基于WPI乳状液的维生素E包埋和保护的金属离子依赖性.pdf 9页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn基于WPI乳状液的维生素E包埋和保护的#金属离子依赖性**范祺，程昊，方正，梁丽5（江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，无锡214122）摘要：本文利用乳清分离蛋白稳定的水包油（O/W）型乳状液对维生素E进行包埋和保护，2+2+研究了Ca和Fe对乳状液结构以及维生素E包埋和保护的影响。结果表明，两种金属离子诱导WPI乳状液聚集，增加了WPI乳状液的界面蛋白含量和维生素E的包埋率，且金属2+2+10离子浓度越大，维生素E的包埋率越高。在维生素E保护效果方面，Ca和Fe的加入整体2+上不影响WPI乳状液对维生素E的保护作用，除了Fe在储藏中间段稍改善了维生素E的稳定性。关键词：乳状液；维生素E；包埋；金属离子；稳定性中图分类号：TS201.715WPIemulsionbasedvitaminEencapsulationandprotection:dependenceonmetalionsFanQi,ChengHao,FangZheng,LiangLi(StateKeyLaboratoryofFoodScienceandTechnology,SchoolofFoodScienceandTechnology,20JiangnanUniversity,Wuxi214122)Abstract:Wheyproteinisolate(WPI)waschosenasemulsifiermodeltoprepareoil-in-wateremulsion2+2+forencapsulationandprotectionofhydrophobicvitaminE.InfluenceofCaandFeontheemulsionstructureandtheencapsulationandprotectionofvitaminEwasinvestigated.TheresultsshowedthatbothmetalionscausedtheaggregationofWPIemulsion,increasedthecontentofWPIattheoil-water25interfaceandtheencapsulationefficiencyofvitaminEintheoildroplets.Thehigherthe2+2+concentrationsofCaandFe,thehighertheencapsulationefficiencyofvitaminE.Bothmetalions2+didnotaffecttheprotectiveeffectofWPIemulsionagainstlossofvitaminE,exceptthatFeimprovedthestabilityofvitaminEinthemediumofstorage.Keywords:emulsion;vitaminE;encapsulation;metalion;stability300引言维生素E（VitaminE）是一种人体必需的脂溶性维生素，作为人体内最丰富的亲脂性自[1]由基清除剂而起到重要的抗氧化作用。维生素E被广泛应用于由氧化应激引起的多种慢性疾病（如动脉粥样硬化、冠心病等心脑血管疾病）的预防及治疗。然而，维生素E对热、[2,3]35氧、金属离子等因素敏感，易于发生氧化和寡聚。脂溶性和环境敏感性限制了维生素E[4]在食品、医药和化妆品工业中的应用。因此，设计可食用载体体系对维生素E分进行包埋和保护，是发展基于其的功能性产品的关键。乳清蛋白是乳蛋白中除酪蛋白外另一类重要蛋白质，主要包含-乳球蛋白和-乳白蛋白。乳清蛋白具有良好的乳化性、凝胶性、持水性等功能特性，并可以结合金属离子、生物基金项目：国家自然科学基金（31571781）作者简介：范祺（1990-），男，硕士，主要研究方向：活性物质的包埋与保护通信联系人：梁丽（1979-），女，教授、博导，生物大分子结构与功能、食品组分与物性.E-mail:liliang@jiangnan.edu.cn-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn40活性物质、多糖等，具有良好的反应特性。因此，乳清蛋白组装体已被广泛用作生物活性物[5]质载体。维生素E既可以溶解于乳清蛋白水包油（O/W）型乳状液的内部油相，也可以和[6]-乳球蛋白反应生成复合物，溶解于水相，并改善稳定性。金属离子会对蛋白质乳状液的结构和氧化稳定性造成影响。