenerationofhiPSCs.LycopeneisprovedthatitcouldupregalatetheexpressionofCX43buttherolesof35lycopeneonreprogrammingprocessarestillunknown.Methods:RealtimePCRandwesternblotwereusedtoevaluatetheeffectoflycopeneontheexpressionofCX43inhumandermalfibroblasts(hDFs).TheeffectoflycopeneonthegenerationofiPSCswasdetectedbyalkalinephosphatase(AP)stainingandTRA-1-60staining.Results:TheexpressionofCX43wasupregulatedinlycopenetreatinghDFsandtheCX43proteinlevelwas2foldsgreaterthancontrol.Whenthelycopenewasintroducted40togetherwiththeYamanakafactors(OCT4,SOX2,KLF4,cMYC-OSKM),itcanalsoenhancehumaninducedpluripotentstemcells(hiPSC)generationandweobtainedanapproximately2.8-foldand2.3-foldincreasesinthereprogrammingefficiencywhencountingtheAPpositiveorTRA-1-60positivecolonies,respectively.Conclusion:LycopenecouldsignificantlyincreasethereprogrammingefficiencyandthismayduetotheupregulationofCX43geneexpression.45Keywords:Inducedpluripotentstemcells;Lycopene;Cellreprogramming;Connexin43基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金新教师类资助课题（20130171120061；20130171120059）作者简介：李荔（1987-），女，主要研究方向：分子肿瘤药理学通信联系人：柯琼（1980-），女，副教授，主要研究方向：干细胞与组织工程.E-mail:kqbear@163.com-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn0引言利用四个外源转录因子（OCT4、SOX2、KLF4及cMYC，OSKM）可诱导体细胞重编50程为类似于胚胎干细胞的诱导多能干细胞（inducedpluripotentstemcells，iPSCs），该技术的产生拓宽了疾病研究、药物筛选及再生医学等各方面的发展，也为个性化的自体细胞治疗[1,2]各种疾病特别是遗传性疾病提供了可能。但是细胞重编程的效率较低、机制尚未完全清楚，一定程度上影响及制约了其研究及应用。目前，利用microRNA、p53siRNA或引入其他外源基因如E-cadherin等方式均能一定[3-5]55程度地提高细胞重编程的效率。我们前期的研究也发现在细胞重编程过程中过表达缝隙[6]连接蛋白43（Connexin43，CX43）能促进诱导多能干细胞的形成效率。但外源基因数量的增加一定程度上也增加了细胞基因组的不稳定性及癌变的风险，因此寻求更加安全有效的提高重编程效率的方法，仍是重要的研究课题。有研究表明番茄红素(lycopene)能促进CX43蛋白的表达，同时该化合物安全性高，作为天然色素已被广泛应用，并且还被越来越多地应[7,8]60用到化妆品、食品乃至药品中。因此我们设想，是否能利用番茄红素替代过表达外源CX43基因，从而促进细胞重编程的效率。为此，我们利用包装了OSKM的逆转录病毒载体感染人皮肤成纤维细胞（humandermalfibroblasts，hDFs），并加入番茄红素处理细胞，观察iPSCs形成的效率。通过该研究可为提高细胞重编程效率提供新的策略及科学依据。651方法与材料1.1细胞培养培养于饲养层细胞上的诱导多能干细胞，用含15%(v/v)血清替代物(Invitrogen)、5%(v/v)小牛血清（FBS）、0.1mMβ-巯基乙醇(Sigma)、1%(w/v)非必需氨基酸(Hyclone)、1%(w/v)青链霉素、2mML-谷氨酰胺及10ng/ml人bFGF(Chemicon)的knockoutDMEM(Invitrogen)70培养；无饲养层培养方式采用mTeSR1人多能干细胞培养基(Stemcell)。