富氢盐水对东莨菪碱诱导大鼠干眼模型眼表保护作用.pdf 13页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn富氢盐水对东莨菪碱诱导大鼠干眼模型眼#表保护作用**楚莹莹，华宁，茹玉莎，赵少贞5（天津医科大学眼科医院，天津医科大学眼视光学院，天津医科大学眼科研究所，天津，300384）摘要：目的探讨富氢盐水(HRS)对东莨菪碱诱导大鼠干眼模型眼表保护作用。方法6周龄Wistar大鼠30只(60眼)随机分为正常组、干眼组、HRS点眼组、生理盐水(NS)点眼组、10HRS腹腔注射组和NS腹腔注射组。皮下注射东莨菪碱制备干眼模型。各组行泪液分泌试验(SIt)、泪膜破裂时间(BUT)、角膜上皮荧光素钠染色评分；行HE染色、过碘酸-雪夫(PAS)染色及免疫组化染色。采用方差分析及LSD检验。结果比较各组SIt、BUT及荧光素钠染色评分差异具统计学意义(P<0.05)。HRS点眼组和HRS腹腔注射组均较干眼组改善；且二者差异无统计学意义。HE染色示HRS点眼组和HRS腹腔注射组角结膜上皮水肿减轻；PAS15染色示杯状细胞形态改善；免疫组化染色示鳞状上皮化生减轻。结论HRS点眼和HRS腹腔注射均缓解大鼠干眼症状，改善角结膜组织病理损伤，为干眼治疗带来新希望。关键词：干眼；富氢盐水；东莨菪碱；大鼠中图分类号：R7720Theprotectionofhydrogen-richsalineonratdryeyemodelinducedbyscopolaminehydrobromide1122CHUYingying,HUANing,RUYusha,ZHAOShaozhen(1.TianjinMedicalUniversityEyeHospital，SchoolofOptometryandOphthalmologyofTianjinMedicalUniversity，TianjinMedicalUniversityEyeInstitute，Tianjin300384，China;252.TianjinMedicalUniversityEyeHospital，SchoolofOptometryandOphthalmologyofTianjinMedicalUniversity，TianjinMedicalUniversityEyeInstitute，Tianjin300384)Abstract:ObjectiveToevaluatetheeffectofhydrogen-richsaline(HRS)ondryeyeratinducedbysubcutaneousinjectionofscopolaminehydrobromide.MethodsExperimentresearch.ThirtyfemaleWistarratsaboutsixweeksoldwererandomlydividedintonormalgroup,dryeyegroup,HRS30eyedropsgroup,normalsalineeyedropsgroup(NS),HRSintraperitonealinjectiongroupandNSintraperitonealinjectiongroup,with5ratsineachgroup.Thedryeyeratmodelwasinducedbysubcutaneousinjectionofscopolaminehydrobromideinthelatterfivegroups.Theclinicalsignsofdryeyesuchastearvolume(SIt),tearbreak-uptime(BUT)andcornealepithelialfluoresceinstainingscoreswereevaluatedonday7,14,21and28.Onthe28thday，teneyesineachgroupwereenucleatedand35processedforparaffinsectionsforHEandPASandImmunohistochemistrystaining.ANOVAwasusedtotestthecomparisonsoftheclinicalsigns,andLSDwasusedtotestmultiplecomparisons．