新型多靶点化和物EMB的抗肿瘤作用研究.pdf 6页

'中国http://www.paper.edu.cn科技论文在线新型多靶点化和物EMB的抗肿瘤作用研究*李颖博，李润涛，周德敏（北京大学药学院，北京100191）5摘要：目的：以EMB为探针研究4-芳氨基喹唑啉磷酰氮芥类化和物的抗肿瘤活性和作用机制。方法：利用MTT法检测化合物对肿瘤细胞活力的影响。通过酶活性法和Westernblot法检测化合物对酪氨酸激酶EGFR激酶活性的影响。通过单细胞凝胶电泳实验和Westernblot方法检测化合物对细胞DNA的损伤作用。通过流式细胞术检测化合物对细胞周期的影响。结果：化合物EMB可显著抑制多种肿瘤细胞的活力，诱导细胞DNA损伤，引起细胞周期10阻滞，并抑制酪氨酸激酶EGFR的激酶活性。结论：以化合物EMB-3为代表的此类化合物是一类同时具有EGFR抑制剂活性和DNA损伤活性的新型多靶点抗肿瘤化合物。关键词：抗肿瘤；多靶点；酪氨酸激酶；DNA损伤中图分类号：R9615Anti-cancerevaluationofquinazoline-phosphoramidatemustardconjugateEMBLIYingbo,LIRuntao,ZHOUDemin(SchoolofPharmaceuticalSciences,PekingUniversity,Beijing100191)Abstract:Objective:toexploretheanti-cancereffectsandunderlyingmechanismofEMB.Methods:20MTTassaywasusedtoevaluatethecellviability.KinaseenzymeassayandWesternblotassaywereusedtoevaluatetheeffectofEMBonEGFRactivation.DNAagarosegelelectrophoresisandWesternblotassaywereusedtoevaluatetheDNAdamage.Flowcytometrywasusedtoanalyzecellcycle.Results:EMBinhibitscellviabilityinseveralcancercelllines.ItcouldinhibitEGFRactivation,andinduceDNAdamage.Conclusion:compoundEMBcouldbothirreversiblyinhibitEGFR/HER-2and25damageDNA,anditrepresentsagroupofnewmulti-targetanti-canceragents.Keywords:Anti-cancer;multi-targets;tyrosinekinaseactivity;DNAdamage0引言乳腺癌是威胁女性健康最主要的恶性肿瘤之一。近年来，尽管在乳腺癌早期诊断及治疗30策略方面已有较大进展，但现有化疗药的耐药和毒性使得对治疗乳腺癌的新靶点新药物的研发格外受到关注。研究表明，在16%-48%的乳腺癌患者中发现酪氨酸激酶EGFR的过表达，25-30%患者中发现HER2的过表达。在三阴性乳腺癌患者中也发现了EGFR的表达增加。另外，EGFR/HER2的异常活化可能介导内分泌治疗的耐药产生。这些证据表明，针对EGFR/HER2的分子靶向治疗是对传统化疗及内分泌治疗策略的补充，对乳腺癌的治疗具有[1]35重要意义。然而临床应用显示，已上市的酪氨酸激酶抑制剂Gefitinib、Erlotinib和Lapatinib等面临继发性耐药产生的问题，这使得针对EGFR/HER2分子靶向的药物研发和应用面[2,3]临严峻挑战。作用于多靶点，多途径的抗肿瘤药物发现是提高肿瘤细胞对酪氨酸激酶抑[4]制剂的敏感性并防止耐药产生的重要途径。基于多靶点作用的思路，本研究通过适当的连接臂将EGFR/HER2抑制剂的母体结构40（Lapatinib）与磷酰氮芥连结起来，发现了一类新型多靶点抗肿瘤化合物。并以EMB为代作者简介：李颖博（1983-），女，助理研究员，化学生物学.E-mail:liyb@bjmu.edu.cn-1- 中国http://www.paper.edu.cn科技论文在线表深入研究其作用机制，以期发现一类既能阻断酪氨酸激酶活化,又能对DNA产生烷化作用的多靶点抗肿瘤化合物。1材料与方法1.1MTT法检测化合物对细胞活力的影响45肿瘤细胞株SK-BR-3,MDA-MB-468,HCT-116于含10%胎牛血清，1%双抗的DMEM培3养基中常规培养。将5×10细胞接种于96孔板中，贴壁后分别给予不同浓度的EMB和lapatinib，培养72h后加入MTT溶液，继续培养4h,弃去液体，每孔加入150μlDMSO，振荡使结晶物充分溶解后，在酶标仪以620nm吸收光处检测各孔吸光值。