人皮肤成纤维细胞为实验室已建立的细胞株，来自签署知情同意的健康志愿者捐献的活检皮肤组织，利用常规方法建系而成。用于病毒包装的293FT细胞系与hDFs类似，利用含10%FBS、2mML-谷氨酰胺、1%(w/v)非必需氨基酸及1mM丙酮酸钠(Sigma)的DMEM(Invitrogen)培养液培养。751.2病毒包装及细胞重编程采用Qiagen质粒小提试剂盒抽提菌液获得质粒，通过NanoDropND-1000(NanoDrop)及DNA电泳检测质粒的大小及其纯度。将5种pMX质粒（pMX-Oct4、pMX-Sox2、pMX-c-Myc、pMX-Klf4、pMX-hrGFP）分别与两种包装质粒pUMVC和pCMV-VSV-G混合，加入900μlOpti-MEM培养基再加入30μlX-tremeGENEHPDNA转染试剂混匀，15min80后转染293FT细胞，在48-72h收集上清液感染hDFs，用hrGFP为对照判定感染的效率。约5天后将感染细胞消化后计数，接种至已有饲养层细胞的培养皿中，加入hiPSCs培养液，部分克隆挑取接种至新的饲养层细胞或无饲养层基质胶上用于克隆建系及鉴定。1.3番茄红素处理细胞在病毒撤离后第二天连续3天添加番茄红素（溶剂为Tetrahydrofuran(Sigma)），随后-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn85收集细胞利用荧光定量PCR及WesternBlot检测CX43RNA及蛋白表达水平，选择合适的药物浓度及处理时间在细胞感染后加入番茄红素，按上述消化计数并接种到饲养层细胞中，培养3-4周后进行碱性磷酸酶染色（BCIP/NBT染色试剂盒(KPL)）或TRA-1-60免疫组化染色（VectastainABC试剂盒(Vectorlab)），与溶剂对照组比较hiPSCs克隆形成率。1.4荧光定量PCR检测90利用RNeasyPlusMinikit(Qiagen)试剂盒按照说明书提取样品RNA，样品经NanoDrop定量后利用AMVFirst-StrandcDNA合成试剂盒(Invitrogen)逆转录获得cDNA，用SYBRqPCRmix试剂盒(Toyobo)及LightCycler480PCR仪（Roche）扩增检测样品。样品扩增程序设置为：94℃，5min；94℃，15sec；58~61℃，15sec；72℃，40sec；40cycles；溶解曲线设置：95℃，30sec；65℃，15sec；冷却。以溶解曲线单一并结合琼脂糖凝胶电泳结95果判定荧光定量PCR结果的可靠性，利用对照样品及GAPDH为内参对样品进行相对定量。引物序列分别为GAPDH-F：AAGGTGAAGGTCGGAGTC；GAPDH-R：GAAGATGGTGATGGGATTTC；Cx43-F：GGTCTGAGTGCCTGAACTTGCCT；Cx43-R：AGCCACACCTTCCCTCCAGCA。1.5WesternBlot检测100待检测细胞用PBS洗3次，加适量细胞裂解液裂解细胞后超声破碎，4℃以12000g速度离心细胞30min，将上清液转移至新的EP管中，定量变性，取适量样品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶恒压电泳，电泳结束后将蛋白转移至PVDF膜，经脱脂牛奶封闭后加入抗β-TUBULIN(Sigma)及抗CX43(Millipore)4℃孵育过夜，TBST洗膜，加入相应二抗，室温下摇床孵育1h，TBST洗膜后经ECL化学发光法检测。用GS-800成像系统(Bio-Rad)及105Quantity-One软件(Bio-Rad)扫描分析数据。样品以β-TUBULIN为内参校正比较蛋白浓度。1.6免疫荧光染色去除细胞培养基，用预热的HBSS清洗1次，4%多聚甲醛固定10min，用PBST冲洗3次，0.05%Triton-X100穿透10min，PBST冲洗3次，5%驴血清封闭30min，加入抗NANOG(CellSignaling),抗OCT4(SantaCruz),抗SSEA4(DSHB),抗TRA-1-60(Millipore)和110抗Cx43(Millipore)抗体，4℃过夜，PBST冲洗3次，加入荧光二抗（Alexa488或Alexa555(Invitrogen)），避光孵育2h,PBST冲洗3次，DAPI孵育5min后用显微镜（Olympus）观察拍照成像。1.7统计学分析实验至少独立重复3次。数据统计采用GraphPadPrism软件t检验分析及绘图，实验115数据以均值±标准差(x±S.D)，P<0.05认为差异有统计学意义。