ResultsFordryeyegroup,fromthe7thdayuntilthe28thday,theSIt,BUTandfluoresceinstainingscoringofdryeyegroupweresignificantlydifferentfromthenormalcontrol(P<0.05).ForHRSeyedropsgroup,TheBUTwasshorterandfluoresceinstainingscorewas40lowerfromtheday7,whiletheSItincreasedfromtheday14.ForHRSintraperitonealinjectiongroup,TheSIt,BUTandfluoresceinstainingscorebecamebetterfromday14,whichweresignificantlydifferentfromdryeyegroup(P<0.05).Fromthe14thday,theSIt,BUTandfluoresceinstainingscoringbetweenHRSeyedropsgroupandNSeyedropsgroup,HRSintraperitonealinjectiongroupandNSintraperitonealinjectiongroupwerestatisticallysignificant(P<0.05)whichremainedstableuntilthe45day28.AndtherewasnosignificantdifferencebetweenHRSeyedropsgroupandHRSintraperitoneal基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（20131202120008）；天津市高等学校科技发展基金计划项目（20120129）作者简介：楚莹莹（出生年1990-），女，硕士研究生，主要研究方向：眼科学通信联系人：赵少贞（出生年1963-），女，主任医师，博士生导师，主要研究方向：眼表和屈光角膜.E-mail:tian2815@sina.com-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cninjectiongroup(P>0.05).Onthe28thday,HEandPASandImmunohistochemistrystainingshowedcornealandconjunctivalepitheliumbecamesmoothandregular,celllayersdecreased,tissuehyperplasiaandedemawerelightenedandthesizeofgobletcellstendedtobenormalinHRSeyedropsgroupandHRSintraperitonealinjectiongroup,thedegreeofSquamousmetaplasiaandinflammation50relieved.ConclusionsSubcutaneousinjectionofscopolaminehydrobromidesuccessfullyestablishedratdryeyemodel.HRSeyedropsgroupandHRSintraperitonealinjectiongroupwereeffectiveandresultsofclinicalefficacyofHRStreatmentgroupswerebetterthanNSgroups.ItisindicatedthatHRScanprotectratsocularsurfaceofdryeye,improvecornealandconjunctivaltissueinjury,thefindwillbringnewhopetodryeyesyndrome.55Keywords:Dryeye;HRS;Scopolaminehydrobromide;Rat0引言干眼，又称为角结膜干燥综合症(keratoconjunctivitissicca,KCS)，是眼科常见疾病之一，主[1]60要表现为眼部烧灼感、泪膜不稳定和视觉障碍，伴有泪液渗透压升高和眼表炎症。随着人[2]口老龄化的加剧和环境的恶化，干眼的发病率逐年攀升。