小鼠体内硒对甲基汞毒性拮抗作用机制研究.pdf 11页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn小鼠体内硒对甲基汞毒性拮抗作用机制研#究**李玄，赵璐，张弛，王锐5（同济大学环境科学与工程学院污染控制与资源化研究国家重点实验室，上海200092）摘要：汞污染是影响全球的重大环境问题之一，由于汞（尤其是甲基汞）具有高生物累积性及不可降解的特点，受汞污染地区的生物所面临的健康风险将长期存在。硒作为生物的必需元素，已被广泛证实可以拮抗汞的毒性效应，然而其具体作用机制仍不明晰。本文选用Balb/c10小白鼠作为受试生物，设计甲基汞单一暴露及硒-甲基汞共暴露条件下的生物累积及排出实验，从个体水平（生物累积与组织分布）及分子水平（免疫器官的氧化/抗氧化平衡）两个层面初步揭示小鼠体内硒对甲基汞的解毒机制。实验发现，富硒食物的添加可促进小鼠体内甲基汞的排出过程，显著影响小鼠体内甲基汞的分布，并降低靶器官（如免疫器官）中甲基汞的含量。此外，甲基汞暴露诱导了小鼠免疫器官（脾脏和胸腺）活性氧自由基（ROS）的15累积，降低了抗氧化能力，而食物硒的摄入则可帮助恢复免疫器官中的氧化还原平衡状态，从而消除汞毒性导致的细胞氧化损伤（脂质过氧化和蛋白氧化）和细胞凋亡。关键词：甲基汞；硒；拮抗作用；生物累积；毒性中图分类号：X17120Investigatingthepossiblemechanismsunderlyingtheprotectiveeffectsofseleniumonmethylmercury-inducedtoxicityinmiceLIXuan,ZHAOLu,ZHANGChi,WANGRui(StateKeyLaboratoryofPollutionControlandResourceReuse,CollegeofEnvironmental25ScienceandEngineering,TongjiUniversity200092)Abstract:Mercury(Hg)pollutionisoneofthemostimportantenvironmentalproblemsworldwide.ThepotentialhealthrisksposedbyHgexposurealwaysexistforalongtime,sinceHg(especiallymethylmercury,MeHg)couldnotbedegradedandcouldbeeasilyaccumulatedinbiota.Asanessentialelement,selenium(Se)hasbeenwidelyverifiedtoprotectagainstHg-inducedtoxicity,30however,theunderlyingmechanismisstillunclear.Inthepresentstudy,weconductedaseriesofbioaccumulationandeliminationexperimentsunderMeHgandSe-MeHgco-exposureconditions,usingBalb/cmiceasmodelorganism,tryingtoexplorethepossiblemechanismunderlyingtheprotectiveeffectsofseleniumagainstMeHg-inducedtoxicityfrombothindividuallevel(bioaccumulationanddistribution)andmolecularlevel(theoxidative/antioxidativebalanceinimmune35organs).Ourresultsrevealedthat,dietarySesupplementationpromotedtheeliminationofMeHginmice,significantlyalteredtheMeHgdistributioninmicetissues,reducedtheMeHgburdeninthepotentialtoxicitytargetorgans(suchasimmuneorgans)ofmice.Besides,MeHgexposurepromotedthegenerationofthereactiveoxygenspecies(ROS),reducedthelevelsofantioxidantsinimmuneorgans(thymusandspleen),whiledietarySeadministrationrecoveredtheoxidative/antioxidative40balanceinimmuneorgansanddiminishedthecellulardysfunctions(lipidperoxidationandproteinoxidation)andsubsequentapoptosis.Keywords:methylmercury;selenium;antagonisticeffect;accumulation;toxicity45基金项目：教育部高等学校博士点专项科研基金(项目号：20130072120031)作者简介：李玄(1987-)，女，博士，研究方向：污染物生态毒理学通信联系人：王锐(1986-)，女，副教授，硕导，主要研究方向：污染物生态毒理学.E-mail:wangr@tongji.edu.cn-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn0引言汞污染是影响全球的重大环境问题之一，环境中大量存在的无机汞可以通过生物与非生[1]物转化为毒性更强的甲基汞(MeHg)，甲基汞极易被生物吸收却难以被排出，可在生物体内累积到很高浓度并随食物链逐级放大，带来长期的生态与健康风险。硒作为生物体的一种微[2]50量必需元素，具有重要的生物化学功能，且已被证实可以拮抗汞的毒性效应等，然而目前关于硒-汞拮抗效应还缺乏系统研究，其拮抗作用机制仍然存在较多争论。关于硒-汞拮抗效应的机理目前存在两个方面的假说。一方面，硒可能通过改变汞在生[3]物体内的累积和分布从而拮抗汞的毒性。有研究表明通过硒与汞的共暴露，硒可以降低汞[4-5]在生物体内（如小鼠和斑马鱼）毒性靶器官中的累积，还有研究发现硒可以促进汞从生[6-7][8]55物体(如鱼体和虾)排出，富硒酵母片的食用也可以提高汞污染人群尿液中的汞含量。另一方面，硒-汞拮抗作用机制与汞的毒性机理及硒的生理功能有密切关系。研究表明汞可以[9]干扰线粒体的正常工作导致细胞内氧化自由基(ROS)产量的增加，还会抑制机体内抗氧化[10]酶（包括以硒为活性中心的抗氧化酶）的活性，使机体内的ROS不能及时消除，最终导致机体内的氧化还原状态失衡，进而伴随着氧化损伤、细胞凋亡等一系列的影响。汞在生物[11]60体内的赋存形态大多与巯基分子（如谷胱甘肽）以共价键的方式结合存在，而由于汞与4539[12]硒之间的结合常数为10，远远高于汞与硫之间的结合常数10，因而增加硒的摄入量可以降低汞在生物体内与巯基分子的结合率，弥补因汞与硒结合导致的硒缺乏，提升机体的抗[13]氧化能力，从而降低汞导致的氧化应激毒性反应。本研究综合考虑了以上两个方面的硒汞拮抗效应假说机制，选择了与人类物种相近、遗65传背景单纯的Balb/c小白鼠作为受试生物，从个体水平（生物累积与组织分布）及分子水平（免疫器官的氧化/抗氧化平衡）两个层面较为系统地开展小鼠体内硒对甲基汞的解毒机制研究。1材料与方法1.1实验材料70氯化甲基汞（MeHgCl）（Dr.Ehrenstorfer，纯度96%）；富硒酵母（2000mgSe/kg）由江苏省协同医药生物工程有限公司提供；汞标准品（GBW10029）来自中国标准物质中心；汞标准液（1000ppm）购买于上海安谱科学仪器有限公司；细胞凋亡试剂盒购自于BD公司（USA）；谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化氢酶（GPx）试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒、活性氧自由基（ROS）检测试剂盒均购75自于南京凯基生物科技发展有限公司。1.2小鼠暴露实验健康性成熟清洁级（SPF级）、年龄为5周、体重为16-17g的雌性Balb/c小鼠，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，养殖于同济大学动物中心。养殖条件如下：分笼养殖一般为5只/笼；温度保持在20±5C；湿度保持50±15%；光照条件为：光照：黑暗=12h：8012h。适应培养1周之后进行随机分组实验。累积实验：按照小鼠饲料中的总硒含量（0、6mgSe/kg）以及饮用水中是否含有汞（0、0.01mmol/L）2个因素将60只雌性Balb/c小鼠随机分为4组（15只/组）记为：0/0、6/0、-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn0/0.01、6/0.01。在试验期间，为防止因吸附和挥发等因素造成暴露水体中的汞浓度发生大幅度变化，因此每两天为小鼠更新一次饮用水。