柴芪汤对非酒精性脂肪肝大鼠肝脏组织氧化应激的影响及意义.pdf 7页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn柴芪汤对非酒精性脂肪肝大鼠肝脏组织氧#化应激的影响及意义**陈丽如，张立平，张嘉琰，彭龙5（北京中医药大学东方医院，北京市10078）摘要：目的观察柴芪汤对非酒精性脂肪肝（NAFLD）大鼠氧化应激的影响，并分析其对肝脏组织的保护作用。方法将32只SPF级雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、柴芪汤组和罗格列酮组，除正常组外用高盐高脂高糖饮食喂养8周，用药组从造模第一天开始给予柴10芪汤（5.67g/kg•d）、罗格列酮混悬液（3mg/kg•d）灌胃干预，8周后分别测定各实验组血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)以及肝组织中的丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及TG含量；光镜观察肝组织脂肪病变程度。结果模型组大鼠血清ALT、AST及肝脏组织MDA、TG水平明显高于正常组（P<0.05），SOD、GSH-Px明显低于正常组（P<0.05）；用药组各项指标低于模型组，差15异有统计学意义（P<0.05）；柴芪汤组大鼠ALT、AST指标较罗格列酮组无明显差异；柴芪汤组与罗格列酮组比较可明显升高肝组织内SOD及GSH-Px含量，有统计学差异（P<0.05）。结论柴芪汤在调节NAFLD大鼠肝功及血脂的水平与罗格列酮作用效果相似，但在对抗氧化应激的方面效果优于罗格列酮，柴芪汤对大鼠NAFLD有一定的防治作用。关键词：非酒精性脂肪肝；柴芪汤；肝脏保护；氧化应激20中图分类号：R259TheeffectsofChaiqidecoctiononOSinthelivertissuefromNAFLDratsCHENLiru,ZHANGLiping,ZHANGJiayan,PENGLong25(DongfangHospital,BeijingUniversityofChineseMedicine,BEIJING10078)Abstract:Objective:ToobservetheeffectsofChaiqidecoctiononoxidativestressinthenon-alcoholicfattyliverdiseaseratmodel,andanalysetheprotectionoflivertissue.Methods：Theratswererandomlydividedintonormalgroup,modelgroup,Chaiqidecoctiongroupandrosiglitazonegroup,theratmodelwasestablishedbyfeedinghighfat,highsugarandhighsaltdietfor8weeks.The30ChaiqidecoctiongroupwasgivenChaiqidecoction(5.67g/kg•d)fromthebeginningofmodeling,androsiglitazonegroupwasgivenrosiglitazone(3mg/kg•d).ThelevelsofALT、ASTinserumandthelevelofSOD、MDA、GSH-Px、TGinlivertissueweredetectedafter8weeks.Liverpathologicalhistopathologyamongthefourgroupswereobservedunderlightmicroscope.Results：Incomparingwiththatofthenormalgroup,theALT、ASTinserum,thelevelsofMDA、TGinlivertissuewere35significantlyincreased,whilethelevelsofSODandGSH-Pxinlivertissueweredecreasedinmodelgroup(P<0.05).Alltheindexesofthetwotreatmentgroupswerelowerthanthemodelgroup,thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).TherewasnosignificantdifferencebetweenChaiqidecoctiongroupandrosiglitazonegroupintheALT、ASTlever（P﹥0.05）,butthelevelsofSODandGSH-PxinlivertissueinChaiqidecoctiongroupwaslowerthantherosiglitazonegroup,thedifference40wasstatisticallysignificant(P<0.05).Conclusion：ChaiqidecoctionhaspositivetherapeuticeffectsagainstexperimentalNAFLDinrats,betterthanrosiglitazoneinoxidativestress.Keywords:Non-alcoholicfattyliverdisease;Chaiqidecoction;liverprotection;oxidativestress基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（20130013110016）；国家自然科学基金（81273695）作者简介：陈丽如（1987），女，主要研究方向：代谢综合征通信联系人：张立平,女，教授、博导，主要研究方向：代谢综合征中医治疗,胃食管反流病的中医辨证论治.E-mail:lpzhang2005@126.com-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn450引言非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholicfattyliverdisease，NAFLD）是指除酒精因素以外的[1]其他明确因素引发,以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征的肝损伤，是代谢综合征在[2]肝脏的表现，可以进展到肝硬化和终末期肝病。是一种与胰岛素抵抗(insulinresistance，IR)[3]和遗传易感密切相关的代谢应激性肝脏疾病，发病机制至今尚末阐明，目前已有文献报道[4]50与氧化应激损伤密切相关。NAFLD是2l世纪全球重要的公共健康问题之一，亦是我国愈[5]来愈重视的慢性肝病问题。课题组在前期临床观察和实验研究中发现具有健脾疏肝功能的[6]柴芪汤对于代谢综合征、脂质代谢具有一定的预防及调控作用，NAFLD作为代谢综合征的肝脏表现，本实验旨在研究柴芪汤对NAFLD大鼠的防治作用及抗氧化应激作用，并观察肝组织脂肪变性程度，为今后中医药预防及治疗NAFLD提供科学资料。551材料与方法1.1实验动物SPF级SD雄性大鼠6-8周龄，体重200±20g，共32只购于北京维通利华实验动物技术有限公司[合格证号：SCXK（京2012-0001）]。1.2药物及试剂60柴芪汤（柴胡10g，黄芪30g，白术10g，枳实10g，三七粉3g）由北京中医药大学东方医院中药房代煎制备。罗格列酮由葛兰素史克公司生产，规格4mg/片，批号H20020475。高盐高脂高糖饲料（52.5%基础饲料，10%熟猪油，10%蛋黄粉，2%胆固醇，10%奶粉，10%果糖，5%食用盐，0.5%胆盐）由北京科澳协力饲料有限公司提供。谷草转氨酶(aspartatetransaminase，AST)、谷丙转氨酶(alanineaminotransferase，ALT)65测试盒均购中生北控生物科技股份有限公司。胰岛素放免试剂盒购于北京华英生物技术研究所，批号20141201。肝组织检测甘油三酯(triglyceride，TG)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase，GSH-Px)测试盒均购自南京建成生物工程研究所。1.3试验方法701.3.1动物饲养及干预将32只大鼠适应性喂养1周后，按随机数字表法随机分为4组：正常组、模型组、柴芪汤组与罗格列酮组，每组8只。除正常组给予普通饲料外，其余三组均给予高盐高脂高糖饲料喂养8周。自造模第1天开始持续灌胃8周，柴芪汤组给予柴芪汤5.67g/kg·d（按“人和动物体表面积折算的等效剂量比值表”计算），罗格列酮组予罗格列酮混悬液3mg/kg·d，75正常组及模型组给予10ml/kg·d蒸馏水对照。1.3.2标本采集实验第8周末处死全部大鼠，禁食不禁水12h，称重后以10%水合氯醛溶液（4ml/kg）-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn腹腔注射麻醉，于腹主动脉取血，静置1h，置于离心机4℃，3000r/min离心15分钟，分离上层血清，分装冻存待测。取血后迅速摘取肝脏，用冰生理盐水冲洗。于各组大鼠肝脏最大80叶距边缘0.5cm处，切取约1.0cm×0.5cm×0.5cm大小的肝组织，置于4%多聚甲醛溶液中，待做病理学观察。将最大叶剩余肝组织切成约0.5cm×0.5cm×0.5cm大小若干块（全部过程在冰上操作），置于冻存管中，-80℃冰箱冻存待用。1.3.3指标检测及计算用全自动生化分析仪（型号：日立7160）测定血清ALT、AST。