双酪氨酸诱导小鼠肠道氧化应激及炎症反应.pdf 11页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn双酪氨酸诱导小鼠肠道氧化应激及炎症反#应11,21,2**张帅，施用辉，乐国伟5（1.江南大学食品学院，营养与功能因子研究中心，江苏无锡214122；2.食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122）摘要：目的：探究氧化蛋白质的重要产物双酪氨酸（DT）对消化吸收的主要部位——肠道的氧化状态及炎症反应的影响。方法：通过测定十二指肠，空肠，回肠和结肠中ROS、GPX10和T-AOC水平以及DT，AOPPs，MDA的含量评估肠道氧化程度。HE染色的近端空肠切片的显微观察结果结合回肠紧密连接蛋白及其相关炎症细胞因子的基因表达水平说明肠道的炎症情况。肠道菌群结构组成采用T-RFLP分析，并用qRT-PCR进一步定量分析。结果：10周饲喂DT导致小鼠肠道ROS水平显著上调（p<0.05），GPX和T-AOC活力明显减弱（p<0.05），DT，AOPPs及MDA大量积累（p<0.05）；HE染色显微观察结果显示空肠明15显萎缩，组织学评分进一步说明肠绒毛显著缩短；回肠紧密连接关键蛋白的基因表达水平明显降低（p<0.05），炎症细胞因子基因表达水平显著升高（p<0.05）；肠道菌群结构与正常组相比发生了明显的变化，乳杆菌和乳球菌丰度呈倍数减少（p<0.05）。结论：DT诱导肠道氧化应激，削弱肠道抗氧化防御能力，造成氧化损伤，从而引起一定程度的肠道炎症反应和菌群结构的改变，并且这些效应成剂量依赖性。20关键词：氧化应激；肠道炎症；肠道菌群；双酪氨酸；T-RFLP中图分类号：R151Dityrosineinducedoxidativestressandinflammationtomicegut11,21,225ZHANGShuai,SHIYonghui,LEGuowei(1.FoodNutritionandFunctionFactorResearchCenter,SchoolofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi214122,PRChina;2.StateKeyLaboratoryofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi214122,PRChina)30Abstract:Abjective:ThisstudyinvestigatetheeffectsofDityrosine(DT)administrationontheoxidativestatusandtheinflammatoryresponseofintestinaltractwhichisthecriticalpartofdigestionandabsorption.Methods:ThedegreeofoxidativestresswasdeterminedbymeasuringthelevelsofROS,GPXandT-AOCandthecontentsofDT,AOPPsandMDAintheintestinal.MicroscopicobservationresultsofHEstainedproximaljejunumslicescombinedwithgeneexpressinglevelsof35intestinaltightjunction(TJ)proteinsandrelativeinflammatorycytokinesreflectedintestinalimflammation.FloraingutwasanalysedthroughT-RFLP,andquantitativeanlysisofspecificbacterialwasconductedbyRT-PCR.Results:10-weekfeedingofDTsignificantlydecreasedthelevelofGPXandT-AOCinmicegut(p<0.05),whileincreasedthecontentofROS,DT,AOPPsandMDAremarkably(p<0.05).MicroscopicobservationofHEstainingaccompanyingwithhistologicalscore40showedintestinalvillishorteneddistinctivelyinjejunum.TherewasanotabledeclineinTJproteins(p<0.05)whileanobviousriseinpro-inflammatorycytokines(p<0.05).Futhermore,bacterialstructurewaschangedbyDT,especiallytheabundanceofLactobacillusandLactococcushadanmultipledecrease(p<0.05).Conclusion:TheseresultsindicatethatDTinducedintestinaloxidativestressandevenoxidativedamage,whichmayinturncauseintestinalinflammatoryresponsetoacertainextant45andthevarietyinthestructureoftheintestinalendogenousbacteria.Inaddition,ourdatarevealtoxiceffectofDTisdosedependent.