日本血吸虫成虫可溶性抗原（SWAP）及虫卵可溶性抗原（SEA）对LX2细胞影响的比较研究.pdf 6页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn日本血吸虫成虫可溶性抗原（SWAP）及虫卵可溶性抗原（SEA）对LX2细胞影响的比#较研究1,21,21,21,21,2**5王立富，余子龙，解辉，吴忠道，孙希（1.中山大学中山医学院寄生虫学教研室,广州510080；2.教育部热带病防治重点实验室，广州510080）摘要：目的：通过用SWAP和SEA刺激LX2细胞，分析比较SWAP、SEA对人肝星状细10胞（LX2）的影响，从而探究日本血吸虫感染所致肝纤维化的发病机理。方法：利用SWAP、SWAP+TGF-β、SEA、SEA+TGF-β、TGF-β分别刺激LX2细胞，荧光定量PCR（q-PCR）检测与星状细胞活化相关的重要基因αSMA、Col1a1、CTGF、PPARγ、MMP9、MMP2、CCL2表达情况。结果：SWAP刺激LX2细胞后αSMA、Col1a1、CTGF升高，与TGF-β具有协同作用；而SEA刺激LX2细胞后αSMA、Col1a1、CTGF下降，MMP9、CCL2升高，15并且抑制TGF-β对LX2细胞的作用。结论：SWAP具有促进肝纤维化、基质重建的作用；而SEA具有抑制肝纤维化、基质重建和调节炎症介质的作用。为阐明日本血吸虫感染所致肝纤维化的发生发展机制提供了理论基础。关键词：日本血吸虫；SWAP；SEA；LX2细胞；纤维化；基质重建；炎症介质中图分类号：R188.1120ComparingtheeffectsofSchistosomajaponicumsolublewormantigenicpreparations(SWAP)andsolublewormantigen(SEA)onhepaticstellatecells1,21,21,21,21,2WANGLifu,YUZilong,XIEHui,WUZhongdao,SUNXi25(1.DepartmentofParasitology,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080;2.KeyLaboratoryofTropicalDiseasesandControloftheMinistryofEducation,Guangzhou510080)Abstract:Objective:ComparingthetheeffectsofSWAPandSEAonLX2cellstoinvestigatethe30mechanismofhepaticfibrosiswheninfectedbySchistosomajaponicum.Methods:TreatingLX2cellswithSWAP,SWAP+TGF-β,SEA,SEA+TGF-β,TGF-βandtheLX2cellsactivationrelatedgenes(αSMA,Col1a1,CTGF,PPARγ,MMP9,MMP2,CCL2)wereinvestigatedbysemiquantificationreal-timepolymerasechainreaction.Results:SWAPtreatmentofLX2cellsresultedinincreasesintheexpressionofαSMA,Col1a1,CTGFandhassynergisticeffectwithsynergisticeffect,whiletreating35withSEAresultedindecreasesintheexpressionofαSMA,Col1a1,CTGFandincreasesinMMP9、CCL2,andSEAcaninhibittheeffectofTGF-β.Conclusion:SWAPhastheeffectsofpromotinghepaticfibrosisandmatrixremodelling,whileSEAcanhepaticfibrosis,matrixremodellingandregulateinflammatorymediator.Thisresultsprovidetheoreticalbasistoillustratethedevelopmentofhepaticfibrosisinducedbyschistosomajaponicuminfection.40Keywords:Schistosomajaponicum；SWAP；SEA；LX2cells；fibrosis；matrixremodelling；inflammatorymediator基金项目：博士点基金（No20120171120049）；863项目（No2015AA020934）；国家自然科学基金（No81201309）；广东省自然科学基金（NoS2012040007256）作者简介：王立富（1988－），男，在读研究生，主要研究方向:寄生虫感染与免疫通信联系人：孙希（1983－），女，博士，副教授，主要研究方向:寄生虫感染与免疫.E-mail:sunxi2@mail.sysu.edu.cn-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn0引言血吸虫病，是由血吸虫感染引起，严重危害人类健康和社会经济发展，容易忽略的热带[1][2-3]45病。