2实验结果2.1番茄红素促进人成纤维细胞中CX43的表达通过荧光定量PCR检测细胞重编程过程中不同浓度番茄红素对其表达量的影响发现，分别用5μM，10μM，20μM的番茄红素处理感染OSKM四因子的hDFs，其CX43的mRNA-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn120水平都普遍升高，其中10μM组别与对照组的差异最大，约为对照组的4倍（图1A）。进一步利用WesternBlot检测CX43蛋白表达情况，结果显示番茄红素可增加hDFs细胞上Cx43蛋白的表达，其中番茄红素在10μM时效果最明显，其蛋白表达量约为对照组的2倍，而20μM组别的效果不显著稳定性差（图1B）。CX43蛋白具有不同的存在形式，分别为2种不同磷酸化状态（P1、P2）及分子量最小的非磷酸化状态（P0），从实验结果看，125随着CX43蛋白浓度的增加，各种磷酸化状态的蛋白量也随着增加，且三者的比例类似，初步未见番茄红素对其翻译后修饰的影响。图1番茄红素对hDFs中CX43表达的影响Fig1.EffectoflycopeneontheexpressionofCX43inhDFs130(A)CX43expressioninhDFSwasassessedbyreal-timePCR.(B)and(C)CX43expressioninhDFswasassessedbywesternblot.Thedataarepresentedasthemean±SD(n=4).*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001versustheoneassignedavalueof1.0.P0,nonphosphorylated,P1andP2,phosphorylated.2.2番茄红素促进细胞重编程效率随后我们在细胞重编程过程中加入番茄红素处理细胞，感染后约3周左右通用碱性磷酸135酶（alkalinephosphatase，AP）染色，初步观察番茄红素对克隆形成的影响，从染色结果显++示，与对照组相比，番茄红素10μM实验组的AP克隆数有显著增加，其AP克隆数为43+±6个，为对照组的2.8倍，而5μM实验组的AP克隆数为28±6，与对照组相比差距不显著（图2）。140图2碱性磷酸酶染色检测番茄红素对iPSCs形成的影响Fig2.EffectoflycopeneonthegenerationofiPSCsbyalkalinephosphatasestaining(A)RepresentativeimagesofAPpositivecolonies.(B)QuantificationofAPpositivecoloniesper1000cellsasindicated.Thedataarepresentedasthemean±SD(n=4)andarerepresentativeofthreeindependentexperiments.**P<0.01versuscontrol.145我们选择10μM实验组进一步观察不同处理时间对iPSCs克隆形成的影响，细胞感染约4周后我们利用TRA-1-60染色进一步验证克隆形成的效率。从图3可见加药6天组++TRA-1-60克隆数量为278±26个，为对照组的1.6倍，而加药12天组其TRA-1-60克隆-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn数量增加更为明显，克隆数量为404±42个，分别为对照组的2.3倍和6天组的1.5倍，说150明延长番茄红素的添加时间对iPSCs的形成有更显著的促进作用。图3TRA-1-60染色检测番茄红素对iPSCs形成的影响Fig3.EffectoflycopeneonthegenerationofiPSCsbyTRA-1-60staining(A)RepresentativeimagesofTRA-1-60positivecolonies.(B)QuantificationofTRA-1-60positivecoloniesper15550000cellsasindicated.Thedataarepresentedasthemean±SD(n=4)andarerepresentativeofthreeindependentexperiments.*P<0.05,**P<0.01versuscontrol.2.3番茄红素处理组iPSCs的建系及鉴定hDFs经病毒感染及番茄红素处理后与对照组类似，在第3天左右可见细胞慢慢变短变160圆呈聚拢的趋势，至第12天传代至饲养层的细胞聚拢的趋势更加明显，克隆形态更进一步致密均一（图4）。通过挑取形态良好、核仁明显、核浆比例高且边界清晰的克隆进行传代，番茄红素实验组中获得的克隆可以顺利建系，传代多次后仍保持良好的克隆形态，经鉴定其表面表达多能性标志蛋白（图5）。