化和物IC50利用GraphPadPrism5软件计算。501.2激酶活性检测法检测化合物对EGFR酶活性的抑制作用使用Z’-LYTETyr4激酶分析试剂盒(Invitrogen公司)和Tyr-4肽底物进行酶结合实验。优化好激酶浓度和反应时间后，按照试剂盒说明，在384孔板中分别加入2.5µl化合物,5µl激酶/Z’-LYTETyr4溶液,2.5µlATP溶液，混匀后在25°C进行酶反应30min。每孔加入5µl切除液,混匀后在25°C进行切除反应（DevelopmentReaction）30min。在反应各孔中加入5µl终55止液,震摇混匀30s。用酶标仪检测(Ex.400nm,Em.445nm；Ex.400nm,Em.520nm)荧光强度。以GraphPadPrism5软件分析药物对EGFR激酶作用的IC50值。1.3Westernblot法检测化合物对EGFR磷酸化酶抑制作用为检测EMB对EGFR磷酸化的抑制作用，细胞经EMB给药处理1h后,用50ng/mlEGF刺激细胞15min后立即收集细胞蛋白进行WesternBlot检测。为检测药物对EGFR磷酸化的抑制60作用是否可逆，细胞经EMB处理1h,用PBS清洗1-2次去除未结合EMB后，于DMEM培养液中继续培养6h,再用含50ng/mlEGF的培养液刺激15min。收集细胞蛋白进行WesternBlot检测。1.4单细胞凝胶电泳实验检测化合物诱导DNA损伤的作用6细胞接种于6孔板中，经不同浓度EMB处理后，收集细胞，用PBS重悬使其密度为1×1065个/ml。将100μl的0.5%正常熔点琼脂糖NMA铺于载玻片上，待其凝固后，将10μl细胞（约410个）和75μl的0.7%低熔点琼脂糖LMA混合铺于第一层上。之后再将75μl的0.7%低熔点琼脂糖LMA铺于第二层上，4°C下凝固30min。将上述载玻片置于预冷的LysisBuffer中裂解细胞，之后置于碱性电泳液中使DNA碱性解旋60min。电泳20-30min后，SYBRGreen染色，置于荧光显微镜下观察并拍照。图像经Komet5.5分析。701.5流式细胞术检测化合物对细胞周期影响细胞接种于6孔板中，经同步化处理后，采用不同浓度化合物处理24h，收集细胞，固定过夜。加入含100µg/mlRNAse和50µg/ml碘化丙啶(PI)的PBS溶液染色后，立即用流式细胞仪(BDFACSCantoTM,USA)进行检测。细胞周期结果采用ModfitLT3.0软件(VeritySoftwareHouse,USA)进行分析。-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn752结果2.1化合物EMB抑制肿瘤细胞活力我们选择了SK-BR-3（HER2高表达），MDA-MB-468（EGFR高表达）和HCT-116（EGFR5和HER2均低表达）三种肿瘤细胞模型，对化合物的抗肿瘤活性进行了评价，并以EGFR/HER2酪氨酸激酶抑制剂Lapatinib作为阳性药进行比较。MTT结果显示，Lapatinib80对SSK-BR-3，MDA-MB-468和HCT-116三种肿瘤细胞的IC50分别为4.4，19.6和24.0μM。EMB（图1）对三种肿瘤细胞的IC50分别为2.8，19.0和11.0μM。在HER2高表达的SK-BR-3和EGFR高表达的MDA-MB-468乳腺癌细胞株上，EMB均显示出了比Lapatinib更好的抑0制细胞活力的作用。585图1EMB结构式Fig.1SturctureofEMB2.2化合物抑制酪氨酸激酶EGFR的活化为检测化合物是否具有与Lapatinib类似的EFGR抑制作用，我们对化合物进行了体外90的酶活性抑制实验。如表1所示，EMB对EGFR酶活性的IC50值为0.112μM，尽管高于Lapatinib（IC50=0.018μM），仍能说明EMB具有较强的EGFR抑制作用。表1EMB和Lapatinib对EGFR酶活性的IC50值5Tab.1IC50ofEMBandLapatinibonEGFRkinaseactivityCompoundEGFRinhibition(IC50/μM)EMB0.112±0.019lapatinib0.018±0.009950为进一步证实EMB对EFGR的抑制作用，我们采用Westernblot法检测了EMB对EGFR磷酸活化的影响。同时，考虑到磷酰氮芥基团对DNA具有烷化作用，我们推测该基团对受体结合口袋的氨基酸残基也具有烷化作用，从而不可逆性抑制EGFR/HER2受体；因此，我们设计了洗脱实验，以考察化合物对EGFR的抑制作用是否可逆。1005如图2所示，EMB与MDA-MB-468细胞共孵育1h后，对表皮生长因子（EGF）诱导的EGFR磷酸化具有明显的抑制作用，且呈现出剂量依赖性。