基金项目：国家自然科学基金（30571347）；江南大学食品科学与技术国家重点实验室基金（SKLF-ZZB-201609）作者简介：张帅（1991-），女，硕士研究生，研究方向：氧化氨基酸通信联系人：施用辉（1955-），女，博士生导师，研究方向：分子营养学.E-mail:yhshi2009@126.com-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnKeywords:Oxidativestress;intestinalinflammation;gutflora;Dityrosine;T-RFLP0引言50近年来，氧化蛋白质与人类健康的关系，越来越受到人们的关注。食物蛋白在食品加工、贮存中的促氧化条件下，极易发生氧化变性，影响食品的感官特性和营养功能。实验室前期[1]研究表明，短期灌胃氧化蛋白会引起小鼠肠道氧化应激，自由基水平显著上升。饲喂氧化酪蛋白10周，小鼠结肠抗氧化能力下降，结肠内容物中乳杆菌减少，大肠埃希菌和粪球菌[2]数量上升，结肠黏膜发生脂质过氧化。55双酪氨酸（DT）是蛋白质氧化的特征产物之一，并作为蛋白质氧化损伤的标志物逐渐[3,4]被广泛应用。多项研究表明衰老及多种病理条件包括：阿尔茨海默病（AD），高脂血症[5][6][7][8]，帕金森氏病和全身炎症反应等慢性疾病下尿中DT水平升高。有研究在奶粉、紫外[9]和荧光照射的牛奶中检测到较高含量的DT。最近的相关研究已证实摄食氧化酪氨酸（OT）[10,11][12]及其主要产物DT对肾脏的损伤和诱导新物体识别缺陷。60然而，摄食DT对机体主要的消化、吸收部位——肠道的影响目前还没有研究。1材料与方法1.1动物饲养与处理本实验采用30只雄性C57BL/6J小鼠，初始平均体重为19±1.86g。以正常饲料预饲3天后，按体重随机分为3组（每组10只）：正常组（CON），低剂量双酪氨酸组（LDT），65高剂量双酪氨酸组（HDT）。所有的动物给正常饮食10天后，CON组饲喂正常饲料，LDT、HDT组分别饲喂添加70μg/kg和320μg/kg纯的双酪氨酸饲料。动物喂养在标准饲养笼里，饲喂温度为（21±2℃），湿度为63%（±2%），光照12h/12h昼夜循环。24小时采食量和体重每周测量，每天观察动物的行为。1.2组织样品采集70饲喂10周后，小鼠乙醚麻醉，断颈处死。迅速取出十二指肠、空肠、回肠和结肠的中段，按照1:9体积加入生理盐水，电动匀浆器匀浆组织，制备10%匀浆液（整个过程冰上进行），用于测定氧化指标。取近端空肠，固定于4%的多聚甲醛固定液中，制备组织切片。收集回肠、结肠内容物液氮速冻，随后转存到-80℃存放。取适当大小回肠于装有800μLtrizol试剂的灭酶管中，用于提取RNA。751.3氧化指标测定总抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）和丙二醛（MDA）严格按照试剂盒说明书（南京建成生物工程研究所）测定。DT和晚期氧化蛋白产物（AOPPs）按照ELISA试剂盒操作说明（厦门慧嘉生物科技有限公司）测定。ROS水平参照Kobayashi等人[13]所描述的化学发光法测定，用MPI-B超微弱发光分析系统（西安瑞迈分析仪器有限公80司）。ROS的产生，表示为相对光单位（RLUs）。-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn1.4肠道组织形态观察将1.2中固定于4%的多聚甲醛固定液中的近端空肠，及时进行石蜡包埋，切片及HE染色。染色结束后，中性树脂封片，用CX31RTSF显微镜（OlympusCorporation,Tokyo,Japan）进行观察。851.5紧密连接蛋白（TJ）与炎症细胞因子基因表达水平的检测采用实时荧光定量PCR测定回肠组织中紧密连接蛋白及炎症因子基因表达水平。RNA的提取和反转为cDNA参照实验室方法进行操作。PCR体系见表1，引物序列见表2，扩增程序为：95℃,5min，循环1次；95℃,20s，60℃,30s，72℃,20s，循环40次；72℃,2min，循环1次；12℃冷却至恒定。运用△△Ct法对数据进行分析。