目前，人工泪液点眼的替代疗法[3]治疗干眼虽有一定疗效，但长期使用存在毒副作用，停药后易复发。如何有效的控制甚至逆转干眼症，寻找到一种安全有效的药物迫在眉睫。研究发现，在Sjögren综合征患者的结[4]膜和泪液中发现活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)和炎性因子含量增加。干眼动物模型[5,6]65亦证实存在明显的氧化应激和眼表炎症反应。氢气可选择性作用于羟自由基和过氧亚硝[7]基阴离子，具有抗氧化损伤的作用；同时它可抑制炎性因子的释放，具有抗炎作用。富氢盐水(hydrogen-richsaline,HRS)是将氢气在0.4MPa高压下溶于生理盐水，达到饱和浓度为0.6mmol/L，在缺血再灌注、各种退行性疾病等多种模型中均表现出明显的抗氧化抗炎作用[8-11]。本文将HRS应用于干眼大鼠模型，观察其泪液分泌及角结膜组织病理变化，研究HRS70对干眼模型是否具有保护作用。1材料与方法1.1实验动物健康清洁级6周龄雌性Wistar大鼠30只(天津医科大学动物实验中心)，体重160-180g，无眼部病变。所有涉及大鼠动物的实验程序都按照天津医科大学动物保护与使用委员会规定执75行。1.2实验方法1.2.1大鼠干眼模型的建立与实验分组选择6周龄健康Wistar雌性大鼠30只（60眼），采用随机数字表法分为6组，分别为正常组（A）、干眼组（B）、HRS点眼组（C）、生理盐水(normalsaline,NS)点眼组（D）、80HRS腹腔注射组（E）、NS腹腔注射组（F），每组5只（10眼）。后五组后肢皮下注射3mg·mL－1氢溴酸东莨菪碱，每天注射4次(9点、12点、15点、18点)，每次0.5mL，左右两侧交替进行；HRS点眼组和NS点眼组每小时点眼1次，每天点眼9次；HRS腹腔注射组和NS腹腔注射组按5ml•kg－1每天注射1次，连续28d。用药后7d、14d、21d、28d对各组大鼠行泪液分泌试验(SchirmerⅠtest,SIt)、泪膜破裂时间(break-uptime,BUT)和-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn85角膜上皮荧光素钠染色评分。用药后28d，颈椎脱臼法处死大鼠，取整个眼球，石蜡切片后行HE染色、过碘酸-雪夫染色(periodicacidschiffstain,PAS)及免疫组化染色，光镜下观察。1.2.2SIt在用药前及用药后7d、14d、21d、28d的同一时间段使用酚红棉线进行SIt测试大鼠双眼泪液分泌量。大鼠眼表不使用麻醉药物，用镊子夹持酚红棉线，将其置于大鼠下睑结膜囊中外901/3处，停留30s取出。测量棉线湿润的长度并记录(读数精确到0.5mm)。1.2.3BUT将1μL10g/L荧光素钠滴至结膜囊并闭合眼睑，裂隙灯显微镜钴蓝光下观察。3次瞬目后，以最后1次瞬目开始计时，至角膜出现第1个黑斑的时间即为BUT。1.2.4角膜上皮荧光素钠染色评分95大鼠结膜囊内滴入1μL10g/L荧光素钠90s后，在裂隙灯显微镜钴蓝光下观察角膜上皮荧光素钠着色情况并评分。将角膜平均分为4个象限并分别评分，将所有分值相加即为最后得[12]分。评分标准：0分：无着色；1分：点状着色≤30个；2分：点状着色＞30个但不弥散；3分：严重的弥散性着色但尚未形成斑块状；4分：有斑块状着色。1.2.5HE染色100颈椎脱臼法处死大鼠，迅速取下包括上下眼睑在内的整个眼球。100g/L多聚甲醛固定，常温下由低浓度至高浓度梯度酒精脱水，二甲苯透明后浸蜡、包埋，平行于眼轴方向切片，厚度为3um，HE染色后光学显微镜下观察角膜组织病理学改变。1.2.6PAS染色应用过碘酸把细胞内的多糖乙二醛基氧化成二醛，再与Schiff氏液的结合使胞浆染为紫红色105的原理，用于糖原的鉴定和黏液的显示。取眼球、固定、包埋和切片的方法均同HE染色。每眼取5张不同等分位置的切片分别进行PAS染色，以胞质染色深红者为结膜杯状细胞。