金属离子与蛋白质发生反[7,8]应，诱导蛋白质聚集、交联甚至凝胶化。这一方面可能会影响乳状液的物理稳定性；另45一方面使得油-水界面蛋白层加厚，将有利于加强对内部油相的保护。另外，过渡金属离子（如铁、铜等）除了与蛋白质反应外，还具有氧化还原特性，会导致脂质的过氧化反应，因[9,10,11]而影响活性成分的稳定性。因此，研究蛋白质乳状液中活性成分包埋和保护对金属离子的响应性不但有利于评价乳状液作为载体的有效性，而且可以进一步探讨蛋白质-金属离子反应诱导的乳状液再组装用于开发新颖载体体系的可能性。2+2+50本文选取钙离子（Ca）和亚铁离子（Fe）为模型，通过研究两种金属离子对WPI稳定的O/W型乳状液的粒径和电位的影响、以及对维生素E包埋和保护的影响，揭示WPI乳状液作为维生素E载体的优缺点，为进一步选择具有高包埋率、高保护作用的体系提供依据。1材料与方法551.1材料乳清分离蛋白（WPI，纯度92%）购于美国戴维斯柯（Davisco）食品国际公司；葵花籽油（多力）、蒸馏水（屈臣氏）购于无锡华润超市；(+)α-生育酚（1000IU/g）、维生素E乙酸酯（色谱级，纯度>96%）购于Sigma-Aldrich公司；无水乙醇（AR）、甲醇（色谱纯）、正己烷（AR）、盐酸（AR）、氢氧化钠（AR）、氯化钙（AR）、四水合氯化亚铁（AR）60购于江苏汉邦科技有限公司；其他实验试剂均采用分析级。1.2实验仪器AH2100高压均质机、高速剪切乳化均质仪：ATS工业系统有限公司；紫外可见分光光度计：美国瓦里安有限公司；DC-24型氮吹仪：上海安谱科学仪器有限公司；冷冻离心机（5804R）：艾本德中国有限公司；Waters高效液相色谱（1525双泵、2489紫外检测器）：65美国沃特世公司；动态光散射（NanoZS）：英国马尔文有限公司；磁力搅拌器：德国IKA公司；恒温培养箱：上海精学科学仪器有限公司。1.3实验方法1.3.1乳状液的制备配制2%（w/w）的WPI母液，室温下缓慢搅拌1小时以保证蛋白质充分溶解，将pH°70值调节至7.0后放入4C冰箱保存待用。准确称取0.24g维生素E与2.16g葵花籽油混合均匀。将WPI的中性溶液与含有维生素E的葵花籽油按一定比例混合，然后加入金属离子水溶液均匀混合，使整体体系质量达到60g。通过高速剪切乳化均质仪以10,000rpm的转速°剪切1min制成粗乳液；再用AH2100高压均质机在500bar、4C条件下均质两次制备乳状-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn液。最终的乳状液体系为：蛋白浓度为1%（w/w）、油的含量为4%（w/w）、维生素E在2+2+75油相中含量为10%，Ca和Fe的浓度为50、100、200、400、800μM。所有的样品均进行三次重复制备以用于同一测定。1.3.2粒径和ζ-电位的测定采用动态光散射（DLS）法用于WPI乳状液的表征。取20μLWPI乳状液样品，用相应pH值的水溶液稀释100倍。在25℃条件下，激光衍射角为173°、折射指数为1.450测定80样品的粒径分布及ζ-电位。1.3.3界面蛋白的测定界面蛋白的测定采用间接法，将WPI乳状液在4°C条件下采用高速离心13,000g、30min进行相分离后，采用考马斯亮蓝法快速测定蛋白的总含量以及离心后下清液中蛋白的含量，然后根据下面公式计算界面蛋白含量：C清85界面蛋白含量（%）(1)100C0其中，C0为配制乳状液时加入蛋白的总含量；C清为离心以后下清液中蛋白的含量。1.3.4维生素E含量的测定采用液-液萃取法提取WPI乳状液中的维生素E，然后通过液相色谱（HPLC）法测定[6,12]其含量。HPLC测定乳状液体系中维生素E方法基于已有文献并改进，简述如下：将0.490mL乳状液与0.4mL10mM维生素E乙酸酯（内标）的无水乙醇溶液涡旋15s混匀；加入°4mL正己烷，高速剪切（10,000rpm）1min，于4C、2,500g离心5min后，吸取上层清液1mL氮气吹干后再加入2mL甲醇涡旋30s并静置约45min重新溶解；然后过220nm有机膜进行液相色谱分析含量。色谱条件：C18色谱柱（5μm，4.6mm×250mm，Waters）；流动相为100%甲醇；流速1mL/min；紫外检测波长292nm；进样量10μL。维生素E和维95生素E乙酸酯的色谱图见图1。VEVE乙酸酯AU024681012洗脱时间（分钟）图1维生素E（VE）和维生素E乙酸酯（VE乙酸酯）的HPLC谱图Fig.1HPLCchromatogramofvitaminEandvitaminEacetate-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn1.3.5维生素E包埋率的测定°100将WPI乳状液于4C、13,000g离心30min，移取下层清液，通过1.3.4实验方法测定清液和整体乳状液中维生素E的含量。