基于适配体的F0F1-ATPase生物传感器检测鼠伤寒沙门氏菌.pdf 9页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn基于适配体的F0F1-ATPase生物传感器检#测鼠伤寒沙门氏菌111,2**孙炜佳，段诺，王周平5（1.江南大学食品学院食品营养与安全实验室，无锡214122；2.大连工业大学食品学院国家海产品工程技术中心，大连116034）摘要：建立一种新型的生物传感器，以鼠伤寒沙门氏菌适配体为探针与载色体中ATP合酶上的ε亚基通过ε亚基抗体-生物素-亲和素-生物素链相连来捕获细菌。细菌的负载使ATP合酶的旋转速率下降，这也导致ATP合成的减少。鼠伤寒沙门氏菌的检测正是基于ATP合10成过程中，载色体膜内外的质子流通的变化。该检测使用F-DHPE荧光染料作为指示剂，最后使用荧光探测仪来进行检测。在最优检测条件下，菌浓度在101-104cfu/mL范围内与发光信号有良好的线性关系(R2=0.9944)，方法检测限为10cfu/mL。实验结果表明该传感器可特异性识别鼠伤寒沙门氏菌，而且有望在致病菌检测领域成为一种方便、快捷的工具。关键词：营养与食品卫生学；适配体；分子马达生物传感器；鼠伤寒沙门氏菌；F-DHPE荧15光染料中图分类号：Q559+.9Aptamer-basedF0F1-ATPasebiosensorforSalmonellatyphimuriumdetection111,2SUNWeijia,DUANNuo,WANGZhouping20(1.SchoolofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,FoodNutritionandSafetyLaboratory,WuXi,214122;2.NationalEngineeringResearchCenterofSeafood,SchoolofFoodScienceandTechnology,DalianPolytechnicUniversity,Dalian,116034)Abstract:AnovelbiosensorwasdevelopedbyconjugatingSalmonellatyphimuriumaptamerwiththe25‘‘rotator’’ε-subunitofF0F1–ATPasewithinchromatophoreswithananti-ε-subunitantibody–biotin–avidin–biotin–aptamerlinkertocapturebacteria.ThebacterialloaddecreasedtherotationrateofF0F1-ATPase,whichledtothedecreaseinATPsynthesis.ThedetectionofS.typhimuriumwasbasedonprotonfluxchangedrivenbytheF0F1-ATPase-mediatedATP-synthesis,whichwasindicatedbyF-DHPE,monitoredbyafluorescencespectrometer.Underoptimalconditions,30thecorrelationbetweentheluminescentsignalandtheconcentrationofS.typhimuriumwasobservedtobelinearwithintherangeof101to104cfu/mL(R2=0.9944).Thelimitdetectionforthedevelopedmethodwas10cfu/mLforS.typhimurium.TheresultsdemonstratethattheF0F1-ATPasemolecularmotorbiosensorcanspecificallydetectS.typhimuriumatlowconcentration,andwillbeaconvenient,quick,andpromisingtoolfordetectingpathogens.35Keywords:Nutritionandfoodhygiene;Aptamer;molecularmotorbiosensor;S.typhimurium;F-DHPE基金项目：国家自然科学基金（31401575）作者简介：孙炜佳（1992-），女，研究生，主要研究方向：食品营养与安全分析通信联系人：王周平（1974-），男，教授、博导，分析化学.E-mail:wangzp@jiangnan.edu.cn-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn0引言沙门氏菌是对人类和动物健康构成相当危害的一类致病菌，也是引起人类食物中毒最常40见的病原菌。据统计在全球范围内的细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒占据首位[1]或第二位。在我国目前流行的众多血清型中，鼠伤寒沙门氏菌是最为常见的一种。为预防和控制鼠伤寒沙门氏菌引起的食物中毒，除做好常规的消毒卫生等环节外，对食品中该菌的[2]快速检测无疑对预防该菌引起的食物中毒具有重要的意义。分子马达是广泛分布于内部或细胞表面的一类蛋白。分子马达能主动地从环境中俘获[3]45“能量分子”ATP，借助热涨落来消耗ATP水解所释放出的化学能，进而改变己的构象。