1.2.7免疫组化染色石蜡切片常规脱蜡至水，放至柠檬酸钠缓冲液，微波炉中加热20min进行抗原修复，放置室温，3%过氧化氢去离子水孵育10min，以消除内源性过氧化物酶活性，磷酸盐缓冲液110(phosphatebuffersaline,PBS)冲洗，3min×3次，滴加封闭用正常山羊血清工作液，室温孵育15min，倾去，勿洗，滴加适当比例稀释的兔单克隆一抗，细胞角蛋白10(cytokeratin10,K10)，(1:2500，抗体来自美国Abcam公司)，4℃孵育过夜，次日，放至室温，PBS冲洗，3min×3次，滴加生物素标记山羊抗兔IgG，37℃孵育15min，PBS冲洗，3min×3次，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育15min，PBS冲洗，3min×3次，二氨基联苯胺115(diamlnobenzidinl，DAB)显色剂显色，自来水充分冲洗，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察。1.3统计学分析方法使用SPSS13.0统计学软件进行统计分析，数据资料经检验呈正态分布，以xs表示，并行方差齐性检验。各组问均数的比较采用方差分析，进一步组间两两比较采用LSD检验。P<0.05-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn120为差异有统计学意义。2结果2.1SIt0d时，比较各组大鼠SIt差异，无统计学意义(F=0.434,P>0.05)。从7d起，B组大鼠SIt值开始与A组有统计学学意义(P<0.05)。14d时，各组大鼠SIt差异具有统计学意义125(F=5.194,P<0.05)。D组和F组SIt值低于A组(P<0.05)，C组和E组SIt值高于B组(P<0.05)，C组SIt值高于D组(P<0.05)；E组SIt值高于F组(P<0.05)，余组间差异无统计学意义(P>0.05)。从14d起，各组大鼠SIt值趋势保持一致(见表1)。表1各组大鼠不同时间点各项检查结果表1比较各组大鼠不同时间点SIt130Tab.1ComparisonofSItatdifferenttimebetweengroups0d7d14d21d28dadaaaA组3.75±0713.75±0.463.25±0.763.56±1.053.69±0.59bbcdbcdbcdB组3.69±0.372.75±0.602.31±0.462.50±0.542.50±0.53aaaC组3.63±1.163.31±0.703.25±0.543.31±0.373.38±0.58bcdbcdbcdD组3.50±0.463.19±0.992.36±0.382.44±0.422.57±0.73baaaE组3.50±1.022.89±0.663.32±0.673.18±0.583.21±0.87bbcdbcdbcdF组3.29±0.582.75±0.622.58±0.762.38±0.382.58±0.56F值0.4342.8975.1947.1684.863P>0.05<0.05<0.01<0.01<0.01注：A为正常组，B为干眼组，C为HRS点眼组，D为NS点眼组，E为HRS腹腔注射组，abF为NS腹腔注射组。示与B组相比差异具有统计学意义(P<0.05)，示与A组相比差异具cd有统计学意义(P<0.05)，示与C组相比差异具有统计学意义(P<0.05)，示与E组相比差异135具有统计学意义(P<0.05)。2.2BUT0d时，比较各组大鼠BUT差异，无统计学意义(F=0.626,P>0.05)。从7d起，B组大鼠BUT值开始与A组有统计学学意义(P<0.05)。7d时，E组和F组BUT值低于A组(P<0.05),C组BUT高于B组(P<0.05),余组间差异无统计学意义(P>0.05)。14d时，D组和F组BUT值低于140A组(P<0.05)，C组和E组BUT值高于B组(P<0.05)，C组BUT值高于D组(P<0.05)，E组BUT值高于F组(P<0.05)，余组间差异无统计学意义(P>0.05)。从14d起，各组大鼠BUT值趋势基本保持一致(见表2)表2比较各组大鼠不同时间点BUTTab.2ComparisonofBUTatdifferenttimebetweengroups-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn0d7d14d21d28dadaaaA组2.63±0.522.88±0.642.88±0.642.88±0.352.63±0.52bcbcdbcdbcdB组2.63±0.742.00±0.762.19±0.532.25±0.712.00±0.00aaaaC组2.75±0.712.69±0.592.81±0.753