每两日记录小鼠的体重、饮水量和进食量。连85续暴露30d后，断颈处死小鼠，无菌条件下取小鼠脾脏和胸腺，用于后续的氧化应激/抗氧化应防御系统测试。排出实验：适应培养1周之后，选取55只雌性Balb/c小鼠随机分笼。给小鼠饮用含0.01mmol/L浓度MeHgCl的饮用水，为防止因吸附和挥发等因素造成暴露水体中的汞浓度发生大幅度变化，每天为小鼠更新一次饮用水。连续饮用7天之后，将MeHgCl暴露之后的90小鼠分为两部分：一部分小鼠食用基础饲料，另一部分小鼠食用加硒量为2mgSe/kg的饲料。分别记为0.01+0和0.01+2。在每组小鼠食用基础饲料或加硒饲料7、14、18、21、35天之后，随机选取5只小鼠进行尿样和粪便样品采集。表1不同处理组Balb/c小鼠的暴露条件Tab.1TheexposureconditionsofBalb/cmiceindifferenttreatments组别暴露方式数量0/0干净饮用水+基础饲料（记为：0mgSe/kg）15只6/0干净饮用水+补硒饲料（记为：6mgSe/kg）15只0/0.01含甲基汞饮用水（0.01mmol/L）+基础饲料（记为：0mgSe/kg）15只6/0.01含甲基汞饮用水（0.01mmol/L）+补硒饲料（记为：6mgSe/kg）15只951.3生物样品中汞含量测定暴露结束后，每组随机选取5只小鼠，摘眼球取小鼠血液。断颈处死之后，取大脑、脾脏、胸腺、肾脏和肝脏，除血液之外，其他样品均做冷冻干燥处理以测定汞含量。采用冷冻干燥机（CHRIST,German）将样品干燥48h之后将样品研磨成粉末。准确称取粉末样品0.05-0.1g放入仪器配套特氟龙（PTFE）微波消解罐中，加入7mL浓硝酸和1mL30%H2O2。100在通风橱内预消解2h之后，放入微波消解仪（CEM,MARS6,USA）按照下列程序进行微波消解：1200W，25min升温至180C，维持30min。随后加热浓缩、转移、定容消解液之后，取适当体积进行总汞检测。所有样品中总汞的检测均采用电感耦合等离子质谱仪ICP-MS（Agilent7700）。质量控制：每消解一次样品中包含一个空白消解和标准样品消解（GBW10029）。固体样品中汞含量以mg/kg干重计，血液中汞以mg/L计。1051.4免疫器官中氧化应激与抗氧化防御系统测定1.4.1细胞凋亡检测[14]脾脏与胸腺淋巴细胞凋亡检测采用AnnexinV-FITC和PI双色标记配流式细胞分析仪（BD,USA）进行检测。检测步骤如下：（1）制备好脾脏与胸腺细胞悬液之后，使用冷的6PBS缓冲液将细胞洗两次，再用1×BindingBuffer缓冲液制成1×10个细胞/mL的悬液；（2）5110在流式管中加入100µL细胞悬液（约1×10个细胞）；（3）加入5µL的AnnexinV-FITC或/和PI，轻轻混匀，室温避光处孵育15分钟；（4）各管中分别加入400µL的1×BindingBuffer缓冲液；（5）流式细胞仪测定结果。1.4.2活性氧自由基的含量测定[15]细胞内活性氧自由基（ROS）的测定利用DCF法测定，实验步骤如下：将制备好的6115脾脏和胸腺细胞悬液的细胞密度调整为2×10个/mL1640培养液（不含胎牛血清）。加板时，-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn每孔加入100μL的细胞悬液和100μL含一定浓度的DCFH-DA1640培养液（不含胎牛血清），DCFH-DA在培养板中的最终浓度为10μmol/L。在黑暗条件下，37C下孵育30min。用1640培养液冲洗细胞三次，将未进入细胞的DCFH-DA染料洗去。在激发波长为488nm，发射波长为520nm附近，使用荧光显微镜观察染色，之后用荧光酶标仪检测荧光定量。每个样品120做三个复孔。1.4.3氧化损伤测定丙二醇（MDA）是ROS降解多不饱和脂肪酸过程中的产物，MDA含量的增加意味着[16-17]细胞膜脂质过氧化的发生。ROS氧化蛋白的过程中会使蛋白中巯基含量减少，因此检[18]测蛋白巯基含量的减少可指示细胞内蛋白氧化。GSH是机体内重要的非酶类抗氧化剂，[19]125占据了非蛋白巯基的90%。重金属与GSH在物体内的结合是重金属对生物体产生毒性的[20]重要原因之一。