拟南芥丝裂原活化蛋白激酶MPK3MPK6参与调控ProPEPs基因的表达.pdf 6页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn拟南芥丝裂原活化蛋白激酶MPK3/MPK6#参与调控ProPEPs基因的表达**李森，徐娟5（浙江大学生命科学学院，杭州310058）摘要：机械性损伤是植物生存面临的重要威胁之一。在拟南芥中，植物激发子多肽Peps是植物受损部位产生的一类防御性物质，它们能增强植物的防御反应。目前，关于这些植物多肽的调控仍是未知。这里，我们阐明了丝裂原活化的蛋白激酶MPK3/MPK6参与调控Peps前10体ProPEPs的基因表达。在条件诱导性过表达激活MPK3/MPK6时，ProPEPs基因的表达明显上调，但MPK3或MPK6的功能缺失会不同程度地降低ProPEPs基因的表达。位于MPK3/MPK6下游的转录因子WRKY33参与调控ProPEPs基因的表达。WRK33的突变能降低葡萄孢菌诱导的ProPEPs基因表达。然而，Peps处理诱导的乙烯生成，则独立于MAPK级联途径。关键词：丝裂原活化的蛋白激酶；植物激发子多肽；转录因子15中图分类号：Q945Mitogen-activatedproteinkinasesMPK3andMPK6areinvolvedintheregulationofProPEPsgenesexpressioninArabidopsis20LiSen,XuJuan(CollegeofLifeSciences,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058)Abstract:Mechnicalinjuryarechallengingthreatsofplantsurvival.InArabidopsis,plantelicitorpeptides(Peps)areonekindofdefensepeptidesproducedinthewoundedplanttissues.Thesepeptidescanenhancetheplantdefenseresponses.However,theregulatorymechanismsofthese25peptidesremainunclear.Inthispaper,werevealedthatmitogen-activatedproteinkinasesMPK3/MPK6areinvolvedintheregulationofPepsprecursorsProPEPsgenesexpression.IntheconditionalinducedactivationofMPK3/MPK6system,theexpressionofProPEPsgenesarehighlyinduced.ThemutationofMPK3orMPK6reducestheexpressionofProPEPsgenes.WRKY33,atranscriptionfactordownstreamofMPK3/MPK6isalsoinvolvedintheexpression30ofProPEPsgenes.MutationofWRKY33cancompromisetheinducedexpressionofProPEPstriggeredbyBotrytiscinerea.Furthermore,wefoundthatPeps-inducedethyleneproductionisindependentofMPK3/MPK6cascade.Keywords:mitogen-activatedproteinkinase;plantelicitorpeptides;transcriptionfactor350引言丝裂原活化的蛋白激酶（MAPK）是真核生物中高度保守的信号通路之一，在细胞的生长、分化和应对胁迫反应中发挥重要作用。植物在受到外界环境刺激时，细胞内的MAPK信号通路被迅速激活，并将细胞表面感受到的信号传导到下游，从而启动一系列的生理反应，1-4来应对外界环境的变化。一个典型的MAPK级联途径通常包括三级激酶，即丝裂原活化40的蛋白激酶激酶激酶（MAPKKK）、丝裂原活化的蛋白激酶激酶（MAPKK）和丝裂原活化的蛋白激酶（MAPK）。最上游的MAPKKK通常在细胞感受到外界刺激后被激活，然后通过磷酸化下游的MAPKK保守结构域上的丝氨酸和苏氨酸来激活MAPKK。激活后的基金项目：教育部博士点专项科研基金新教师类项目(20130101120191)作者简介：李森，（1988年），男，博士研究生，植物细胞信号转导通信联系人：徐娟，（1984），女，副研究员，植物细胞信号转导.E-mail:xujuan@zju.edu.cn-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn5MAPKK进一步通过磷酸化MAPK上的苏氨酸和酪氨酸来激活MAPK。受激活的MAPK，在不同的外界刺激下，能够磷酸化不同的底物。目前已知的MAPK下游底物包括转录因子6-945WRKY33、WRKY34、ERF6和SPEECHLESS等。这些转录因子进而起始相关基因的表达，从而对外界刺激作出响应。植物，作为固着生物，常受到食草动物的咀嚼或外界的机械性损伤。已知在植物受损伤10-11的部位，产生一类被称作伤害相关的分子模式（DAMPs）的植物激发子多肽（Peps）。这类多肽能被位于细胞膜表面的模式识别受体（PatternRecognitionReceptors）PEPR1和12-1350PEPR2所识别。在拟南芥中，这类多肽有八个家族成员。其中Pep1、Pep2和Pep3参14-16与放大植物的免疫反应，能够增强植物的抗病性。在玉米中也发现了Pep1的同源基因，17并且同样以增强植物免疫反应，说明了这类多肽在物种间的功能保守性。然而，关于这18-19些多肽的调控，鲜有报道。