[4]ATP合成酶又是最普遍的一种旋转分子马达。ATP合酶也叫F0F1-ATPase，它能够使ADP+[5-11]和Pi合成ATP，而ATP合成所需要的能量由跨膜质子（H）梯度差提供。由于F0F1-ATPase处于纳米级的尺寸以及它实际应用的可能性，许多学者已经开始将它运用到致病菌检测领域[12,13]。这些实验结果显示F0F1-ATPase可快速、特异性检测一些致病菌。他们都是利用抗体50或DNA作为探针，但是抗体制备繁琐耗时久而DNA的稳定性不够。核酸适配体是一种由指数富集的配基系统进化技术(SELEX)从随机单链核酸序列库中[14]筛选出与靶物质特异性高度亲和的一段单链DNA或RNA片段。适配体应用范围广泛，靶分子不仅包括小分子，也包括细菌、细胞、病毒等完整的细胞核生物大分子；适配体具有较高的热稳定性，可反复变性复性、易于保存，同时适配体的末端容易修饰一些活性或指示[15-18]55基团，便于进行固定和检测。本实验用适配体代替抗体作为识别沙门氏菌的探针，将对pH敏感的F-DHPE荧光染料[19]标记在载色体外膜作为质子流通的指标。鼠伤寒沙门氏菌的检测基于F0F1-ATPase合成[20]ATP时载色体膜两边的质子流动而导致的pH值的变化引起的荧光强度的变化。实验结果显示适配体-分子马达生物传感器灵敏度高、特异性好，可用于今后食品安全检测领域。601材料和方法1.1材料与试剂深红红螺菌RhodospirillumrubrumATCC11170、鼠伤寒沙门氏菌SalmonellatyphimuriumATCC14028、金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusATCC29213、大肠杆菌EscherichiacoliATCC25922、副溶血性弧菌VibrioparahaemolyticusATCC17802和李斯特65菌ListeriamonocytogenesATCC19115，上述标准菌株从美国典型菌种保藏中心获得；二磷酸腺苷（ADP）、生物素（biotin）和亲和素（avidin）购自于美国Sigma公司；F-DHPE、ε亚基抗体购自于美国赛默飞世尔科技有限公司；荧光素酶购自于美国Promega公司；鼠伤寒沙门氏菌适配体序列由上海生工生物科技有限公司合成，序列为：[21]5’-biotin-AGTAATGCCCGGTAGTTATTCAAAGATGAGTAGGAAAAGA-3’。-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn701.2主要仪器与设备UV-1800紫外分光光度，日本岛津公司；激光共聚焦显微镜（LeicaTCSSP8），德国徕卡；F-7000全波长荧光扫描仪，日本日立有限公司；超速冷冻离心机，美国贝克曼库尔特有限公司；高速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；Centrifuge5424R台式高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；Zeta点位分析仪ZS90，英国马尔文仪器；超纯水仪，密75理博（中国）有限公司。1.3实验方法1.3.1载色体的提取将深红红螺菌Rhodospirillumrubrum菌种按比例1:100接种到液体培养基，26℃、150r/min，培养72h。然后5000r/min离心30min，4℃离心收集菌体。用提取Buffer(20mmol/L80Tris-HClpH8.0，100mmol/LNaCl溶液，2mmol/LMgCl2溶液，1mmol/LDTT溶液)重悬菌体，离心去上清液(8000r/min、4℃离心10min)。加入提取Buffer重悬菌体(约1g加入10mLBuffer)，再加入终浓度1mmol/LPMSF，冰上超声破碎30min(超声5s，停8s)。将破碎菌体离心(25000r/min、4℃离心90min)，去沉淀取上清液。将上清液超速离心(50000r/min、4℃离心1.5h)，取沉淀即为载色体。最后用提取Buffer重悬沉淀并加入30%的甘油，[22,23]85置于－80℃保存。1.3.2荧光探针F-DHPE标记载色体以及生物素标记ε亚基抗体先将F-DHPE用氯仿配成1mg/mL，分装成200μL/管后用氮气吹干，置于－80℃保存[23]。从冰箱中取出1管已吹干的F-DHPE，加入200μL无水乙醇将其充分溶解。取200μL载色体原液放入1.5mL离心管中，加入30μLF-DHPE，上下颠倒混匀5次，用锡泊纸包起90后避光放在室温摇床上孵育15min。15000r/min、4℃离心30min，收集沉淀。重复用PBS洗3次以去除多余的荧光探针，将沉淀用300μLPBS重悬备用，最终获得荧光探针F-DHPE标记的载色体。将2μL生物素(2μmol/L)加入到20μL亚基抗体中，室温孵育30min，抗体N端即被标记。1.3.3分子马达适配体传感器的构建95取300μL已标好F-DHPE的载色体于离心管中，加入40μLN-biotin标记ε亚基抗体，用PBS补加至1mL，37℃反应1h；4℃、15000r/min离心30min；弃上清液，将沉淀用500μLPBS重悬；加入2μL亲和素(1mg/mL)，用PBS补加至1mL，室温摇床上(转速50～100r/min)反应3h；4℃、15000r/min离心30min，弃上清液，将沉淀用500μLPBS重悬；加入生物素标记的鼠伤寒沙门氏菌适配体(10μM)50μL，用PBS补加至1mL，室温摇床100上(转速50～100r/min)反应30min，弃上清液，用300μL含30%甘油的PBS重悬载色体，放入－20℃冰箱备用。