90表1实时荧光定量PCR体系Tab.1RT-PCRsystem试剂体积（μL）浓度cDNA0.5-上游引物0.410pmol/μL下游引物0.410pmol/μL2×SYBRGreenMasterMix5-DEPC水3.7-表2基因引物Tab.2Primerusedinthisstudy基因名称上游引物(5"-3")下游引物(5"-3")OccludinATGTCCGGCCGATGCTCTCTTTGGCTGCTCTTGGGTCTGTATClaudin-1AGCCAGGAGCCTCGCCCCGCAGCTGCACGGGTTGCCTGCAAAGTZo-1ACCCGAAACTGATGCTGTGGATAGAAATGGCCGGGCAGAACTTGTGTAIL-1βATGTCCGGCCGATGCTCTCTTTGGCTGCTCTTGGGTCTGTATNF-κBAGGCTTCTGGGCCTTATGTGTGCTTCTCTCGCCAGGAATACIFN-γGAAATGCCACCTTTTGACAGTGTGGATGCTCTCATCAGGACAGβ-actinGGGTCAGAAGGACTCCTATGGTAACAATGCCATGTTCAATLactobacillusAGCAGTAGGGAATCTTCCACACCGCTACACATGGAGLactococcusTGAAGAATTGATGGAACTCGCATTGTGGTTCACCGTTCEnterococcusTTCCCGAAGGCACCAATCAACCTACCCATCAGAGGGBifidobacteriumTCGCGTCYGGTGTGAAAGCCACATCCAGCRTCCACEUBACTCCTACGGGAGGCAGCAGATTACCGCGGCTGCTGG951.6肠道游离sIgA的检测采用实时荧光定量PCR测定回肠组织中紧密连接蛋白及炎症因子基因表达水平。RNA的提取和反转为cDNA参照实验室方法进行操作。PCR体系见表1，引物序列见表2，扩增程序为：95℃,5min，循环1次；95℃,20s，60℃,30s，72℃,20s，循环40次；72℃,2min，循环1次；12℃冷却至恒定。运用△△Ct法对数据进行分析。1001.7末端限制性片段长度多态性分析（T-RFLP）分析肠道菌群[14]细菌细胞的收集及细菌DNA的提取与纯化参照Li等人的方法。-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn回肠内容物细菌16SrRNA用FAM标记的5’-AGAGTTTGATCCTGGCTAG-3’（8F）和HEX[15]标记的5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’（1492R）进行PCR扩增。PCR体系包括：模板DNA3μL（稀释至50ng/μL)，上下游引物（10mM）各0.5μL，2×TaqPCRMasterMix12.5105μL，加ddH2O至终体积25μL。扩增程序为：94℃预变性6min；94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸120s，循环35次；72℃终延伸10min。PCR产物用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（上海捷瑞生物工程有限公司）进纯化后分别用HhaI和MspI（Takara）进行快速酶切。酶切产物脱盐后重悬于10μL甲酰胺中。细观电泳基因分析仪（睿迪生物有限公司）分析得到的T-RF片段信息先用Gelquest软110件（SequentiX-DigitalDNAProcessing）和Excel宏进行生数据处理，然后用Cluster3.0（MichieldeHoon，UniversityofTokyo）和TreeView_vers_1_60（EisenLabSoftware）软件进行Cluster分析和绘图并用Canoco4.5（PetrSmilauer）进行PCA绘图。1.8肠道菌的定量PCR[16]进一步用荧光定量PCR方法对回肠内容物特殊菌群进行定量分析，引物序列见表2。1151.9统计分析实验结果表示为X±SEM。采用SPSS20.0软件（IBMCorp，USA）对数据进行统计分析，用单因素方差分析（ANOVA），Turkey检验进行组间比较。p<0.05表示显著水平。2结果与讨论2.1DT诱导肠道氧化应激120T-AOC是反映机体整体的抗氧化水平高低的重要指标，与机体的健康程度密切相关。MDA是脂质过氧化作用的次级产物，MDA的含量通常被用来衡量食物或生物系统中脂类氧[17]化变质的程度。AOPPs是一种生物大分子氧化应激标记蛋白，最近被广泛用作观察蛋白交[18]联程度的指标。鉴于不同部位的消化道结构与功能各异，我们分别对10周饲喂的小鼠的十二指肠、空125肠、回肠及结肠的氧化指标进行测定分析，同时，也检测回肠内容物和结肠内容物的氧化指标，以便对肠道的氧化状况进行全面的研究。