此外，Peps的处理能够诱导植物激素乙烯的合成，但关于其调控则并不清楚。而MAPK级联途径在转录和翻译后修饰双重水平上调控病原菌葡萄孢菌20-2255诱导的乙烯生成。本研究以拟南芥（Arabidopsisthaliana）为对象，利用功能缺失性和功能获得性材料，通过定量PCR发现丝裂原活化的蛋白激酶MPK3/MPK6参与调控Peps前体基因ProPEPs的表达。WRKY33，位于MPK3/MPK6下游的转录因子，也参与调控葡萄孢菌侵染诱导的ProPEPs基因表达。但Peps处理诱导的乙烯生成，则独立于MAPK级联途径，说明MAPK级联并不参与Peps处理诱导的乙烯合成。601材料与方法1.1实验材料拟南芥（Arabidopsisthaliana）所有植株背景均为Col-0，突变体从美国拟南芥生物资源o中心（ABRC）订购，并鉴定出纯合株系。种子经表面灭菌后，在4C春化3-4天，然后播种在含有50mL1/2MurashigeSkoog液体培养基的培养皿中，放在Percival光照培养箱生长。o-2-165培养条件：温度23C；光照24小时连续光照；光照强度为70µmolS。培养6天后，将小苗转移到20-mL的透明气相色谱瓶中，每瓶6mL液体培养基，10颗小苗，继续培养6天。1.2实验方法葡萄孢菌的培养及处理：葡萄孢菌（Botrytiscinerea）的孢子悬浊液在PDA（Potato70DextroseAgar）培养基上培养12天后，用无菌水将孢子收集起来。通过血球计数板计算出5孢子浓度，然后每瓶样品中加入4.0×10个孢子。在不同的时间点取样，在液氮中速冻，然o后将样品贮藏在-80C冰箱。DDDD地塞米松的处理：在液体培养基中生长12天的拟南芥幼苗NtMEK2,NtMEK2/mpk3DD和NtMEK2/mpk6，加入地塞米松（Dex）处理，终浓度为1µM。然后在各时间点取样，o75在液氮中速冻，然后贮藏于-80C。RNA的提取，反转录和定量PCR：根据TRIzol生产商Invitrogen的产品说明指导，提取样品的总RNA。然后，1µg的总RNA用于反转录。反转录后的cDNA稀释20倍，然后-ΔΔCt用作定量PCR的模板。定量PCR结果用2进行分析。乙烯的测定：在液体培养基生长12-天的拟南芥幼苗，用30nM（终浓度）的Pep1、Pep280和Pep3处理，相同浓度的flg22用作对照。然后换上带上硅胶垫的帽子，放置在相同条件下生长。分别在3h,6h,12h和24h时，用气相色谱（岛津GC-2014）测定乙烯含量。-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn2结果与分析2.1丝裂原活化的蛋白激酶MPK3/MPK6参与调控ProPEPs基因的表达在拟南芥中，MPK3/MPK6可被上游激酶MKK4/MKK5激活。MKK4/MKK5的烟草85同源基因是NtMEK2。通过定点突变，将NtMEK2蛋白上的激活结构域上的丝氨酸（S）和苏氨酸（T）突变为酸性氨基酸天冬氨酸（D），从而使NtMEK2具有组成性激酶活性。然DD后将突变后的NtMEK2（简写为NtMEK2）置于诱导性表达系统下，这样只有在加入糖皮DDDD质激素地塞米松时才能诱导NtMEK2的表达。在加入地塞米松后，NtMEK2诱导表达，DD并激活下游的MPK3/MPK6。结果发现，在NtMEK2拟南芥转基因植物中，ProPEP1、90ProPEP2和ProPEP3基因的表达均上调（图1）。其中，ProPEP2和ProPEP3基因的表达DDDD有非常明显的升高。但当MPK3或MPK6功能缺失后，在NtMEK2/mpk3和NtMEK2/mpk6植物中，ProPEP1、ProPEP2和ProPEP3基因的诱导表达出现不同程度的降低（图1）。这些结果充分说明，MPK3和MPK6的激活能上调ProPEPs基因的表达。95图1.MPK3和MPK6激活诱导ProPEP1、ProPEP2和ProPEP3基因的表达。生长在液体培养基中12-天的DDDDDD拟南芥NtMEK2、NtMEK2/mpk3和NtMEK2/mpk6幼苗，加入终浓度为1µM的地塞米松，然后在各时间点取样，提取总RNA，并进行定量PCR来分析ProPEPs基因的表达。1002.2转录因子WRKY33参与调控葡萄孢菌诱导的ProPEPs基因的诱导表达鉴于转录因子WRKY33参与植物的抗病性，且位于MPK3/MPK6的下游，接着分析了在葡萄孢菌感染的拟南芥野生型Col-0和wrky33-1，wrky33-2突变体中，ProPEPs基因的表达情况。结果发现，葡萄孢菌的浸染，能显著地上调ProPEPs基因的表达。在wrky33105突变体中，葡萄孢菌的侵染诱导的ProPEPs基因的诱导表达，明显要低于野生型（图2）。结果说明WRKY33的功能缺失，在一定程度上，降低了病原菌侵染引起的ProPEPs基因的诱导表达。-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn110图2.WRKY33的功能缺失降低了葡萄孢菌诱导的ProPEPs基因的诱导表达。生长在液体培养基中的125天的拟南芥Col-0、wrky33-1和wrky33-2幼苗，每瓶样品中加入4.0×10个葡萄孢菌孢子，来侵染幼苗。然后在各个时间点取样，提取样品的总RNA，并进行定量PCR来分析ProPEPs基因的表达。1152.3Peps处理诱导的乙烯生成，独立于MAPK级联途径。Peps处理可诱导植物产生乙烯，MPK3/MPK6激活也可以诱导乙烯合成。MPK3/MPK6激活同时可诱导ProPEPs基因的表达。那么Peps处理诱导的乙烯合成是否依赖MPK3/MPK6信号途径呢？我们发现在mpk3和mpk6单突变体中，Peps处理诱导的乙烯合成，与野生型相比，并无明显差异（图3）。MPK3和MPK6具有高度功能冗余，但是mpk3mpk6双突变120体是胚胎致死的。我们实验室利用化学遗传学方法设计了双突材料MPK6SR（基因型为mpk3YG23mpk6PMPK6MPK6）。