165图4人皮肤成纤维细胞及细胞重编程第12天的细胞形态Fig4.hDFsandcellmorphologyonday12ofcellreprogramming(A)hDFsand(B)cellsonday12oflycopenetreatingcellreprogramming.Scalebar=50μm170图5免疫荧光染色检测iPSCs多能性标志物Fig5.ImmunofluorescenceanalysisofpluripotencymarkersofiPScHumaniPSCsgeneratedfromlycopenetreatinggroupexpresspluripotentassociatedmarkers.Scalebar=50μm175-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn3讨论细胞重编程效率的提高可通过增加外源基因如E-cadherin、UTF1或干扰基因如干扰p53的方式来实现，调节基因表达的microRNA如microRNA302或添加组蛋白脱乙酰酶抑制剂[3-5,9-12]180丙戊酸（VPA）、维生素C、丁酸盐等也被证实有助于增加重编程诱导效率。细胞重编程的过程繁复且机制不清，对其机理的探究及促进重编程效率的研究仍值得进一步开展。我们前期的研究发现过表达CX43能有效促进iPSCs的形成[6]，因此我们设想，促进CX43表达的化合物是否能影响细胞重编程效率，获得更适合促进治疗性iPSCs形成的诱导方式。番茄红素是成熟番茄中的主要色素，也是常见的类胡萝卜素之一，其广泛存在于番茄、185西瓜及葡萄柚等水果中。Bertram等人的研究表明番茄红素等膳食类胡萝卜素可上调CX43[7]基因表达，且与抑制人和动物的正常细胞向肿瘤细胞转化相关，近期的研究也发现番茄红[13]素能提高大鼠脊髓星形胶质细胞中CX43的表达，从而缓解神经病理性疼痛。利用番茄红[14]素促进成纤维细胞中CX43的表达也有相应的报道，而番茄红素对细胞重编程的影响仍未见报道。190我们的实验证实不同浓度的番茄红素均能一定程度的提高重编程过程中hDFs上CX43表达，其中5μM及10μM组别的效果较明显，10μM在以往研究报道中较为常见，本实验中20μM浓度发现其对细胞CX43的表达促进作用不明显，稳定性较差，具体原因还有待进一步确认。在细胞重编程过程中加入番茄红素能有效增加碱性磷酸酶阳性的细胞克隆数；[15]TRA-1-60染色是目前公认的检验真克隆的实验手段，番茄红素处理组TRA-1-60着色深，195克隆更加均一，表明其不仅促进克隆数量的增加同时对于细胞的完全重编程也有促进作用。挑取的克隆经传代很快扩增获得大量典型的克隆，建系的成功率较高，对其多能性标志物的鉴定也证实其具有多能干细胞的特性，其持续传代也保持良好的增殖状态及细胞特性，相应的胚层分化鉴定也证实其具有多向分化的潜能。本研究在OSMK四个转录因子诱导的基础上添加番茄红素处理细胞初步观察到其对细200胞重编程具有促进作用，进一步的研究还需对其作用浓度及时间做更多的优化，同时减少转录因子的数量或者结合非整合型的细胞重编程体系是否也能得到同样的结果还有待深入研究，以优化治疗性克隆产生的策略。4结论本研究结果表明，番茄红素可以促进人皮肤成纤维细胞中CX43的表达，在细胞重编程205过程中，在OSMK四个转录因子诱导的基础上添加番茄红素可以有效地促进诱导多能干细胞的形成效率，为提高细胞重编程提供了新的策略及科学依据。[参考文献](References)[1]Takahashi,K.,etal.,Inductionofpluripotentstemcellsfromadulthumanfibroblastsbydefinedfactors.Cell,2102007.131(5):p.861-872.[2]Yu,J.,etal.,Inducedpluripotentstemcelllinesderivedfromhumansomaticcells.Science,2007.318(5858):p.1917-1920.[3]Liao,B.,etal.,MicroRNAcluster302-367enhancessomaticcellreprogrammingbyacceleratingamesenchymal-to-epithelialtransition.JBiolChem,2011.286(19):p.17359-17364.215[4]Zhao,Y.,etal.,TwosupportingfactorsgreatlyimprovetheefficiencyofhumaniPSCgeneration.CellStemCell,2008.3(5):p.475-479.[5]Redmer,T.,etal.,E-cadheriniscrucialforembryonicstemcellpluripotencyandcanreplaceOCT4during-6- 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