由图1可以看出，与正常组相比，HDT组小鼠肠道ROS（图1A）水平显著高于正常组（p<0.05），暗示肠道出现了氧化应激；同时，HDT组T-AOC（图1B）与GPX（图1C）明显低于正常水平（p<0.05），反应肠道的抗氧化能力的下降；另外，检测到的脂质过氧化130产物MDA（图2A）和蛋白质氧化产物AOPPs（图2B）、DT（图2C）的过量积累（p<0.05）说明HDT已导致肠道出现严重的氧化损伤。HDT组回肠内容物和结肠内容物中的T-AOC显著下调（p<0.05）及DT和MDA含量（表3）的显著升高（p<0.05），反应出肠腔中具有与肠道组织相同的氧化变化趋势，更全面地说明HDT诱导肠道出现氧化变化。LDT组也有一定程度的氧化反应，但较不明显。各氧化指标在不同肠段的变化趋势较为一致。-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn135图1小鼠肠道组织ROS水平（A）和抗氧化能力:（B）T-AOC，（C）GPX.结果表示为X±SEM，*表示显著差异（P<0.05），n=10Fig.1LevelsofROS(A),T-AOC(B)andGPX(C)inmiceintestinal.Valuesarerepresentedasmean±SEM.*P<0.05vs.CON;n=10pertreatment140图2小鼠肠道组织中MDA（A），AOPPs（B），DT（C）含量.结果表示为X±SEM，*表示显著差异（P<0.05），n=10Fig.2ContentsofMDA(A),AOPPs(B)andDT(C)inmiceintestinal.Valuesarerepresentedasmean±SEM.-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn*P<0.05vs.CON;n=10pertreatment145表3小鼠肠腔氧化状态.结果表示为X±SEM，*表示显著差异（P<0.05），n=10Tab.3Oxidationstateofmiceintestinalcontents.Valuesarerepresentedasmean±SEM.*P<0.05vs.CON;n=10pertreatment指标名称组别回肠内容物结肠内容物CON3.293±0.17292.179±0.1942T-AOC(U/mgprot)LDT2.608±0.21241.518±0.094*HDT2.448±0.0598*1.390±0.056*CON40.73±2.43536.82±2.991MDA(nmol/mgprot)LDT53.37±0.967*47.58±2.469*HDT51.59±3.850*48.97±4.735*CON673.6±63.06535.3±29.94DT(pg/mgprot)LDT744.2±51.82678.2±52.39*HDT851.7±32.50*734.5±60.43*2.2肠道组织形态的变化[19]150氧化应激与慢性炎症密切相关的事实已被广泛认可。首先，氧化应激可直接诱发肠道炎症：自由基透过粘液层，一方面攻击细胞膜上的磷脂层等使其发生脂质过氧化，破坏上[20]皮细胞细胞膜结构；另一方面攻击上皮细胞间的紧密连接蛋白，二者都可导致肠黏膜屏[21]障通透性增强，诱发肠道炎症。另外，氧化应激通过改变肠道菌群结构间接诱发肠道炎症：氧化应激导致粘液层屏障功能减退，外源致病菌得以与肠道上皮细胞充分接触，进而引[22]155起炎症细胞因子的分泌。图3近端空肠切片HE染色显微观察结果（A）及组织学评分（B）.图B中结果表示为X±SEM，*表示显著差异（P<0.05），n=10Fig.3MicroscopicobservationresultsofHEstainingslicesofproximaljejunum(A)andhistologicalscore(B).160ValuesinFig.3Barerepresentedasmean±SEM.*P<0.05vs.CON;n=10pertreatment在图3A中，空肠HE染色4X显微观察结果显示，HDT组小鼠整个空肠组织表现出明显-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn萎缩的趋势，10X图（图3A）也显示空肠绒毛明显缩短；从半定量结果（图3B）不难看出，HDT组绒毛/隐窝比水平低于正常组的一半。LDT组空肠绒毛也有一定程度的缩短，但并不明显。这些结果表明，10周饲喂高剂量DT造成小鼠空肠组织形态受损，暗示了肠道可能已165经发生的炎症反应。2.3肠道炎症细胞因子的表达屏障功能损伤是肠炎症反应中最早发生的事件之一，出现在明显的炎症或粘膜损伤之前[23]。为了进一步检验DT对肠道炎症反应的影响，我们继续测定了肠上皮细胞通透性及相关炎性因子的表达。170图4回肠紧密连接蛋白（A）及相关炎性因子（B）基因表达水平.结果表示为X±SEM，*表示显著差异（P<0.05），n=10Fig.4mRNAexpressionofTJproteins(A)andproinflammationcytokines(B).Valuesarerepresentedasmean±SEM.