当用激酶抑制剂NA-PP1处理时，该材料即相当于双突变体。我们加入激酶抑制剂NA-PP1或对照DMSO预处理30分钟后，再用Peps处理。结果，mpk3mpk6双突材料MPK6SR中乙烯的生成量与对照组DMSO相比，并无明显差异（图4）。相同处理的MPK6SR材料与野生型相比，乙烯合成量也无明显差异。说明MPK3/MPK6并不参与125Peps处理诱导的乙烯生成。-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn130图3.Pep1、Pep2、Pep3和flg22处理诱导的乙烯生成在mpk3和mpk6单突变体中没有减少。生长在液体培养基中的12天的拟南芥Col-0，mpk3和mpk6幼苗，分别加入终浓度为30nM的Pep1,Pep2,Pep3和flg22。然后换上有硅胶垫的帽子，并旋紧帽子。在各个时间点，用岛津气相色谱GC-2014测定乙烯的生成量。135图4Pep1、Pep2、Pep3和flg22处理诱导的乙烯，但独立于MPK3/MPK6级联途径。在12天的拟南芥幼苗的生长培养基中加入等体积的DMSO和NA-PP1（终浓度为1µM），预处理30分钟后，分别加入终浓度为30nM的Peps和flg22来诱导乙烯的生成，然后在各个时间点测定乙烯的生成量。在野生型Col-0和mpk3140mpk6双突材料MPK6SR中，诱导的乙烯生成量并无明显差异。3结论拟南芥中的Peps在植物的抗病反应中，发挥着重要的作用。我们利用MAPK的功能获得性和功能缺失性材料，阐明了MPK3/MPK6信号途径参与调控ProPEPs基因的表达。145MPK3/MPK6的激活，能显著诱导ProPEPs基因的表达。MPK3/MPK6下游的转录因子-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnWRKY33，参与葡萄孢菌侵染诱导的ProPEPs基因表达。该结果对进一步了解Peps的表达调控具有重要意义。[参考文献](References)150[1]WidmannC,GibsonS,JarpeMB,JohnsonGL.Mitogen-activatedproteinkinaseconservationofathreekinasemodulefromyeasttohuman[J].PhysiologicalReviews,1999,79:143-180.[2]ChangL,KarinM.MammalianMAPkinasesignallingcascades[J].Nature,2001,410:37-40.[3]NakagamiH,PitzschkeA,HirtH.EmergingMAPkinasepathwaysinplantstresssignalling[J].TrendsinPlantScience,2005,10:339-346.155[4]XuJ,ZhangS.Mitogen-activatedproteinkinasecascadesinsignalingplantgrowthanddevelopment[J].TrendsinPlantScience,2015,20:56-64.[5]RodriguezMC,PetersenM,MundyJ.Mitogen-activatedproteinkinasesignalinginplants[J].AnnualReviewofPlantBiology,2010,61:621-649.[6]MaoG,MengX,LiuY,ZhengZ,ChenZ,ZhangS.PhosphorylationofaWRKYtranscriptionfactorbytwo160pathogen-responsiveMAPKdrivesphytoalexinbiosynthesisinArabidopsis[J].ThePlantCell,2011,23:1639-1653.[7]GuanY,MengX,KhannaR,LaMontagneE,LiuY,ZhangS.PhosphorylationofaWRKYtranscriptionfactorbyMAPKisrequiredforpollendevelopmentandfunctioninArabidopsis[J].PLoSGenetics,2014,10:e1004384.[8]MengX,XuJ,HeY,YangKY,MordorskiB,LiuY,ZhangS.PhosphorylationofanERFtranscriptionfactor165byArabidopsisMPK3/MPK6regulatesplantdefensegeneinductionandfungalresistance[J].ThePlantCell,2013,25:1126-1142.[9]LampardGR,MacAlisterCA,BergmannDC.ArabidopsisstomatalinitiationiscontrolledbyMAPKmediatedregulationofthebHLHSPEECHLESS[J].Science,2008,322:1113-1116.[10]YamaguchiY,HuffakerA.Endogenouspeptideelicitorsinhigherplants[J].CurrentOpinioninPlant170Biology,2011,14:351-357.[11]HuffakerA,PearceG,RyanCA.AnendogenouspeptidesignalinArabidopsisactivatescomponentsoftheinnateimmuneresponse[J].ProceedingsofNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2006,106:8067-8072.