最终获得适配体-分子马达复合物。1.3.4鼠伤寒沙门氏菌的检测用PBS将鼠伤寒沙门氏菌稀释到不同浓度，取100μL菌液与300μL载色体-适配体复合物于37℃条件下孵育1h，然后4℃、15000r/min离心30min，弃上清液;然后加入30μL105ATP合成缓冲液(0.1mMTricine,10%glycerol,5mMNaH2PO4,5mMMgCl2,ADP0.35mM,-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnNADH2mM,pH9.0)37℃孵育10min，接着加入450μLPBS，混合均匀。最后取300μL样品，在F-7000的荧光模式下，以496nm进行激发，记录515nm处的荧光强度。1.3.5实际样品的检测取从本地超市购买牛奶10mL，12000r/min离心15min，然后用0.22μm滤膜以除去牛110奶中的蛋白质和脂肪，然后用Tris-HCl溶液将牛奶样品的pH值调为7.7，将处理过的牛奶样品分成9份，每份样品的体积为900μL，再将100μL不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌的培养物加到上述牛奶样品中，使样品的总体积达到1mL。分别取100μL含有不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌的样品进行平板计数，另取100μL含有不同浓度的菌液的样品，采用本实验的方法进行检测，将得到的检测结果与平板计数法所得到的结果进行比较。1152结果与讨论2.1检测原理F0F1-ATP合酶的力学化学之间是紧耦合的关系,即每转动一周合成(或水解)三个ATP并跨膜转移10~14个质子(与质子通道数有关)。因此物理量(如转速)的改变间接地反映在[24]ATP合成(或水解)速率的变化上，同时也反映在体系pH值变化上。F-DHPE是一种脂染120料探针，可以嵌入到磷脂分子层中。同时F-DHPE也是一种pH指示剂，将其嵌入磷脂双分子层可以用来测量磷脂层外面pH值得变化，在pH7.0~9.0范围内，F-DHPE的荧光强度与[25]pH值呈正相关。基于上述原理，在马达的转子上通过ε亚基连上适配体探针，再在载色体膜外标记上对pH值敏感的荧光染料F-DHPE。检测前，加入ADP启动反应，一旦适配体与目标物结合，F0F1-ATPase由于负载导致旋转速度下降，ATP合成速率也减慢，在ATP+125合成过程中，质子由载色体内泵出，载色体外H浓度减小，从而导致载色体外pH值上升，F-DHPE荧光值随之升高。本研究通过“ε亚基抗体-生物素-亲和素-适配体”链连接F0F1-ATPase构建基于适配体的F0F1-ATPase生物传感器，原理示意图见图1。-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图1基于适配体的分子马达生物传感器原理示意图130Fig.1Schematicoftheaptamer-basedF0F1-ATPasebiosensorforS.typhimuriumdetection2.2载色体的表征[26]如图2所示，载色体在880nm处有一个明显的紫外吸收峰，与文献报道的一致。图2载色体的紫外可见吸收光谱135Fig.2UV-visabsorptionspectrumofthechromatophores2.3F-DHPE标记载色体的表征被F-DHPE标记的载色体用激光共聚焦显微镜来观察。载色体与F-DHPE荧光染料孵育之后呈现亮绿色的圆点状（图3）。140图3F-DHPE标记的载色体在的激光共聚焦图；左边荧光、右边明场；Fig.3F-DHPE-labeledchromatophoresmonitoredbyconfocalmicroscopy;(leftpanel)fluorescence,(rightpanel)brightfield-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn2.4载色体连上适配体的表征用激光共聚焦显微镜来拍摄载色体-适配体复合物与细菌孵育后的图。图4显示，长条145的鼠伤寒沙门氏菌表面有荧光，这表明载色体-复合物捕获靶标，也间接说明载色体与适配体连接成功，载色体附于菌表面使得菌体显示荧光。Zeta电位实验显示载色体在连接上适配体后zeta电位值有变化。载色体和适配体通过ε亚基抗体-生物素-亲和素-生物素-适配体方法连接后的zeta电位值(-13.45)和单独的载色体(-5.3)、单独的适配体(-25.3)以及载色体和适配体简单混合(-24.42)的数值有较大差别，而且150单独载色体和载色体与适配体简单混合的值相差不大，所以认为这一结果可证明适配体和载色体连接成功。图4适配体-载色体复合物捕获鼠伤寒沙门氏菌的激光共聚焦图；左图为荧光、右图为明场；Fig.4Confocalmicroscopyofaptamersbindingtobacteria;(leftpanel)fluorescence,(rightpanel)bright155field;2.5检测结果分析14如图5所示，鼠伤寒沙门氏菌在1×10~1×10cfu/mL浓度范围内与515nm处相对荧2光强度呈良好的线性关系，线性方程为y=1085.13x+363.98(R=0.9944)，最低检出限为10cfu/mL。