准确称取一块大鼠肝85组织，按重量（g）：体积（ml）=1:9的比例加入9倍体积的冰生理盐水，制备成10%的肝组织匀浆液，在冰浴下使用超声匀浆机匀浆5s/次，间隔5s，共7～8次，至匀浆液均匀无颗粒为止，3500r/min离心15min后取上清，按试剂盒方法测定肝脏组织上清中SOD活性，MDA，GSH-Px和TG含量。1.3.4肝脏组织学形态改变的观察90将固定好的肝组织从多聚甲醛中取出，流水过夜后脱水机梯度脱水，常规石蜡包埋，以4µm连续切片行HE染色，光镜下观察大鼠肝脏脂肪变性情况。1.4统计学处理应用SPSS17.0统计学软件进行处理，计量资料用均数±标准差（xs）表示，采用单因素方差分析（one-wayANOVA），P<0.05为存在统计学差异。952结果2.1各组大鼠血清ALT、AST水平的比较模型组大鼠血清ALT及AST明显高于正常组，差异具有显著性（P<0.05），两个用药组干预后肝功ALT及AST较模型组降低，差异具有统计学意义（P<0.05），且与正常组比较无明显差异（P﹥0.05），但两用药组间比较无统计学差异（P﹥0.05）。见表1。100表1各组大鼠血清ALT、AST（xs）组别nALT（U/L）AST（U/L）正常组843.667.43149.3917.82模型组868.2912.49#258.9461.60#柴芪汤组854.2313.89*191.7561.12*罗格列酮组850.7814.1*171.2237.82*注：与正常组比较#P<0.05，与模型组比较*P<0.052.2各组大鼠肝脏组织SOD、MDA、GSH-Px及TG水平模型组大鼠肝组织中SOD与GSH-Px含量均明显降低，MDA及TG含量明显增加（P<0.05）；使用柴芪汤及罗格列酮均可提高SOD、GSH-Px含量，及降低MDA、TG含量，105与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）；柴芪汤组与罗格列酮组比较可明显升高SOD及GSH-Px含量，有统计学差异（P<0.05）。见表2。表2各组大鼠肝脏SOD、MDA、GSH-Px及TG（xs）-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn组别nSOD（U/mgprot）MDAGSH-Px（U/mgprot）TG（mmol/L）（nmol/mgprot）正常组888.702.300.730.3977.157.291.360.80模型组851.716.31#3.090.30#21.526.50#2.760.25#柴芪汤组860.983.62*2.650.43*43.308.02*2.360.23*罗格列酮组856.274.15*※2.490.26*31.734.25*※2.400.43*注：与正常组比较#P<0.05，与模型组比较*P<0.05，与柴芪汤组比较※P<0.052.3各组大鼠肝脏组织观察结果110肉眼观察：正常组大鼠肝脏包膜光滑完整，表面颜色暗红，光润，柔嫩，边缘锐利，弹性好；模型组大鼠肝脏体积明显增大，呈棕黄色，包膜紧张，边缘钝，弹性减弱，切面油腻感；柴芪汤组和罗格列酮组肝脏较正常组偏大，但比模型组减小，部分颜色红润，切面无油腻感。见组图1。光镜下观察：正常组肝组织结构完整，肝细胞以中央静脉为中心向四周呈条索状、放射115状整齐排列，肝细胞分界清，肝小叶结构完整，肝窦排列规则，汇管区清晰。模型组大鼠肝细胞胞质内充满大量大小不等的圆形脂滴，肝小叶结构不清，肝索排列紊乱，大部分肝细胞呈脂肪变性。柴芪汤组大鼠肝细胞胞质内脂滴较少，肝索排列较正常，肝血窦扩张，肝细胞形态接近正常。罗格列酮组大鼠肝脏脂变程度介于模型组与柴芪汤组之间，肝细胞形态基本可见，肝细胞脂肪变性少见，可见点状炎性细胞浸润。见组图2。120正常组模型组柴芪汤组罗格列酮组图1肉眼观察大鼠肝组织-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn125正常组模型组柴芪汤组罗格列酮组图2光镜下观察大鼠肝组织（HE，×200）1303讨论3.1NAFLD中医病因病机根据其临床症状及体征，NAFLD应当属中医“肥胖”、“胁痛”、“肝癖”、“积聚”、“痰饮”等范畴，病因多由过食肥甘厚味，过逸少劳，情志失调等，发病机制主要为肝失疏泄，脾失健运，痰浊瘀血阻滞。饮食物的消化吸收有赖于肝疏泄和脾运化的功能正常，饮食135不节、过食肥甘厚味，劳逸失常或情志所伤，可损伤肝脾，而致肝失疏泄，气机阻滞，脾胃运化失健，水谷精微不化，停聚湿生痰，痰湿阻络，血行不畅，留而为淤，终致气、血、湿、痰互结于肝而成脂肪肝。故肝郁脾虚是NAFLD主要病理基础。柴芪汤组方：黄芪、柴胡、白术、枳实、三七粉。方中黄芪补中益气健脾为君药。柴胡疏肝解郁，调畅气机共为君药。白术健脾助运，“见肝之病，知肝传脾，当先实脾”，故实140脾以防肝乘为臣药。枳实理气解郁，与柴胡共同调畅肝脾气机，为佐药。三七化瘀止血活血为使药。此方补中有疏，调中有养，护脾治肝，使脾运复健，肝郁得疏，标本同治。