维生素E的包埋率按以下公式计算：C清维生素E包埋率（%）(1)100CO其中，C0为乳状液中维生素E的总含量；C清为离心以后下清液中维生素E的含量。1.3.6数据处理105所有数据用Origin8.6软件绘图，采用SPSS19.0软件处理软件中t-test方法进行显著性分析。2结果与讨论2.1WPI乳状液结构的金属离子依赖性2.1.1乳状液的粒径分布2+2+110如图2所示，WPI乳状液的粒径在约206nm处有一单峰分布。Ca和Fe加入对WPI乳状液粒径具有相似的影响。随着两种金属离子浓度增加至800μM时，206nm处的单峰分2+2+布没有发生明显的变化。但是当Ca和Fe浓度增加至200μM时，在约5,000nm处出现一小峰，其粒径大小随着金属离子浓度的增加而增加，且强度增加，表明金属离子诱导乳状液的聚集程度增加。1152+2+图2不同浓度的Ca（A）和Fe（B）对1%WPI乳状液的粒径分布的影响2+2+Fig.2InfluenceofCa(A)andFe(B)atvariousconcentrationsonsizedistributionof1%WPIemulsions2.1.2电位由于-乳球蛋白和-乳白蛋白等乳清蛋白主要成分的等电点接近于pH5.0，因此乳清分2+120离蛋白稳定的乳状液带负电荷。如表1所示，WPI乳状液的-电位约-41mV。随着Ca和2+Fe两种金属离子浓度增加至200μM，WPI乳状液的-电位没有发生明显的变化。当进一步-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn增加它们的浓度时导致电位值略有降低。在中性条件下，带正电荷的金属离子可以与带负电[7,13]荷的WPI反应。金属离子通过屏蔽效应或盐桥作用诱导蛋白质交联、导致进一步聚集。2+2但是，即使Ca和Fe的浓度为800μM时，WPI乳状液的电位值仍为约-37.0mV。当粒子[14]125的-电位绝对值大于30mV时，粒子通常被认为是稳定。WPI乳状液所带负电荷提供粒子间静电斥力，使得乳状液油滴稳定分散在溶液中。2+2+表1不同浓度的Ca和Fe对1%WPI乳状液的-电位的影响2+2+Tab.1InfluenceofCaandFeatvariousconcentrationson-potentialoftheemulsionsstabilizedby1%WPI-电位（mV）0μM50μM100μM200μM400μM800μM2+aaabbCa-40.6±1.05-40.5±0.74-40.8±1.20-39.0±1.08-38.8±0.97-36.7±0.292+aaabbFe-40.6±1.05-41.2±1.18-40.7±0.91-39.8±1.25-38.0±1.04-37.0±0.36注：每行中不同的字母代表不同的显著性，P<0.05130Note:Differentlettersinthesamerowrepresentdifferentsignificancelevel(P<0.05).2.1.3界面蛋白含量2+2+如表2所示，WPI乳状液中界面蛋白含量约为60%，随着Ca和Fe浓度的增加，界2+2+面蛋白含量逐渐增加。当Ca为50μM时乳状液的界面蛋白含量约为62%，随着Ca浓度2+增加至800μM时界面WPI含量增加至约72%。对于Fe，在50μM时界面WPI含量约为13562%，在800μM时增加至约72%。比较可知，两种金属离子对乳状液的界面蛋白含量的影响相似。2+2+表2加入不同浓度Ca和Fe后1%WPI乳状液体系的界面蛋白含量Tab.2ContentsofWPIattheoil-waterinterfaceoftheemulsionsstabilizedbytheproteinat1%intheabsence2+2+andpresenceofCaandFeatvariousconcentrations界面蛋白含量（%）0μM50μM100μM200μM400μM800μM2+abcccdCa60.08±0.3662.92±0.5766.25±0.3466.36±0.5967.93±0.6772.54±0.462+abccdeFe60.08±0.3662.58±0.2965.79±0.3565.43±0.6269.85±0.6672.32±0.63140注：每行中不同的字母代表不同的显著性，P<0.05Note:Differentletterinthesamerowrepresentsdifferentsignificancelevel(P<0.05).2+2+结合上述金属离子对WPI乳状液结构的影响可知，Ca和Fe的加入诱导了乳状液粒子间聚集，吸附更多连续相中蛋白聚集于油-水界面层，且该现象随金属离子的浓度增加而变得更加显著。