.00±0.762.75±0.71bcdbcdD组3.00±0.762.50±0.602.13±0.352.75±0.462.13±0.35baaaE组3.00±0.682.32±0.462.75±0.753.21±0.702.68±0.61bcbcddbcdF组2.75±0.622.17±0.392.08±0.292.58±0.522.17±0.39F值0.6262.9103.8943.1314.095P>0.05<0.05<0.01<0.05<0.01145注：A为正常组，B为干眼组，C为HRS点眼组，D为NS点眼组，E为HRS腹腔注射组，abF为NS腹腔注射组。示与B组相比差异具有统计学意义(P<0.05)，示与A组相比差异具cd有统计学意义(P<0.05)，示与C组相比差异具有统计学意义(P<0.05)，示与E组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。1502.3角膜上皮荧光素钠染色评分0d时，比较各组大鼠评分，无统计学意义(F=0.587,P>0.05)。从7d起，B组大鼠荧光素钠染色评分开始与A组有统计学学意义(P<0.05)。7d时，F组评分高于A组(P<0.05)，C组评分155低于B组(P<0.05)，余组评分差异无统计学意义(P>0.05)。14d时，D组、E组和F组评分高于A组(P<0.05)，C组、D组和E组评分低于B组(P<0.05)，C组评分低于D组(P<0.05)；E组评分低于F组(P<0.05)，余组评分差异无统计学意义(P>0.05)。从14d起，各组大鼠评分趋势基本保持一致(见表3)。表3比较各组大鼠不同时间点荧光素钠染色评分160Tab.3Comparisonofcornealepithelialfluoresceinstainingscoresatdifferenttimebetweengroups0d7d14d21d28daadaaA组6.25±0.898.75±0.898.14±0.648.75±1.047.88±1.13bcbcdbcdbcdB组6.38±0.529.88±1.0010.50±0.7610.25±0.899.88±1.00aaaaC组6.25±0.718.88±0.648.75±0.719.25±0.468.25±1.28abcdbcdbcdD组6.63±0.749.00±1.079.75±0.7110.25±0.469.50±1.20abaaE组6.00±0.689.14±1.038.86±0.779.14±0.958.50±0.76bcbcdbcdbcdF组6.42±1.389.90±1.0010.33±0.6510.58±0.679.75±0.62F值0.5872.42416.4878.7286.989P>0.05<0.05<0.01<0.01<0.01注：A为正常组，B为干眼组，C为HRS点眼组，D为NS点眼组，E为HRS腹腔注射组，abF为NS腹腔注射组。示与B组相比差异具有统计学意义(P<0.05)，示与A组相比差异具cd有统计学意义(P<0.05)，示与C组相比差异具有统计学意义(P<0.05)，示与E组相比差异165具有统计学意义(P<0.05)。-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn28d各组大鼠角膜上皮着染图片示，A组、C组和E组未见明显着染，B组、D组和F组角膜着染严重，出现粗点状及小片状弥漫性角膜上皮着色(见图1)。170图1比较各组大鼠角膜荧光素钠染色Fig.1Comparisionofcornealepithelialfluoresceinstainingbetweengroups-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn2.4HE染色175观察各组HE染色结果，可见A组角膜上皮分层良好，分4或5层，层次清晰，基底部细胞呈柱状排列，靠近角膜表面逐渐变成鳞状上皮细胞，细胞排列紧密整齐，形态完整。结膜上皮细胞排列整齐，杯状细胞形态完整，分布在上皮细胞间，主要分布在穹隆部。B组可见角膜上皮细胞分层模糊，细胞体积较大，核间距较大，排列不紧密，细胞分界不清，基底层细胞部分缺失，出现空泡，上皮表面细胞损伤脱落，表面欠光滑。