据统计有超过2.3亿人感染血吸虫，超过8亿人面临血吸虫感染的威胁。日本血吸虫病仍然是我国重要的公共卫生问题之一。据统计，2014年全国仍有血吸虫病人11.6万例，至今累计晚期血吸虫病人高达30880例，每年仍然有新发晚期日本血吸虫病病人报告，[4-5]因此消除血吸虫病防治依然严峻。日本血吸虫是我国血吸虫病的病原体，其生活史复杂，有多个发育阶段，尾蚴是其感50染阶段，成虫寄生在人体的门脉系统。成虫、虫卵、尾蚴、童虫等阶段均可对人体产生不同程度的损伤和复杂的免疫病理反应，其中最为严重的是肝肠组织的虫卵肉芽肿，以及其发展[6-7]引起的的纤维化和肝硬化。肝纤维化最终引起肝血流阻塞，导致门脉高压，脾肿大，门脉分流，腹水，胃肠道静脉曲张，胃肠道出血和死亡，对患者造成不可逆的病理损害，严重危害患者健康和生命。55近年来对血吸虫感染造成的肝纤维化的研究与有了大的进展。在日本血吸虫和曼氏血吸[8-9]虫感染造成的肝纤维化过程中，肝星状细胞起到了重要的作用。肝星状细胞激活后，产生应力纤维，尤其是α平滑肌肌动蛋白（αSMA），同时高表达胶原Col1a1，结缔组织生长[10]因子（CTGF）。研究证实转化生长因子-β（TGF-β）与肝纤维化密切相关，其可以激活肝星状细胞。肝星状细胞PPARγ的表达导致细胞处于静止状态，免于产生应力纤维，同时[10]60增加脂滴沉积。基质金属蛋白酶MMP9、MMP2可以降解胶原，起到重要的基质重建和抗纤维化作用。CCL2在虫卵肉芽肿的形成、炎症发展和基质重建中具有重要作用。本研究以LX2细胞株作为肝星状细胞模型，探究日本血吸虫成虫SWAP和SEA刺激对LX2细胞株的影响，阐明在日本血吸虫感染过程中，肝纤维化发生发展机制。1材料与方法651.1材料1.1.1细胞、SWAP、SEALX2细胞株购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。SWAP制备于日本血吸虫成虫，PBS冲洗三次，置于十字研磨器中（400μlPBS+4μl100mMPMSF），冰上研磨，超声（超1S停2S，75%功率，3minx5次），离心收上清，0.22μm滤器过滤，BCA测浓度。70SEA购自江西省寄生虫研究生所。1.1.2试剂DMEM高糖培养液购自GIBCO公司;胎牛血清FBS购自浙江天杭生物科技有限公司;双抗购自GIBCO公司；TGF-β购自peprotech公司;TRIzolRReagent购自Invitrogeng公司;逆转录试剂盒购自Invitrogeng公司；q-PCRmix（SYBR®PremixExTaqTMⅡ）购自TaKaRa75公司。-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn1.2方法1.2.1细胞培养将冻存肝星状细胞（LX2细胞株）置于37℃水浴锅中快速复温直至完全融化,迅速接种细胞于10%FBS的DMEM(100U含青霉素+100mg/ml链霉素)培养基中,在37℃、5080ml/LCO2及饱和湿度的培养箱中培养.采用0.25%胰蛋白酶消化传代,待细胞生长稳定后进行实验。1.2.2细胞刺激5将生长稳定的细胞接种于12孔板（1x10/孔），培养24h，细胞贴壁完全后开始刺激。分组情况为Control组、SWAP刺激组、SWAP+TGF-β刺激组、SEA刺激组、SEA+TGF-β85刺激组、TGF-β刺激组，每组3个重复。刺激浓度为SWAP10μg/ml，SEA10μg/ml，TGF-β5ng/ml。刺激48h。1.2.3收集细胞提取RNA，进行逆转录刺激48h后，分别吸去培养基，PBS洗三次，每孔加入1mlTRIzolReagent,室温静置5min，轻轻吹打，将贴壁细胞全部吹打至TRIzolReagent中，提取每组RNA，计算RNA纯90度及浓度，依照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA。1.2.4q-PCR检测LX2纤维化、基质重建、炎症介质相关基因的表达水平按SYBR®PremixExTaqTMⅡ说明书进行实时荧光定量PCR检测纤维化、基质重建、炎症介质相关基因的表达水平。内参为β-actin，上游：CTGGCACCACACCTTCTACAATG，下游：CTGGCACCACACCTTCTACAATG。