1452.2金属离子对维生素E包埋率的影响2+2+如表3所示，维生素E在WPI乳状液中包埋率约为84%。随着Ca和Fe浓度增加，2+维生素E的包埋率逐渐增加。当Ca浓度为50μM时，维生素E的包埋率增加至约85%；2+当浓度增加至800μM时，包埋率继续增加至92%。当Fe浓度为50μM时，维生素E的包埋率增加至约84%；在800μM时包埋率增加至约91%。比较可知，两种金属离子对维生素150E包埋率的影响相似。-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn2+2+表3加入不同浓度Ca、Fe后WPI乳状液体系中维生素E的包埋率Tab.3EncapsulationefficienciesofvitaminEintheemulsionsstabilizedby1%WPIintheabsenceandpresence2+2+ofCaandFeatvariousconcentrations维生素E包埋率（%）0μM50μM100μM200μM400μM800μM2+aabbbccCa83.79±1.7685.26±1.7188.33±1.0588.39±1.6789.07±0.9391.57±1.052+aabbbccFe83.79±1.7684.19±1.8886.93±1.4187.48±2.1190.87±2.1491.25±1.14注：每行中不同的字母代表不同的显著性，P<0.05155Note:Differentlettersinthesamerowrepresentdifferentsignificancelevel(P<0.05).结合表2和3结果可知，金属离子对WPI乳状液的界面蛋白含量与维生素E包埋率的影响呈正相关性。维生素E已被报道可以和乳清蛋白的主要成分发生反应形成复合物。由于维生素E的脂溶性，其应与乳清分离蛋白结合分散在连续相中。随着金属离子浓度增加，界面蛋白含量增加，将连续相中与蛋白质结合的维生素E以复合物的形式“转运”到乳状液相160界面，从而提高了乳状液体系对维生素E的包封率。这种“转运”的思想已在文献中被报道，[15]Zhi-Li等人通过添加水溶性的甜菊苷与白藜芦醇形成复合物，并以复合物的形式将两亲性的白藜芦醇定向转运至蛋白界面。2.3金属离子对维生素E稳定性的影响2+图3A为Ca加入对WPI乳状液中维生素E稳定性的影响。由图可知，相比于对照组，2+165在室温下储藏25天的过程中，随着Ca浓度增加至400M基本对维生素E的残留率没有2+明显的影响；在室温下储藏至18天，800MCa也基本没有影响维生素E的残留率。这些2+2+结果表明Ca的加入没有影响乳状液体系对维生素E的保护效果。只有800μMCa体系在贮藏至第25天时，样品发生分层，因此未测定维生素E残留率。-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn170注：“#”表示800μM体系，样品分层未测定2+Note:“#”representstheemulsionwith800μMFe,whichwerenottestedduetothecreaming.2+2+图3不同浓度Ca（A）和Fe（B）对室温贮藏时1%WPI乳状液中维生素E的稳定性2+2+Fig.3StabilityofvitaminEintheemulsionsstabilizedby1%WPIintheabsenceandpresenceofCaandFeat175variousconcentrationsduringstorageatambienttemperature.2+图3B为Fe对乳状液中维生素E稳定性的影响。相比于对照组，除了在9-18天维生素2+E的残留率发生变化外，加入Fe后整体对维生素E保留率的影响并不明显。当贮藏至第92+天时，随着Fe浓度增加，维生素E的保留率略高于对照组，但差异并不显著；当贮藏至第2+2+13天时，随着Fe浓度增加，维生素E残留率增加，在800MFe时为95%，明显高于对2+180照组的85%；但继续贮藏至第18天时，随着Fe对维生素E残留率的影响又减小，变得不2+十分显著。当Fe浓度为800μM时贮藏至第25天时样品发生分层，因此未进行包埋率分2+析。这些结果表明，Fe对维生素E有一定的保护作用，这可能与其还原性有关。