160-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图5F0F1-ATPase分子马达检测鼠伤寒沙门氏菌标准曲线Fig.5StandardcurvefortheF0F1-ATPasemolecularmotorbiosensor’sdetectionofS.typhimurium2.6特异性检测结果4应用本方法同时对相同浓度(10cfu/mL)的金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆165菌、单增李斯特菌、副溶血性弧菌进行了检测，图6显示鼠伤寒沙门氏菌的相对荧光值远高于其他几种致病菌，所以可判断为本实验方法的特异性良好。图6F0F1-ATPase分子马达生物传感器检测鼠伤寒沙门氏菌的特异性实验结果Fig.6RelativefluorescenceintensitiesmeasuredforS.typhimurium,E.coli,V.parahemolyticus,S.aureusand170L.monocytogenesincomplexwiththeaptamer-biotin-avidin-biotin-anti-ε-subunitantibody-chromatophore;theerrorbarsshowthestandarddeviationfromreplicatedeterminations2.7牛奶实际样品检测结果分别取100μL含有不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌的样品进行平板计数，另取100μL含有不同浓度的菌液的样品，采用本实验的方法进行检测，将得到的检测结果与平板计数法所得175到的结果进行比较。结果见表1。两种方法检测结果一致，无明显差异。表1牛奶实际样品检测，平板涂布方法与本方法比较Tab.1Comparisonofmilksampleresultsobtainedfromtheproposedmethodandclassicalplatecountingmethods牛奶样品平板计数(cfu/ml)本实验方法(cfu/ml)12±1.6No.111±1.726±1.8No.223±3.3113±4.5277±8.6No.3107±4.9358±14.5No.4252±8.1446±18.5No.5349±14.3No.6422±18.7-7- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn3结论180本文给出了一种新型的基于适配体的分子马达生物传感器，并用它成功检测了鼠伤寒沙门氏菌。这是第一次使用适配体与F0F1-ATPase结合构建生物传感器用于食源性致病菌的检测。该方法具有高灵敏度、良好的特异性、高稳定性和很好的灵活性等特点。与目前其他检测方法在线性范围和检测限方面都具有优势。本研究是在理论的基础上对应用进行的初探，所以还存在一些不足，如载色体的纯度可以通过纯化进一步提高，如何保证ATP合酶的活185性，还有是否可以使用其他荧光染料代替F-DHPE提高实验灵敏度。希望我们在今后的研究中能够一一探索这些问题。[参考文献](References)[1]KUNWARR,SINGHH,MANGLAV,etal.Outbreakinvestigation:Salmonellafoodpoisoning[J].MedicalJournalofArmedForcesIndia,2013,69(4):388-391.JIXG,DENGYY,WANGP.Charactersofatmosphere190pressure,pureoxygenfixedbedgasificationofsevenkindscoal[J].CleanCoalTechnology,2004,25(4):50-52.[2]宫强，李战丽，牛明福，等.鼠伤寒沙门氏菌ompc基因PCR的检测方法[J].食品科学，2015，36（16）：251-254.[3]YASUDAR,NOJIH,YOSHIDAMetal.ResolutionofdistinctrotationalsubstepsbysubmillisecondkineticanalysisofF1-ATPase[J].Nature,2001,410(6831):898-904195[4]HUDSONGS,MASONJG,HOLTONTAetal.AgeneclusterinthespinachandpeachloroplastgenomesencodingoneCF1andthreeCF0subunitsoftheH+-ATPsynthasecomplexandtheribosomalproteinS2[J].J.Mol.Biol,1987,196(2):283-298.[5]WEBERJ,WILKEMOUNTSS,LEERSetal.SpecificplacementoftryptophaninthecatalyticsitesofEscherichiacoliF1-ATPaseprovidesadirectprobeofnucleotidebinding:maximalATPhydrolysisoccurswith200threesitesoccupied[J].J.Biol.Chem,268(27):20126-20133.