纤维化、基质重建、炎症介质相关基因引物如95下，αSMA上游：CCAGGGCTGTTTTCCCATCC，下游：GCTCTGTGCTTCGTCACCCA；Col1a1上游：GAACGCGTGTCATCCCTTGT，下游：GAACGAGGTAGTCTTTCAGCAACA；CTGF上游：AATGCTGCGAGGAGTGGGT，下游：CGGCTCTAATCATAGTTGGGTCT；PPARγ上游：GCTGTGCAGGAGATCACAGA，下游：GGGCTCCATAAAGTCACCAA；MMP9上游：CCACCCTTGTGCTCTTCCCTG，下游：TCTGCCACCCGAGTGTAACCA；100CCL2上游：GATCTCAGTGCAGAGGCTCG，下游：TGCTTGTCCAGGTGGTCCAT；MMP2上游：AACTACAACTTCTTCCCTCGCAA，下游：CAAAGGCATCATCCACTGTCTCT。采用Roche公司的LightCycler480System实时荧光定量PCR仪进行检测,设定反应条件如下:95℃30s;95℃5s，60℃20s,40个循环;65℃15s。2结果1052.1SWAP、SEA对LX2细胞纤维化的影响用SWAP、SWAP+TGF-β、SEA、SEA+TGF-β、TGF-β分别刺激LX2细胞，48h后，检测αSMA、Col1a1基因的表达水平。LX2细胞经SWAP刺激后αSMA基因的表达水平与Control组相比升高，相反，LX2细胞经SEA刺激后αSMA基因的表达水平与Control组相比显著降低（图1A）。TGF-β单独刺激LX2细胞后，TGF-β显著增高；TGF-β刺激110LX2细胞的同时加入SWAP刺激，αSMA基因的表达水平依然显著增高；TGF-β刺激LX2-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn细胞的同时加入SEA刺激，αSMA基因的表达水平显著降低（图1A）。SWAP组、SWAP+TGF-β组、TGF-β组Col1a1基因的表达水平成上升趋势，而SEA组、SEA+TGF-β组Col1a1明显下调（图1B）。另外，我们检测了SWAP、SWAP+TGF-β、SEA、SEA+TGF-β、TGF-β刺激LX2细胞后CTGF和PPARγ（LX2细胞静止标志），发现SWAP组、115SWAP+TGF-β、组TGF-β组CTGF明显上调，SEA组CTGF下调，并且SEA具有下调TGF-β对CTGF的作用（图2A）。而SWAP、SEA、TGF-β刺激对LX2细胞PPARγ基因表达水平的作用不明显（图2B）。这些结果表明，SWAP能够促进LX2细胞的纤维化，并对TGF-β的促纤维化具有协同作用；相反SEA抑制LX2细胞纤维化的发生，并抑制TGF-β的促纤维化具作用。120图1q-PCR检测肝星状细胞（LX2）经SWAP、SWAP+TGF-β、SEA、SEA+TGF-β、TGF-β刺激后αSMA和Col1a1表达水平。Fig.1LX2cellswastreatedwithSWAP,SWAP+TGF-β,SEA,SEA+TGF-β,TGF-βandtheαSMAandCol1a1wereinvestigatedbyq-PCR.125图2q-PCR检测肝星状细胞（LX2）经SWAP、SWAP+TGF-β、SEA、SEA+TGF-β、TGF-β刺激后CTGF和PPARγ表达水平。Fig.2LX2cellswastreatedwithSWAP,SWAP+TGF-β,SEA,SEA+TGF-β,TGF-βandtheCTGFandPPARγ130wereinvestigatedbyq-PCR.-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn2.2SWAP、SEA对LX2细胞基质重建、炎症介质的影响为了检测SWAP、SWAP+TGF-β、SEA、SEA+TGF-β、TGF-β刺激对LX2细胞基质重建及炎症介质的影响，我们检测了MMP9、MMP2、CCL2基因的表达水平。研究结果提135示，TGF-β刺激后SWAP组、SWAP+TGF-β组、TGF-β组MMP9基因的表达水平呈下降趋势，而SEA组、SEA+TGF-β组MMP9明显下调（图3A）。而SWAP、SEA、TGF-β刺激对LX2细胞MMP2基因表达水平的作用不明显（图3B）。另外，通过检测CCL2基因的表达水平发现SEA具有显著上调LX2细胞CCL2基因表达的作用，而SWAP、TGF-β刺激对LX2细胞CCL2基因的表达影响不明显（图3C），提示肝星状细胞在虫卵肉芽肿形成140中通过CCL2募集炎症细胞。这些结果显示，与SWAP相比，SEA抑制肝星状细胞细胞基质重建，并具有炎症调节作用。图3q-PCR检测肝星状细胞（LX2）经SWAP、SWAP+TGF-β、SEA、SEA+TGF-β、TGF-β刺激后MMP9、MMP2和CCL2表达水平。