结膜上皮表现出增生过度，180细胞厚度增加，层次紊乱，基底细胞排列紊乱，表层细胞损伤脱落，结膜出血，有炎性渗出，表层扁平细胞层数增多，结膜组织角化增加，结膜上皮细胞层次模糊，杯状细胞分布更靠近基底层细胞。C组和E组角结膜上皮均变平整，规则，组织增生减少，呈现病情减弱趋势。D组和F组角膜上皮基底部仍有空泡样改变，且结膜增生比较明显(见图2)。-7- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn185图2比较各组大鼠角膜结膜组织学变化（HE染色，20×）Fig.2Comparisionofhistologicmanifestationofcorneaandconjunctivabetweengroups(HEstaining,20×)2.5PAS染色190杯状细胞分布于睑结膜和穹隆部结膜的上皮细胞层，睑板沟处比较集中，分泌粘液湿润角膜[13]和结膜，起保护作用。位于结膜杯状细胞PAS染色阳性，为紫红色，如图3所示。A组结膜上皮细胞排列整齐，杯状细胞大小一致，分布均匀。B组结膜上皮细胞明显增生，表面欠平整，杯状细胞大小不均匀，靠近基底部。C组和E组结膜上皮增生明显减少，细胞层次减少，表层变光滑，杯状细胞大小趋于正常。D组和F组未见明显变化(见图4)。195图3比较各组大鼠结膜组织杯状细胞变化（PAS染色，40×）-8- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnFig.3Comparisionofconjunctivalgobletcellsbetweengroups(PASstaining,40×)2002.6免疫组化染色鳞状上皮化生是指分泌型非角化复层上皮转变为非分泌型角化鳞状上皮的一种病理过程，又称病理性角化，可发生于包括眼表在内所有的上皮组织。K10是常用的角化标记物，是干眼[14]鳞状上皮化生的诊断标准。图4显示为各组角膜上皮K10表达情况，可见B组、D组和F组角膜上皮全层表达K10强阳性，且观察到表达K10的阳性细胞胞质染色；A组、C组205和E组角膜未表达K10；各组睑结膜上皮均未表达K10。图5显示为各组穹隆部结膜上皮K10表达情况，可见B组、D组和F组穹隆部结膜上皮全层表达K10强阳性，A组、C组和E组K10弱表达。图4比较各组大鼠角膜组织K10表达变化（免疫组化染色，40×）210Fig.4ComparisionofcornealexpressionofK10betweengroups(Immunohistochemistrystaining,40×)-9- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图5比较各组大鼠穹窿部结膜组织K10表达变化（免疫组化染色，40×）Fig.5ComparisionoffornixconjunctivalexpressionofK10betweengroups215(Immunohistochemistrystaining,40×)3讨论干眼症是最常见的眼表疾病之一。全世界范围的患病率为5%-34%，2014年，LiuNN等人[15]220分析中国大陆，干眼症患者的发病率为17%，尤其是在老年女性患者中比较常见。研究认为泪液分泌减少和蒸发过强均可导致泪液渗透压增高，眼表高渗状态产生大量ROS。ROS[16]在细胞信号传递和内环境稳定方面起主要作用，但过量的ROS导致氧化应激，诱发生物[17,18]膜的脂质过氧化、细胞内蛋白的氧化修饰和DNA的氧化损伤。同时，氧化应激可活化大量转录因子及其下游的基因产物，如炎性因子、趋化因子等，并通过各自的信号通路介导[19]225炎症反应。正常情况下，机体内存在生理性的抗氧化系统，免疫力低下或抵抗力弱的情况下，体内氧化还原系统紊乱，导致氧化损伤，介导炎症。氧化应激和炎症反应在干眼的发[5]病过程中相互作用，共同参与干眼的病理过程。鳞状上皮化生是干眼症状出现的标志，同时也是眼表上皮对不利环境和有害因素的一种适应性改变，往往伴随着慢性炎症反应、黏蛋[20]白减少等一系列病理改变。中重度鳞状上皮化生会引起眼表上皮细胞结构或功能的丧失，230不易逆转，长期存在可诱发局部慢性炎症反应、上皮增厚、干燥粗糙、透明度下降、泪膜的[14,21]不稳定，反过来又加剧了鳞状上皮化生，形成恶性循环。因此，如何有效预防并逆转炎症和鳞状上皮化生，是治疗干眼的关键。目前临床上使用抗炎药物联合人工泪液治疗干眼取得了一定的进步，解决了单独使用人工泪液，干眼症状易复发的问题。