脾脏与胸腺中MDA、巯基、谷胱甘肽（GSH）含量的检测均采用分光光度法测定，其测定原理分别为：（1）MDA可与硫代巴比妥酸（TBA）发生颜色反应生成红色产物，在532nm处有最大吸收峰；（2）二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）与含巯基化合物反应生成黄130色的5-硫代-2-硝基苯甲酸，在412nm处具有最大吸收峰，检测测定管吸光度与对照管的吸光度值，便可通过公式计算出样品中巯基含量；（3）GSH和作用生成5-硫代二硝基苯甲酸阴离子，5-硫代二硝基苯甲酸阴离子呈现较稳定的黄色，在412nm处具有最大吸收峰，通过检测吸光度可算出GSH含量。具体检测步骤如下：（1）称取新鲜组织样本100mg，制备10%的匀浆组织液。（2）严格按照试剂盒要求完成反应体系；（3）测吸光度，计算样品中135待测物质的含量。1.4.4抗氧化酶活性检测谷胱甘肽过氧化氢酶（GPx）和超氧化物歧化酶（SOD）是生物体重要的抗氧化酶，可以有效的保护机体免受氧化应激造成的氧化损伤。而甲基汞的暴露常常会抑制GPx和SOD[21-22]酶活性，进而使机体失去抗氧化能力。140脾脏与胸腺中GPx和SOD酶活性的检测均同样采用分光光度法测定。GPx活性测定原理为：（1）GPx可以特异性的催化GSH反应生成水和氧化性谷胱甘肽（GSSG），因此GPx的活力可通过测定此酶促反应中GSH的消耗，即可求出GPx的活力；（2）黄嘌呤及黄嘌2-2-呤氧化没反应系统产生超氧阴离子自由基（O），O与氧化盐酸羟胺形成亚硝酸盐，亚硝酸盐在与显色剂的作用产生紫红色化合物，550nm下测其吸光度可得其含量。SOD活性测145定原理：当反应体系中含有SOD时，催化超氧阴离子自由基发生歧化反应而减少，是形成的亚硝酸盐减少，最终生成紫红色化合物减少，从而使吸光度减少。通过检测测定管吸光度与对照管的吸光度值，便可通过公式计算出样品中的SOD活力。检测步骤如下：（1）称取新鲜组织样本100mg，制备10%的匀浆组织液。（2）严格按照试剂盒要求完成反应体系；（3）测吸光度，计算结果。1502.实验结果2.1硒添加对小鼠排出汞的影响如图1所示，当小鼠经甲基汞暴露7天之后，食用基础饲料的小鼠尿液中的汞含量逐渐从0.11ug/mL降至0.008ug/mL，粪便中的汞含量从1.07μg/g降至0.12μg/g。然而，当小鼠-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn食用加硒饲料时，小鼠尿液中汞含量从0.22ug/mL降至0.13ug/mL，粪便中的汞含量从1.24155μg/g降至0.19μg/g。通过对比，我们发现加硒饲料的食用使甲基汞暴露小鼠尿液和粪便中的汞含量明显升高。这表明硒可以增强甲基汞从小鼠体内的排出。0.250.01+01.40.01+00.01+20.01+20.201.21.00.150.80.100.6汞含量(mg/kg)汞含量(mg/L)0.40.050.20.000.0714212835714212835净化时间净化时间图1排出实验中小鼠尿液（左图）及粪便（右图）中汞的含量Fig.1Themercurycontentintheurine(left)andfeces(right)ofmiceduringeliminationexperiments1602.2硒对汞的组织分布的影响经过30天的甲基汞暴露之后，我们分别检测了小鼠肾脏、肝脏、大脑、脾脏、胸腺、肌肉和血液中的总汞含量（汞分布不仅限于这些脏器之内）。如图2所示，小鼠体内的总汞分布顺序大致如下：肾脏>肝脏>大脑>脾脏>胸腺>肌肉（血液除外）。35*0/0300/0.01#6/0.01256/02015#*10**#汞(mg/kgormg/L)5**总*0.50.0肾脏肝脏大脑脾脏胸腺肌肉血液165图2硒-甲基汞暴露实验后小鼠体内总汞的脏器分布（*：代表与0/0组相比具有差异显著，p<0.05；#：代表与0/0.01组相比具有差异显著，p<0.05）Fig.2ThedistributionofmercuryinmiceafterSe-MeHgexposure(*meansstatisticalsignificantcomparingwiththe0/0group,p<0.05;#meansstatisticalsignificantcomparingwiththe0/0.01group)通过对比甲基汞单独暴露组（0/0.01）和硒汞共暴露组（6/0.01），我们发现增加食物硒170的摄入量，小鼠体内汞分布发生了明显的变化：如肾脏、脾脏、胸腺以及肌肉中的总汞含量均有不同程度的降低，分别降低了16.65%、24.76%、22.49%和23.70%；而肝脏、大脑以及血液中的总汞含量分别增加了16.38%、18.76%和16.41%。这表明增加食物有机硒的摄入量可明显改变甲基汞暴露小鼠体内的总汞分布。