3.2柴芪汤对血清肝功影响各组大鼠肝脏组织观察结果ALT和AST主要分布于肝及心肌细胞内，血清里含量较少，当肝细胞膜通透性增加或严重受损时ALT和AST被释放至血，血清ALT和AST水平升高[7]。因此，模型组大鼠经145喂养特殊饲料后发生肝脏脂肪病变时肝细胞膜通透性改变，大量细胞受损或坏死，导致血清ALT和AST水平升高。利用柴芪汤或罗格列酮干预后均可较模型组降低血清ALT及AST-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn含量，且血清中该两项指标与正常组比较无统计学差异，表示柴芪汤与罗格列酮有一定保护肝脏功能的作用，且效果相当。3.3柴芪汤对肝脏组织SOD、MDA、GSH-Px及TG影响150机体促氧化物和抗氧化物之间动态平衡失调导致的对细胞内大分子的氧化损伤称为氧化应激。当肝脏发生脂肪性病变时，各种致病因素导致脂质过氧化产物增多，以及肝脏抗氧[8]化能力失调。SOD是体内主要的自由基清除剂，主要作用是抵抗内、外环境中的超氧离子[9]损伤机体。SOD把超氧阴离子自由基歧化生成过氧化氢，体内的过氧化氢酶和GSH-Px[10]可以将过氧化氢转化为无毒性的水。GSH-Px可以起到保护细胞膜结构和功能完整以及恢155复肝内酶活性的作用。MDA是机体的一种产生自由基，攻击生物膜中不饱和脂肪酸而形成的脂质过氧化物，是脂质过氧化物的最终产物。综上，SOD的活力、GSH-Px含量是评价机体抗氧化和自由基清除能力的指标；而MDA是判断机体是否发生脂质过氧化程度，同时间接反映出肝细胞损伤的程度。模型组肝组织SOD及GSH-Px含量较正常组明显降低，MDA升高，符合NAFLD模型160肝脏存在脂质过氧化，且抗氧化及自由基清除能力下降。使用柴芪汤及罗格列酮均可提高NAFLD肝组织的抗氧化能力，两药物在降低MDA含量方面无明显差异，表明两药物均可改善组织的脂质过氧化程度，且在一定程度上保护脂肪病变对肝脏的损伤。在SOD及GSH-Px两指标上可发现两药物的不同之处，柴芪汤在提高SOD及GSH-Px水平的方面优于罗格列酮，差异具有统计学意义，表明中药柴芪汤更能够提高组织抗氧化及自由基清除能力。[11]165过量高脂饮食可使肝内TG堆积，引起肝组织脂肪变性。研究结果显示NAFLD患者[12]存在脂代谢紊乱，肝细胞内脂质代谢紊乱是引起TG大量沉积于肝脏的重要原因，TG是[13]肝细胞正常生理功能的必需物质之一，但当肝组织中沉积大量TG则会导致脂肪肝变性。本实验研究发现柴芪汤及罗格列酮均可改善TG在肝组织中的沉积，两者无统计学差异。4结论170本实验研究结果提示柴芪汤在调节NAFLD大鼠肝功及血脂的水平与罗格列酮作用效果相似，说明柴芪汤具有保肝、改善肝组织病理形态学的作用，并在对抗氧化应激的方面效果优于罗格列酮。综上，柴芪汤可改善模型大鼠氧化应激途径，从而起到防治NAFLD发生和发展的作用。[参考文献](References)175[1]李瑜元.非酒精性脂肪性肝病的研究进展[J].世界华人消化杂志，2013，02：109-115.[2]DeAlwisNM,DayCP.Nonalcoholicfattyliverdisease:themistgraduallyclears[J].Hepatol,2008,48(Suppl1):S104-S112.[3]范建高，贾继东，高鑫，等.非酒精性脂肪性肝病诊疗指南(2010年修订版)[J].中华内科杂志，2010，49（3）：189-191.180[4]黄英，李雪兰，蒋凤荣.白藜芦醇对非酒精性脂肪肝大鼠的作用机制研究[J].南京中医药大学学报，2011，27（4）：366.[5]FanJG,FarrellGC.Epidemiologyofnon-alcoholicfattyliverdiseaseinChina[J].Hepatol.2009,50:204-2l0.[6]FanJG,FarrellGC.Epidemiologyofnon-alcoholicfattyliverdiseaseinChina[J].Hepatol.2009,50:204-2l0.[7]张弛，刘瑛，李华珠，等.血清谷丙转氨酶在正常范围内对非酒精性脂肪性肝病的预测[J].世界华人消185化杂志，2011，19：841-844.[8]PessyareD,BersonA,FromentyB,etal.Mitochondriainsteatohepatitis[J].SeminLiverDis,2001,21:57.[9]ArgoCK,NorthupPG,Al-OsaimiAM,etal.Systematicreviewofriskfactorsforfibrosisprogressioninnon-alcoholicsteatohepatitis[J].Hepatol,2009,51:371-379.-6- 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