2+[16,17][18,19,20]2+Fe具有还原性，其在乳状液体系中已被报道表现出抗氧化特性。因此，Fe2+对维生素E有一定的保护作用。这与Fe的加入延缓了乳状液中番茄红素的降解速率的报道[18]3+185一致。然而，Boon等人通过啡啰嗪与Fe形成红色稳定化合物的特性，测定了在乳状液2+3+[18]2+贮藏过程中Fe与Fe之间的转变。在WPI乳状液体系贮藏的过程中，部分Fe被氧化3+为Fe，从而降低了在贮藏后期对乳状液的保护作用。2+综上所述，在研究范围内，Fe可对乳状液体系呈抗氧化特性，但这取决于体系的贮藏2+2+时间，即取决于Fe在体系中的相对含量；Ca对乳状液体系的氧化稳定性没有影响。已有2+[7,13]190研究表明，Ca主要改变乳状液的微观物理结构，诱导蛋白质的聚集，没有对乳状液的2+氧化稳定性造成影响。然而，对于带有相同电荷的Fe，由于其氧化还原特性而在一定研究[19]2+[21]范围内呈现抗氧化性，但也有研究表明Fe会降低乳状液的氧化稳定性。这也印证了-7- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn2+上述结果，Fe在乳状液体系中的氧化还原特性具有条件依赖性，与其相对添加浓度、贮藏时间密切相关。1953主要结论2+2+实验研究了亚铁离子（Fe）和钙离子（Ca）对1%WPI乳状液中维生素E包埋和保护的影响，主要得出以下结论：2+2+1）Fe或Ca的加入诱导WPI乳状液聚集，且离子价态越高、浓度越大，对体系粒径分布和-电位的影响越明显；2+2+2002）Fe或Ca增加了WPI乳状液的界面蛋白含量和维生素E的包埋率，离子价态越高、浓度越大，影响越显著；2+2+3）Fe的加入提高了乳状液体系的氧化稳定性，这种影响随着Fe浓度越高越明显，但具有时间依赖性；2+4）Ca的加入没有影响乳状液体系的氧化稳定性。205[参考文献](References)[1]NikiE.RoleofvitaminEasalipid-solubleperoxylradicalscavenger:invitroandinvivoevidence[J].FreeRadicalBiology&Medicine,2014,66(2),3.[2]BrigeliusflohéR,TraberMG.VitaminE:functionandmetabolism[J].FasebJournal,1999,13(10):1145-55.[3]ListedN.TheeffectofvitaminEandbetacaroteneontheincidenceoflungcancerandothercancersinmale210smokers.TheAlpha-Tocopherol,BetaCaroteneCancerPreventionStudyGroup[J].NewEnglandJournalofMedicine,1994,330(15):1029-35.[4]YooSH,SongYB,ChangPS,LeeHG.Microencapsulationofalpha-tocopherolusingsodiumalginateanditscontrolledreleaseproperties[J].InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,2006,38(1):25-30.[5]WangL,GaoY,LiJ,SubiradeM,SongY,LiangL.Effectofresveratrolorascorbicacidonthestabilityof215α-tocopherolinO/Wemulsionsstabilizedbywheyproteinisolate:Simultaneousencapsulationofthevitaminandtheprotectiveantioxidant[J].FoodChemistry,2016,196(4):466-474.[6]LiangL.Characterisationoftheβ-lactoglobulin/α-tocopherolcomplexanditsimpactonα-tocopherolstability[J].FoodChemistry,2011,126(3):821-826.[7]RadfordSJ,DickinsonE,GoldingM.Stabilityandrheologyofemulsionscontainingsodiumcaseinate:220combinedeffectsofioniccalciumandalcohol[J].JournalofColloid&InterfaceScience,2004,274(274):673-686.