2.3小鼠免疫器官中的细胞凋亡175流式细胞分析结果表明（见图3和表2）：与空白对照相比（0/0），甲基汞的饮用水单-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn独暴露分别使小鼠脾脏和胸腺淋巴细胞的早起凋亡细胞增加了15%和17%。含甲基汞饮用水与富硒酵母的共同摄入使小鼠的早期凋亡细胞百分比明显低于甲基汞暴露组。这说明增加食物硒的摄入量可以消除甲基汞暴露对小鼠淋巴细胞凋亡的诱导作用。表2不同处理组Balb/c小鼠脾脏与胸腺早期细胞凋亡所占百分比180Tab.2ThepercentageofapoptosiscellsinthymusandspleenofBalb/cmiceafterdifferenttreatments0/00.016/0.016/0胸腺23.43±2.0639.9±2.6426.63±0.7422.30±1.30脾脏21.23±0.2936.63±1.9325.3±1.9329.23±2.06图3不同处理组Balb/c小鼠流式细胞分析图Fig.3FlowcytometryresultsusingcellsfromBalb/cmiceafterdifferenttreatments1852.4小鼠免疫器官中的氧化应激反应与空白对照相比（0/0），饮用水甲基汞暴露引起小鼠脾脏和胸腺内ROS的明显增加（见图4），分别增加了38%和27%（见图5）。富硒酵母的单独摄入也引起了小鼠脾脏ROS增加了31%。然而含有甲基汞的饮用水（0.01mmol/L）和富硒酵母共同摄入时，小鼠脾脏和胸腺内ROS含量并未发生明显的变化。这表明甲基汞和富硒酵母的共同摄入明显消除了甲190基汞暴露或富硒酵母（6mg/kg）单独摄入所引起的ROS累积（小鼠脾脏和胸腺中）。-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图4荧光显微镜观察不同处理组Balb/c小鼠脾脏与胸腺细胞ROS含量Fig.4TheROScontentobservedunderfluorescencemicroscopeinBalb/cmiceafterdifferenttreatments2.0胸腺1.8脾脏1.6**1.4*1.2#1.00.8ROS产量(%0/0)0.60.40.20.00/00/0.016/0.016/0暴露组别195图5不同处理组Balb/c小鼠脾脏与胸腺细胞ROS产量（*：代表与0/0组相比具有差异显著，p<0.05；#：代表与0/0.01组相比具有差异显著，p<0.05）Fig.5TheproductionofROSinthethymusandspleencellsofBalb/cmiceafterdifferenttreatments(*meansstatisticalsignificantcomparingwiththe0/0group,p<0.05;#meansstatisticalsignificantcomparingwiththe0/0.01group)200丙二醇和蛋白总巯基分别可以指示细胞的脂质过氧化和蛋白氧化反应的发生。甲基汞的饮用水单独暴露导致小鼠（0/0.01）脾脏和胸腺内丙二醇明显升高（见图6），分别升高了44%和30%。除此之外，甲基汞的饮用水暴露还明显降低了脾脏和胸腺里总巯基含的明显降低（见图6），分别降低了42%和25%。含甲基汞饮用水与加硒食物的共同摄入组小鼠（6/0.01）脾脏和胸腺内的丙二醇和总巯基含量水平均与对照组（0/0）没有明显差异。这表明增加小205鼠食物硒的摄入量可以消除甲基汞暴露对脾脏和胸腺细胞造成的氧化损伤（脂质过氧化和蛋白氧化）。-7- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn2.02.0胸腺1.8胸腺1.8脾脏脾脏1.6*1.60)*0)//1.41.41.21.2#(%0#(%01.01.0含量0.80.8*0.6巯基含量0.6MDA0.40.40.20.20.00.00/00/0.016/0.016/00/00/0.016/0.016/0暴露组别暴露组别图6不同处理组Balb/c小鼠脾脏与胸腺细胞内MDA累积量及总巯基量（*：代表与0/0组相比具有差异显著，p<0.05；#：代表与0/0.01组相比具有差异显著，p<0.05）210Fig.6TheMDAcontentandtotalSHcontentinthethymusandspleencellsofBalb/cmiceafterdifferenttreatments(*meansstatisticalsignificantcomparingwiththe0/0group,p<0.05;#meansstatisticalsignificantcomparingwiththe0/0.01group)2.5小鼠免疫器官中的抗氧化系统变化GSH和GPx、SOD均是抗氧化系统的重要组成。