传统的眼部抗炎药物主要为糖皮质激素，免疫抑制剂和非甾体235类药物等。糖皮质激素抗炎效果好，但长期使用易导致白内障、青光眼等并发症，逐渐被其他药物所替代。临床观测表明0.05％的环孢素A具有免疫抑制、抗细胞凋亡，减轻炎症反[22]应，促进结膜杯状细胞分泌黏蛋白，增加眼泪的分泌量等功能，然而Yüksel等通过印迹-10- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn[23]细胞学技术发现环孢素A滴眼液对重度干眼症疗效不佳。非甾体类药物如普拉洛芬滴眼液，能抑制前环氧合酶，阻断花生四烯酸生成前列腺素，消除局部炎症介质、缓解瘙痒、镇[24]240痛、改善眼部微循环，对干眼炎症具有显著的抗炎作用，长期使用存在毒副作用。XiaoQ等人研究发现二甲胺四环素能够抑制眼表炎症和鳞状上皮化生，但长期使用抗生素，可引起[25]眼表菌群失调，引起过敏等不良反应。研究发现，氢气可明显降低血清和组织氧化产物水平、提高抗氧化酶活性，减轻脓毒症小鼠[26]的多器官损伤，说明氢气具有抗氧化和抗炎作用。OhsawaI等人研究表明氢气可以通过[9]245选择性清除自由基、抑制炎症因子表达来减少局灶性脑缺血模型动物的脑梗死面积。AnwenShao等发现HRS能通过抑制核转录因子的活性来减轻炎症反应，从而对SD大鼠蛛[27]网膜下腔出血的治疗起到一定作用。ChenX等在研究中发现HRS通过控制氧自由基和炎[28]性反应，能减少吸入性肺损伤的程度。目前研究表明，HRS在很多疾病中显示出抗炎和抗氧化作用,尚未见HRS治疗干眼的研究。250研究发现皮下注射东莨菪碱，能够抑制泪腺和结膜杯状细胞的分泌，成功建立大鼠干眼模型[29]。本研究从7d起干眼组SIt、BUT、荧光素钠染色评分均下降，与正常组差异显著，干眼[29,30]模型复制成功，与相关研究结果一致。HRS点眼后，氢气在常压下易从HRS中分离出来，在组织中弥散较快，通过中和羟自由基抑制氧化损伤，对组织起保护作用。研究发现HRS抑制大鼠视网膜缺血再灌注损伤，点眼2min后氢气浓度在大鼠玻璃体内逐渐升高，15[31]255分钟后达最高水平；HRS点眼停止，氢气浓度逐渐降低，15分钟后完全消失。本实验7d时HRS点眼组大鼠干眼临床指标部分表现好转，从14d起HRS点眼组大鼠干眼的临床指标疗效优于NS点眼，提示其对干眼有一定治疗作用。也有研究表明腹腔注射或静脉注射HRS[32]能抑制大鼠肠道和心肌等器官的缺血再灌注损伤，本研究14d时HRS腹腔注射组大鼠眼表得以改善，干眼症状缓解晚于HRS点眼，可能是腹腔注射经体内循环代谢，局部吸收需260要一定时间。从14d起，HRS点眼组和HRS腹腔注射组大鼠干眼症状均得到缓解，且治疗效果一致，说明HRS的两种给药方式在14d以后开始发挥一致疗效。HE和PAS染色可见HRS点眼组和HRS腹腔注射组角结膜上皮细胞排列整齐，水肿减轻，分层良好，结膜杯状细胞形态完整，表明HRS能够减轻角结膜组织病理损伤。研究表明干眼、Stevens-Johnson综合征、粘膜性类天疱疮、化学烧伤，翼状胬肉和维生素A缺乏等多种眼表疾病均存在慢[33]265性炎症反应，通过信号通路导致鳞状上皮化生。免疫组化染色结果示HRS点眼组和HRS腹腔注射组的角膜未表达K10，在穹隆部结膜弱表达，明显优于干眼组、NS点眼组和NS腹腔注射组，说明HRS能够改善角结膜鳞状上皮化生，可能与HRS抗炎作用相关。本研究发现HRS在干眼治疗中起一定作用，为干眼的治疗提供了一种新的方法。氢气性质稳定，制成点眼剂，并采取一定的包装工艺防止其挥发；或者制成口服药物，可为干眼治疗270带来新的希望。但HRS对干眼模型中炎症、氧化应激和鳞状上皮化生的的抑制作用需要更加深入的研究。[参考文献](References)[1]ZeevMS,MillerDD,LatkanyR.Diagnosisofdryeyediseaseandemergingtechnologies[J].ClinOphthalmol,2752014,20(8):581-590.SharmaA,HindmanHB.Aging:apredispositiontodryeyes[J].JOphthalmol,2014,2014:781683.-11- 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