在洗脱实验中，将EMB与MDA-MB-468细胞共孵育1h，洗脱以除去未结合的EMB，孵育6h后，再以EGF诱导EGFR磷酸化，结果显示EGFR磷酸化仍然受到明显的抑制。这表明EMB确实通过抑制EGFR而杀伤细胞，而且属于不可逆性抑制剂。-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn1050图2EMB不可逆抑制EGF诱导的EGFR磷酸化活化。NoWash：细胞经EMB处理1h后,用EGF刺激15min后立即收集细胞蛋白进行WesternBlot检测；WashOut:细胞经EMB处理1h,用PBS清洗去除未结和EMB后，继续培养6h,再用EGF刺激15min后，收集细胞蛋白进行WesternBlot检测。1105Fig.2EMBirrversibllyinhibitsEGF-inducedEGFRphosphorylationinMDA-MB-468cells.NoWashExperiment:CellsweretreatedwithEMBfor1h,andthenexposedtoEGFfor15min,cellswerecollectedforWesternblotanalysis.WashOutExperiment:CellsweretreatedwithEMBfor1h,andthenwashedbyPBStoremovetheunbindedEMB,thenincubatedincellculturemediumfor6h.Afterthat,cellswereexposedtoEGFfor15minandcollectedforWesternblotanalysis.1152.3化合物引起细胞DNA损伤0本研究中的化合物是通过适当的连接臂将EGFR/HER2抑制剂的母体结构与磷酰氮芥连结起来的，磷酰氮芥具有诱导DNA损伤作用，因此我们接下来研究了化合物对细胞DNA损伤的作用。120利用单细胞凝胶电泳实验，以彗尾长度为指标，测定不同浓度的化合物对DNA的损伤5作用，采用浓度分别为1,3,10倍于化合物抑制细胞活力的IC50值浓度。结果如图3A所示，在MDA-MB-468细胞中，当EMB浓度为1倍于IC50时，即显示出明显的DNA损伤作用，且损伤程度剂量依赖性增加。此外，我们还利用Westernblot方法检测了化合物对DNA损伤相关蛋白的作用。ATM1250/ATR是DNA损伤的应激反应中心，DNA损伤后，ATM/ATR信号通路激活，Chk1是ATM/ATR的重要底物，激活后将损伤信号传递至下游，引发周期阻滞、损伤修复等生物学效应。如图3B所示，EMB可诱导Chk1磷酸化活化，并引起H2AX磷酸化增强，提示EMB引起了DNA双链断裂损伤。-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn0130图3EMB在MDA-MB-468细胞中诱导DNA损伤。（A）化合物作用于细胞2h后，通过单细胞凝#胶电泳实验实验分析化合物对细胞DNA损伤的作用。P<0.05。（B）细胞经化合物处理3h后，对DNA5损伤相关蛋白进行WesternBlot检测。Fig.3EMBinducesDNAdamageinMDA-MB-468cells.(A)CellswereexposedtoEMBfor2handthen#theDNAdamagewasdeterminedbyalkalinecometassay.P<0.05versuscontrol(B)CellsweereexposedtoEMB135for3handthenDNAdamagerelatedmarkerswereanalyzedbyWesternblotassay.2.4化合物引起细胞周期阻滞DNA损伤会引起细胞在周期检查点停滞，以进行DNA损伤修复。因此我们采流式细胞术检测了化合物对细胞周期的影响，结果显示，EMB可诱导MDA-MB-468细胞阻滞于140G2/M期，且阻滞细胞数目剂量依赖性的增加（图4）。5图4EMB引起MDA-MB-468细胞周期阻滞于G2/M期。不同浓度化合物作用于细胞24h后，通过流式细胞术检测化合物对细胞周期的影响。（A）细胞周期DNA直方图。（B）EMB剂量依赖性的增加阻滞于G2/M期细胞数目。145Fig.4EMBarrestsMDA-MB-468cellsatG2/Mphase.CellsweretreatedwithdifferentconcentrationofEMBfor24h,andthensubjectedtoflowcytometry.(A)Thetypicalhistogramswereshown.(B)CellsinG2/M0phaseofthecellcyclewereincreaseddose-dependently.0-5- 中国http://www.paper.edu.cn科技论文在线1503讨论越来越多的研究显示，肿瘤的发生发展是一个多因素作用、多基因参与的复杂的生物学过程，单一药物单一靶点的治疗方法往往存在着疗效不佳、毒副作用大和容易出现耐药性的问题。