145Fig.3LX2cellswastreatedwithSWAP,SWAP+TGF-β,SEA,SEA+TGF-β,TGF-βandtheMMP9、MMP2andCCL2wereinvestigatedbyq-PCR.3讨论在日本血吸虫感染过程中，成虫可以寄生于肝门静脉和肠系膜静脉并产卵，虫卵随血流入肝，沉积于肝脏，形成虫卵肉芽肿；另一方面，成虫产生的代谢产物，分泌、排泄、和更150新脱落的表膜也可以随血流入肝，对肝脏造成损伤。因此，成虫和虫卵均可对人体产生不同程度的损伤和复杂的免疫病理反应，其中最为严重的是肝肠组织的虫卵肉芽肿，以及其发展引起的的纤维化和肝硬化。肝纤维化是慢性肝损伤时机体产生的一种损伤修复反应,与肝硬化是同一疾病的不同阶段。有肝细胞的凋亡、间充质干细胞的增殖及细胞外基质的沉积三个步骤.而肝星状细胞正是细胞外基质的主要来源,他可通过调控总细胞数及每个细胞的胞外155基质分泌量来实现肝纤维化.因此抑制肝星状细胞的增殖及其胞外基质分泌量从而进行抗肝纤维化。肝星状细胞激活后，产生纤维化表型，以高表达αSMA、胶原Col1a1为主，同时高表达CTGF。肝星状细胞PPARγ的表达导致细胞处于静止状态，免于产生应力纤维，增加脂滴沉积。肝星状细胞基质金属蛋白酶MMP9、MMP2可以降解胶原，起到重要的基质重建160和抗纤维化作用。同时CCL2在虫卵肉芽肿的形成、炎症发展和基质重建中具有重要作用。本研究以LX2细胞株作为肝星状细胞模型，探究日本血吸虫SWAP和SEA刺激对LX2细胞株的影响。用SWAP、SWAP+TGF-β、SEA、SEA+TGF-β、TGF-β分别刺激LX2细胞48h后检测αSMA、Col1a1、CTGF、PPARγ、MMP9、MMP2、CCL2，研究发现SWAP刺-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn激LX2细胞后αSMA、Col1a1、CTGF升高，与TGF-β具有协同作用；而SEA刺激LX2165细胞后αSMA、Col1a1、CTGF下降，MMP9、CCL2升高，并且抑制TGF-β对LX2细胞的作用。这些结果表明，SWAP具有促进肝纤维化、基质重建的作用；而SEA具有抑制肝纤维化、基质重建和调节炎症介质的作用。为阐明在日本血吸虫感染过程中肝纤维化的发生发展机制提供了理论基础。170[参考文献](References)[1]ColleyDG,BustinduyAL,SecorWE,etal.Humanschistosomiasis[J].Lancet,2014,383(9936)：2253-2264.[2]VosT,FlaxmanAD,NaghaviM,etal.Yearslivedwithdisability(YLDs)for1160sequelaeof289diseasesandinjuries1990-2010:asystematicanalysisfortheGlobalBurdenofDiseaseStudy2010[J].Lancet,2012,380(9859):2163-2196.175[3]KingCH.Parasitesandpoverty:thecaseofschistosomiasis[J].ActaTrop,2010,113(2):95-104.[4]雷正龙等,2014年全国血吸虫病疫情通报.中国血吸虫病防治杂志,2015(06):第563-569页.[5]Wang,Q.P.,etal.,Humanangiostrongyliasis[J].LancetInfectDis,2008.8(10):621-630.[6]LewisFA,TuckerMS.Schistosomiasis[J].AdvExpMedBiol,2014,766:47-75.[7]urkeML,JonesMK,GobertGN,etal.Immunopathogenesisofhumanschistosomiasis.ParasiteImmunol,1802009,31:163-176.[8]BartleyPB,RammGA,JonesMK,etal.AcontributoryroleforactivatedhepaticstellatecellsinthedynamicsofSchistosomajaponicumegg-inducedfibrosis.IntJParasitol,2006,36:993-1001.[9]ChangD,RamalhoLN,RamalhoFS,etal.Hepaticstellatecellsinhumanschistosomiasismansoni:acomparativeimmunohistochemicalstudywithlivercirrhosis.ActaTrop,2006,97:318-323.185[10]AnthonyB,MathiesonW,deCastro-BorgesW,etal.Schistosomamansoni:egg-induceddownregulationofhepaticstellatecellactivationandfibrogenesis.ExpParasitol,2010,124:409-420.-6-'