*P<0.05vs.CON;n=10pertreatment[24]175紧密连接（TJ）在调节黏膜屏障性能中起着至关重要的作用，是细胞黏附的主要形式之一，位于细胞-细胞连接复合体的顶端，对维持细胞极性和控制细胞旁转运相当重要。TJ的关键整合蛋白包括横跨膜蛋白（包括Occludin蛋白，Claudin家族成员以及连接黏附分子[25]JAM）和斑块蛋白（Zo家族蛋白）。Occludin是TJ相关蛋白中最具代表性的蛋白之一，它封闭细胞旁路，并与Zo-1等结合形成TJ的基础结构。图4A显示的HDT组Occludin、Claudin-1180和Zo-1显著低于正常水平（p<0.05），暗示了紧密连接功能的破坏。黏膜免疫系统是肠道炎症和损伤的中枢效应器，细胞因子在调节炎症和上皮屏障功能中[25]起着中心作用。从图4B上观察到，炎性细胞因子NF-κB和IL-1β在LDT和HDT组都上调至显著水平（p<0.05），HDT组IFN-γ也明显升高（p<0.05）。有研究报道，NF-κB和IL-1β分[26,27]别能够通过不同的途径，调节Occludin的表达与分布，使上皮屏障渗透性增加。这些185报道在一定程度上支持了我们的实验结果。上皮通透性增加，炎性细胞因子的释放，不仅会引发肠道炎症反应，还可能直接促成肠道疾病，甚至成为引发的肠源性疾病的发生和发展中的关键因素。-7- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn2.4肠腔中游离的sIgA前面已经介绍，自由基通过攻击肠道粘液层中的黏蛋白，导致粘液层厚度下降甚至消失[28]190；粘液层结构破坏，使得大量的有害外源菌入侵，竞争性地抑制肠道内固有共生菌的定植，这可能成为引发肠道炎症的又一因素。图5肠道内容物中sIgA水平的变化.结果表示为X±SEM，*表示显著差异（P<0.05），n=10Fig.5ChangesofsIgAlevelsinintestinalcontents.Valuesarerepresentedasmean±SEM.*P<0.05vs.CON;195n=10pertreatment由图5可以直观地看出，HDT组回肠与结肠内容物中sIgA水平都显著低于正常组（p<0.05），LDT组中sIgA有所下降，但趋势并不明显。前面已经讨论，DT引起肠道氧化应激，可能造成粘液层中蛋白质的氧化变性，这可能是HDT组sIgA水平降低的原因之一。肠道局部粘液层中sIgA水平下降，粘液层保护屏障破坏，外源细菌得以在肠黏膜表面定200植，并大量增殖后，会造成肠道菌群结构变化。2.5肠道菌群结构的变化回肠内容物菌群结构T-RFLP分析PCA图（图6A）清楚地显示HDT组回肠菌落分布已明显偏离CON组和LDT组，并且相距较远，而LDT组的菌落分布未能与CON组分开；Cluster图（图6B）中右侧的相似度树状图也给出类似结果，左侧的热图显示出CON组和LDT组中205的有些片段在HDT组中缺失。从图7同样可以看出，HDT组结肠菌群与正常组发生明显的分离，而LDT组与正常组之间有所重合。以上结果共同表明10周饲喂高剂量DT导致小鼠肠道菌群结构改变，而低剂量DT未引起菌群明显变化。肠道菌群作为肠道中的“微生物器官”，在宿主的免疫功能中起到一定的作用。然而，肠道菌群结构的变化已被报道对许多疾病（包括动脉粥样硬化，糖尿病，慢性肾病，炎症性肠[29,30,31]210病）的发展有重要的影响。我们实验结果显示的高剂量的DT引起的肠道菌群的变化，尤其是有益菌属Lactobacillus和Lactococcus（图8）的显著减少（p<0.05），可能继而引发肠[32]源性感染，成为导致肠道炎症的重要因素。有趣的是，李竹青分别用含DT的氧化酪蛋白[10]和氧化酪氨酸灌胃大鼠，均发现肾脏出现纤维化；并且在其新近的研究中证实DT是氧化酪氨酸中导致肾脏慢性炎症的关键因子。早期报道显示的慢性肾脏病患者肠道中乳杆菌和双[30]215歧杆菌等有益菌水平下降结果，由此推测，DT造成的有益菌属Lactobacillus和Lactococcus[2]可能与DT引起肾脏疾病之间存在联系。方伟研究表明，饲喂氧化酪蛋白，结肠内容物中乳杆菌减少；DT作为氧化酪蛋白的重要产物，在我们的实验中引起乳杆菌数量的明显降低，在一定程度上解释了该研究结果。-8- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn220图6回肠内容物菌群结构T-RFLP分析：(A)PCA图，(B)Cluster图Fig.6T-RFLPanalysisoftheflorastructureinileum:(A)PCA,(B)Cluster图7结肠内容物菌群结构T-RFLP分析PCA图225Fig.7PCAresultofT-RFLPanalysisoftheflorastructureincolon-9- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图8回肠菌群定量PCR分析结果.