如图7所示，甲基汞的饮用水单独暴215露引起了小鼠（0/0.01）免疫器官内GSH含量的降低，脾脏和胸腺GSH含量分别降低了21%和35%。除此之外，甲基汞的饮用水暴露还明显抑制了小鼠脾脏和胸腺中抗氧化酶（GPx和SOD）活性。其中，与空白对照组（0/0）相比，脾脏GPx和SOD活性分别降低了60%和44%，胸腺GPx和SOD活性分别降低了32%和29%。然而，加硒食物的单独食用除了引起小鼠（6/0）脾脏与胸腺中GSH含量分别升高了19%和38%之外，对抗氧化酶（GPx和220SOD）活性没有产生明显影响。含甲基汞饮用水与富硒酵母的共同摄入组小鼠脾脏和胸腺内的抗氧化酶系统（GSH含量和GPx、SOD活性）并没有发生明显变化。这表明增加小鼠食物中有机硒的摄入量可以消除甲基汞暴露对脾脏和胸腺抗氧化系统造成的负面影响（即GSH含量和GPx、SOD活性的降低），尤其是对胸腺抗氧化系统。2.0胸腺1.8脾脏1.6#0)*/1.4#1.2(%01.0#含量0.8*0.6GSH0.40.20.00/00/0.016/0.016/0-8- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn2.0胸腺0)1.8脾脏/1.6(%01.4#1.2#性1.0##对活0.8*相0.60.4*GPx0.20.00/00/0.016/0.016/02252.0胸腺1.8脾脏1.61.41.2性(%0/0)1.00.8**0.60.4SOD相对活0.20.00/00/0.016/0.016/0暴露组别图7不同处理组Balb/c小鼠脾脏与胸腺细胞内GSH、GPx及SOD酶活性（*：代表与0/0组相比具有差异显著，p<0.05；#：代表与0/0.01组相比具有差异显著，p<0.05）Fig.7TheenzymeactivitiesofGSH,GPxandSODinthethymusandspleencellsofBalb/cmiceafterdifferent230treatments(*meansstatisticalsignificantcomparingwiththe0/0group,p<0.05;#meansstatisticalsignificantcomparingwiththe0/0.01group)3小鼠体内硒-汞拮抗机制讨论本研究发现，硒与汞的共暴露使脾脏、胸腺、肌肉和肾脏中的汞含量明显降低，而大脑、血液和肝脏中的汞含量则明显升高，表明硒改变了汞在生物体内的组织分布。此外，经硒暴235露后的小鼠尿液和粪便中的汞含量明显升高，表明硒添加直接促进了小鼠体内汞的排出。因此，增强汞从小鼠体内的排泄和改变汞在生物体内的组织分布进一步使靶器官中（如胸腺和脾脏）的汞含量的降低可能是硒对汞毒性的解毒作用机制之一。本研究中发现经甲基汞暴露之后，小鼠免疫器官中氧化损伤（脂质过氧化和蛋白氧化）和早期细胞凋亡率明显升高。这与小鼠免疫器官中ROS的产量明显升高具有密切相关性，[23]240因为机体内ROS的积累是汞诱导细胞氧化损伤进而产生毒性的主要原因。而免疫器官中ROS的累积可能是由三个方面的原因。首先，直接来自于甲基汞暴露，有研究表明甲基汞2--在生物体内可导致机体内超阳离子（O）、过氧化氢（H2O）以及羟基自由基（OH）等-9- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn[24]ROS的产生。其次，甲基汞暴露后由于汞与巯基的结合而使得抗氧化剂GSH出现耗竭。[25]有研究表明甲基汞进入机体内常常与机体内GSH结合存在，GSH是机体内广泛分布的一[16]245种三肽分子，它所含有的巯基占机体内所有巯基的90%。再次，甲基汞暴露会抑制机体抗氧化酶（如GPx和SOD）活性，例如Sakamoto等的研究结果显示甲基汞暴露降低了血液[26]中GSH含量以及大脑中GPx活性，而DeFreitas等通过实验得出甲基汞暴露对小鼠的抗[27]氧化酶活性（GPx、SOD和CAT）产生了明显的抑制作用。本研究结果也表明甲基汞暴露使得免疫器官中GSH的含量以及GPx和SOD活性明显降低，表明小鼠免疫器官内正常250的氧化还原平衡状态受到干扰。本研究中关于抗氧化系统的研究结果显示硒-汞复合暴露体系下，小鼠免疫器官内抗氧化酶GSH含量以及抗氧化酶GPx和SOD活性均与对照组没有明显差异。