目前，临床治疗中经常采用多种不同作用机制的药物联合治疗，以克服上述的问题。近年来，多靶点药物的研发成为肿瘤领域的热点。科学家希望设计一个具有合适结构的药物155分子，这个分子本身或者活性代谢产物能作用于两个或更多的靶点，这些治疗效果能协同作[5,6,7]用，从而实现更好的治疗效果。EGFR抑制剂是近年来上市的抗肿瘤药物，治疗效果显著，但是在临床应用中，已经发现受体的T790M部位发生突变，导致耐药性的出现。环磷酰胺是一种应用多年的DNA烷化剂类抗肿瘤药物，但是严重的毒副作用限制了临床上的应用。在本研究中，我们将EGFR160抑制剂和DNA烷化剂结合起来设计了一系列的双靶点药物分子。将EGFR/HER-2抑制剂的母体结构与磷酰氮芥通过合适的连接臂结合，以期研发一类既能作用于EGFR和HER-2受体，又能对DNA产生烷化作用的高效低毒的多靶点抗肿瘤药物。以EMB为探针的研究结果显示，EMB能够不可逆的抑制EGFR通路的活化，抑制EGFR的激酶活性，在多种EGFR和HER2高表达的肿瘤细胞株上发挥显著地抑制作用，且优于阳165性药物Lapatinib。同时,EMB可诱导Chk1介导的H2AX活化，引起细胞DNA损伤，从而引起细胞阻滞于G2/M期。这些结果显示，EMB同时具备了EGFR激酶抑制剂活性，和DNA损伤的活性，是一类新型的多靶点抗肿瘤化合物。本研究从药理学角度验证了此类连接型多靶点抗肿瘤药物的研究思路的可行性，为药物设计和优化提供支持。4结论170本研究以化合物EMB为探针，通过EGFR受体结合试验、EGFR磷酸化试验、DNA损伤试验和细胞周期试验对其作用机制进行了研究，结果显示，EMB既有EGFR受体抑制活性，又有DNA烷化作用，以EMB-3为代表的此类化合物是一类同时具有EGFR抑制剂活性和DNA损伤活性的新型多靶点抗肿瘤化合物。[参考文献](References)175[1]KamathS,BuolamwiniJK.TargetingEGFRandHER-2ReceptorTyrosineKinasesforCancerDrugDiscoveryandDevelopment[J].MedicinalResearchReviews,2006,26:569.[2]KosakaT,YatabeY,EndohH,YoshidaK,HidaT,TsuboiM,TadaH,KuwanoH,MitsudomiT.Analysisofepidermalgrowthfactorreceptorgenemutationinpatientswithnon-smallcelllungcancerandacquiredresistancetogefitinib[J].ClinCancerRes.2006,12(19):5764-5769180[3]JackmanD,PaoW,RielyGJ,EngelmanJA,KrisMG,JännePA,LynchT,JohnsonBE,MillerVA.Clinicaldefinitionofacquiredresistancetoepidermalgrowthfactorreceptortyrosinekinaseinhibitorsinnon-small-celllungcancer[J].JClinOncol,2010,28(2):357-360.[4]RachidZ,BrahimiF,KatsoulasA,TeohN,Jean-ClaudeBJ.Thecombi-targetingconcept:chemicaldissectionofthedualtargetingpropertiesofaseriesof"combi-triazenes"[J].JMedChem,2003,46(20):4313-4321.185[5]ZimmermannGR,LehárJ,KeithCT.Multi-targettherapeutics:whenthewholeisgreaterthanthesumoftheparts[J].DrugDiscovToday,2007,12(1-2):34-42.[6]郭宗儒.药物分子设计的策略：双靶标药物设计[J].药学学报，2009，44(3)：209−218[7]ZhaoY,SuJ,GotoM,Morris-NatschkeSL,LiY,ZhaoQS,YaoZJ,LeeKH.Dual-functionalabeo-taxanederivativesdestabilizingmicrotubuleequilibriumandinhibitingNF-κBactivation[J].JMedChem,2013,56(11):1904749-4757.-6-'