结果表示为X±SEM，*表示显著差异（P<0.05），n=10Fig.8RT-PCRanalysisoftheflorastructureofileum.Valuesarerepresentedasmean±SEM.*P<0.05vs.CON;n=10pertreatment2303结论本研究结果表明，饲喂DT会诱导肠道发生氧化应激及氧化损伤，并且肠道的氧化变化呈现DT剂量依赖性。另外，饲喂10周DT能够引起肠道炎症反应，我们的实验数据初步证明，这可能是DT诱导的氧化应激造成的肠道通透性改变以及肠道菌群结构变化共同作用的结果。本研究丰富了摄食氧化蛋白质及氧化酪氨酸诱导机体病理反应的研究成果，并为深入235探究其致病机制提供潜在的新思路。致谢本研究能够顺利进行，我们首先感谢王盼盼为肠道菌群T-RFLP结果的分析处理提供了详细的方法教程，另外也特别感谢孙进老师对于该实验的指导性建议。[参考文献](References)240[1]吴伶艳,等.氧化酪蛋白对小鼠组织抗氧化能力及血液肽组成的影响[J].世界科技研究与发展,2011,33(3):489-493.[2]FangW,etal.Effectofoxidatedfoodproteinonmicegutfloraandredoxstate[J].ChineseJournalofMicroecology,2012,24:193-196.[3]HensleyK,etal.ElectrochemicalanalysisofproteinnitrotyrosineandDTosineintheAlzheimerbrain245indicatesregion-specificaccumulation[J].JNeurosci,1998,18(20):8126-32.[4]ReynoldsMR,BerryRW,BinderLI.Site-specificnitrationandoxidativeDTosinebridgingofthetauproteinbyperoxynitrite:implicationsforAlzheimer"sdisease[J].Biochemistry,2005,44(5):1690-700.[5]WuGR,CheserekM,ShiYH.ElevatedplasmaDTosineinpatientswithhyperlipidemiacomparedtohealthyindividuals[J].AnnNutrMetab,2015,66(1):44-50.250[6]PennathurS,Jackson-LewisV,PrzedborskiS.Massspectrometricquantificationof3-nitrotyrosine,ortho-tyrosine,ando,o"-DTosineinbraintissueof1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-treatedmice,amodelofoxidativestressinParkinson"sdisease[J].JBiolChem,1999,274(49):34621-34628.[7]BhattacharjeeS,PennathurS,ByunJ.NADPHoxidaseofneutrophilselevateso,o"-DTosinecross-linksinproteinsandurineduringinflammation[J].ArchBiochemBiophys,2001,395(1):69-77.255[8]FenailleF,etal.QuantitativedeterminationofDTosineinmilkpowdersbyliquidchromatographycoupledtotandemmassspectrometryusingisotopedilution[J].JournalofChromatographyA,2004,1052(1-2):77-84.[9]Rodriguez-MateosA,MillarSJ,BhandariDG,FrazierRA.FormationofDTosinecross-linksduringbreadmaking[J].JAgricFoodChem,2006,54(7):2761-2766.[10]LiZL,ShiYH,LeG.24-WeekExposuretoOxidizedTyrosineInducesHepaticFibrosisInvolving260ActivationoftheMAPK/TGF-β1SignalingPathwayinSprague-DawleyRatsModel[J].OxidMedCellLongev,2016,3123294.-10- 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