这表明增加硒的摄入量可以有效地消除甲基汞对抗氧化系统的干扰（GSH的耗竭，GPx和SOD活性的抑制）。其原因可能有两个。首先，硒作为生物体必需的微量元素，对机体的抗氧化作用起着至关重255要的作用，如硒不仅参与机体内GPx的组成还是GPx的活性中心，因而提高机体硒的摄入量可以增高机体的抗氧酶GPx的活性。本研究中也发现在小鼠饲料中加硒可以增强小鼠免45疫器官中GPx的活性。其次，汞与硒之间的结合常数为10，远远高汞与硫之间的结合常39[12]数为（10），增加硒的摄入量后，进入生物体内的汞离子很可能首先与硒结合，从而增[25]加汞与硒的结合率而降低汞与巯基分子GSH的结合率，进而消除机体内GSH的耗竭。260综上，本研究分别从个体水平和分子水平探索了硒对甲基汞的解毒作用机制，得出以下结论：（1）增加小鼠食物中的硒含量不仅可以增强甲基汞暴露后小鼠体内的汞排泄，还改变了汞在小鼠体内的组织分布，降低汞在靶器官（如免疫器官）中的累积；（2）甲基汞暴露诱导了小鼠免疫器官（脾脏和胸腺）中ROS的累积，降低了抗氧化能力（GSH耗竭、GPx和SOD活性受到抑制），从破坏了氧化与抗氧化之间的平衡，从而导致细胞氧化损伤（脂265质过氧化和蛋白氧化），进一步诱导了细胞凋亡（早起细胞凋亡的比率增加）。增加硒的摄入量之后，免疫器官中的氧化还原平衡状态得以恢复，进而ROS的累积及其所造成的细胞氧化损伤和细胞凋亡得以消除。由此可以得出，硒对甲基汞免疫毒性的解毒作用可通过促进排出、改变组织分布、以及维持靶器官中氧化与抗氧化之间的平衡这几种机制共同作用实现。[参考文献](References)270[1]WangR,WongMH,WangWX.MercuryexposureinthefreshwatertilapiaOreochromisniloticus[J].EnvironmentalPollution2010,158:2694-2701.[2]RalstonNVC,RaymondLJ.Dietaryselenium"sprotectiveeffectsagainstmethylmercurytoxicity[J].Toxicology2010,278:112-123.[3]Cuvin-AralarMLA,FurnessRW.Mercuryandseleniuminteraction:areview[J].275EcotoxicologyandEnvironmentalSafety1991,21:348-364.[4]DeFreitasAS,FunckVR,RottaMdS,etal.Diphenyldiselenide,asimpleorganoseleniumcompound,decreasesmethylmercury-inducedcerebral,hepaticandrenaloxidativestressandmercurydepositioninadultmice[J].BrainResearchBulletin2009,79:77-84.[5]BrancoV,CanárioJ,LuJ,etal.Mercuryandseleniuminteractioninvivo:Effectson280thioredoxinreductaseandglutathioneperoxidase[J].FreeRadicalBiologyandMedicine2012,52:781-793.[6]BjerregaardP,ChristensenA.SeleniumreducestheretentionofmethylmercuryinthebrownshrimpCrangoncrangon[J].EnvironmentalScience&Technology2012,46:6324-6329.[7]BjerregaardP,FjordsideS,HansenMG,etal.Dietaryseleniumreducesretentionofmethyl285mercuryinfreshwaterfish[J].EnvironmentalScience&Technology2011,45:9793-9798.[8]LiYF,DongZ,ChenC,etal.Organicseleniumsupplementationincreasesmercuryexcretionanddecreasesoxidativedamageinlong-termmercury-exposedresidentsfromWanshan,China.-10- 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