[12]YamaguchiY,PearceG,RyanCA.Thecellsurfaceleucine-richrepeatreceptorforAtPep1,anendogenous175peptideelicitorinArabidopsis,isfunctionalintransgenictobaccocells[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2006,103:10104-10109.[13]YamaguchiY,HuffakerA,BryanAC,TaxFE,RyanCA.PEPR2isasecondreceptorforthePep1andPep2peptidesandcontributestodefenseresponsesinArabidopsis[J].ThePlantCell,2010,22:508-522.[14]HuffakerA,PearceG,RyanCA.AnendogenouspeptidesignalinArabidopsisactivatescomponentsofthe180innateimmuneresponse[J].ProceedingsofNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2006,103:10098-10103.[15]HuffakerA,PearceG,VeyratN,ErbM,TurlingsTCJ,SartorR,ShenZ,BriggsSP,VaughanMM,AlbornHT,TealPEA,SchmelzEA.Plantelicitorpeptidesareconservedsignalsregulatingdirectandindirectantiherbivoredefense[J].ProceedingsofNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2013,185110:5707-5712.[16]HuffakerA,RyanCA.EndogenouspeptidedefnsesignalsinArabidopsisdifferentiallyamplifysignalingfortheinnateimmuneresponse[J].ProceedingsofNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2007,104:10732-10736.[17]HuffekerA,DafoeNJ,SchmelzEA.ZmPep1,anorthologofArabidopsiselicitorpeptide1,regulatesmaize190innateimmunityandenhancesdiseaseresistance[J].PlantPhysiology,2011,155:1325-1338.[18]BartelsS,LoriM,MbengueM,vanVerkM,KlauserD,HanderT,BoniR,RobatzekS,BollerT.ThefamilyofPepsandtheirprecursorsinArabidopsisdifferentialexpressionandlocalizationbutsimilarinductionofpattern-triggeredimmuneresponse[J].JournalofExperimentalBotany,2013,64:5309-5321.[19]FluryP,KlauserD,SchulzeB,BollerTandBartelsS.Theanticipationofdanger:Microbe-associated195molecularpatternperceptionenhancesAtPep-triggeredoxidativeburst[J].PlantPhysiology,2013,161:2023-2035.[20]LiuY,ZhangS.Phosphorylationof1-aminocyclopropane-1-carboxylicacidsynthasebyMPK6,astress-responsivemitogen-activatedproteinkinase,inducesethylenebiosynthesisinArabidopsis[J].ThePlantCell,2004,16:3386-3399.200[21]HanL,LiG,YangKY,MaoG,WangR,LiuY,ZhangS.Mitogen-activatedproteinkinase3and6regulateBotrytiscinerea-inducedethyleneproductioninArabidopsis[J].PlantJournal,2010,64:114-127.[22]LiG,MengX,WangR,MaoG,HanL,LiuY,ZhangS.Dual-levelregulationofACCsynthaseactivitybyMPK3/MPK6cascadeanditsdownstreamWRKYtranscriptionfactorduringethyleneinductioninArabidopsis[J].PLoSGenetics,2012,8(6):e1002767.205[23]XuJ,XieJ,YanC,ZouX,RenD,ZhangS.AchemicalgeneticapproachdemonstratesthatMPK3/MPK6activationandNADPHoxidase-mediatedoxidativeburstaretwoindependentsignalingeventsinplantimmunity[J].ThePlantJournal,2014,77:222-234.-6-'