[6]HOWARDJ.MechanicsofProteinsandtheCytoskeleton.Sinauer,Sunderland,Massachusetts,2001.[7]BOYERPD.TheATPsynthase-Asplendidmolecularmachine[J].Annu.Rev.Biochem,66(1):717-749.[8]GRESSERMJ,MYERSJA,BOYERPD.CatalyticSiteCooperativityofBeefHeartMitochondrialF,AdenosineTriphosphatase[J].Biol.Chem,1982,257(20):12030-12038.205[9]JUNGEW,NELSONN.StructureandEnergyTransferinPhotosystemsofOxygenicPhotosynthesis[J].Annu.Rev.Biochem,2015,84(84):631-657.[10]MITCHELLP.Couplingofphosphorylationtoelectronandhydrogentransferbyachemi-osmotictypeofmechanism[J].Nature,1961,191(4784):144-148.[11]WEBERJ,SENIORAE.CatalyticmechanismofF1-ATPase[J].Biochim.Biophs.Acta,1997,1319(1):19-58.210[12]ZHANGJ,LIZ,ZHANGHetal.RapiddetectionofseveralfoodbornepathogensbyF0F1-ATPasemolecularmotorbiosensor[J].J.Microbiol.Methods,2013,93(1):37-41.[13]ZHAOY,HAY,YUEJetal.DevelopmentofanovelbiosensorbasedonF0F1-ATPaseforthedetectionof2-dodecylcyclobutanoneinirradiatedbeef[J].2015,188(2):320-324.[14]YuceM，UllahN，BudakH.Trendsinaptamerselectionmethodsandapplications[J].Analyst，2015，140(16):2155379-5399.[15]BergK，MagbanuaE，HahnU.Selexofcell-specificrnaaptamers[J].Methodsinmolecularbiology(Clifton，NJ)，2016，1380:21-32.[16]BitarafFS，RasooliI，GargariSLM.DNAaptamersforthedetectionofhaemophilusinfluenzaetypebbycellselex[J].EuropeanJournalofClinicalMicrobiology&InfectiousDiseases，2016，35(3):503-510.220[17]ChenX，PanY，LiuH，etal.Label-freedetectionoflivercancercellsbyaptamer-basedmicrocantileverbiosensor[J].Biosensors&Bioelectronics，2016，79:353-358.[18]GongW，DuanN，WuS，etal.Selection，identification，andapplicationofdualDNAaptamersagainstshigellasonnei[J].AnalyticalMethods，2015，7(8):3625-3631.[19]ZHAOZ,ZHANGJ,XUML.Arapidlynew-typeddetectionofnorovirusbasedonF0F1-ATPasemolecular225motorbiosensor[J].Biotechnol.BioprocessEng,2016，21(1):128-133.[20]JRKK,YASUDAR,NOJIH.F1-ATPase:arotarymotormadeofasinglemolecule[J].Seibutsubutsuri,1999,39(6):361-366.[21]DUANN,WUS,CHENXetal.SelectionandcharacterizationofaptamersagainstSalmonellatyphimuriumusingwhole-bacteriumSystemicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment(SELEX)[J].J.Agric.Food230Chem,2013,61(13):3229-34.[22]RICHTERML,GROMETELHANANZ,MCCARTYRE.ReconstitutionoftheH+-ATPasecomplexofRhodospirillumrubrumbythebetasubunitofthechloroplastcouplingfactor1[J].1986，261(26):12109-12113.-8- 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