[8]AlamedJ,McclementsDJ,DeckerEA.InfluenceofheatprocessingandcalciumionsontheabilityofEDTAtoinhibitlipidoxidationinoil-in-wateremulsionscontainingomega-3fattyacids[J].FoodChemistry,2006,95(4):585-590.[9]Paiva-MartinsF,GordonMH.EffectsofpHandferricionsontheantioxidantactivityofolivepolyphenolsin225oil-in-wateremulsions[J].JournaloftheAmericanOilChemists"Society,2002,79(6):571-576.[10]KeceliT,GordonMH.Ferricionsreducetheantioxidantactivityofthephenolicfractionofvirginoliveoil[J].JournalofFoodScience,2006,67(3):943-947.[11]WangG,WangT.OxidativestabilityofeggandsoylecithinasaffectedbytransitionmetalionsandpHinemulsion[J].JournalofAgricultural&FoodChemistry,2008,56(56):11424-11431.230[12]LiL,ValerieLSL,GabrielER,MurielS.Invitroreleaseofα-tocopherolfromemulsion-loadedβ-lactoglobulingels[J].InternationalDairyJournal,2010,20(3):176-181.[13]DickinsonE,GoldingM.Influenceofcalciumionsoncreamingandrheologyofemulsionscontainingsodiumcaseinate[J].Colloids&SurfacesAPhysicochemical&EngineeringAspects,1998,144(1-3):167-177.[14]BakryAM,FangZ,NiY,ChengH,ChenYQ,LiangL.Stabilityoftunaoilandtunaoil/peppermintoil235blendmicroencapsulatedusingwheyproteinisolateincombinationwithcarboxymethylcelluloseorpullulan[J].FoodHydrocolloids,2016,60:559-571.[15]WanZL,WangJM,WangLY,YangXQ,YuanY.Enhancedphysicalandoxidativestabilitiesofsoyprotein-basedemulsionsbyincorporationofawater-solublestevioside-resveratrolcomplex[J].JournalofAgricultural&FoodChemistry,2013,61(18):4433-40.240[16]EaryLE,RaiD.Chromateremovalfromaqueouswastesbyreductionwithferrousion[J].EnvironmentalScience&Technology,1988,22(8):972-7.[17]RaoSK,ArtzWE.Effectofextrusiononlipidoxidation[J].JournalofFoodScience,2006,54(6):1580-1583.[18]BoonC.S,McclementsDJ,WeissJ,DeckerEA.Roleofironandhydroperoxidesinthedegradationof245lycopeneinoil-in-wateremulsions[J].JournalofAgricultural&FoodChemistry,2009,57(7):2993-8.-8- 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