厌氧氨氧化菌Ca. Brocadia胞外聚合物的荧光特性及来源探究.pdf 6页

'中国http://www.paper.edu.cn科技论文在线厌氧氨氧化菌Ca.Brocadia胞外聚合物的#荧光特性及来源探究**冯瑛，刘思彤5（北京大学环境科学与工程学院，北京100871）摘要：本研究旨在探究厌氧氨氧化菌Ca.Brocaida胞外聚合物自发荧光的来源与特性，采用荧光原位杂交、三维荧光光谱、高效液相、标准加入法等技术手段证明其352/464nm和442/521nm两种荧光的物质来源分别为细胞代谢物辅酶NADH和核黄素的胞外分泌，并发现Ca.Brocadia型厌氧氨氧化污泥中荧光物质的含量高于硝化污泥以及Ca.Jettenia型厌氧氨10氧化污泥。这对于深入探究Ca.Brocadia的代谢机制以及污泥菌群结构的表征具有重要意义。关键词：环境工程；Ca.Brocadia；自发荧光；胞外聚合物；来源中图分类号：X703Insightintoautofluorescencecharacteristicsandsourceof15extracellularpolymericsubstancesreleasedbyanammoxbacteriaCa.BrocadiaFENGYing,LIUSitong(DepartmentofEnvironmentalEngineering,PekingUniversity,Beijing100871)Abstract:Inthispaper,autofluorescencecharacteristicsandsourceofextracellularpolymeric20substancesreleasedbyanammoxbacteriaCa.Brocadiawasinvestigated.CoenzymeNADHandriboflavinwereverifiedasthesourcesofautofluorescence(352/464nmand442/521nm)viafluorescentinsituhybridization,excitation-emissionmatrixfluorescentspectroscopy,HPLCandstandardadditionmethod.AnditwasfoundthatfluorescentsubstancescontentswerehigherinCa.BrocadiathaninnitrifyingsludgeandCa.Jettenia.ItwasofgreatimportanceforexploringCa.Brocadiametabolic25mechanismandcharacterizingsludgecommunitystructure.Keywords:Environmentalengineering;Ca.Brocadia;autofluorescence;extracellularpolymericsubstances;source0引言30在微生物废水处理系统，污泥中很多种类的细菌都会分泌胞外聚合物（Extracellularpolymericsubstances,EPS）。EPS是一种大分子聚合物，主要成分为多糖和蛋白质，它包被在菌体的表面，通过二价离子间的桥联和静电作用使菌体紧密地结合在一起，从而有利于微生物聚集体的形成，其含量和成分决定着微生物聚集体的表面特性、传质效率、絮凝性能、[1]沉降性能等。35在污泥的EPS中，通常含有大量芳香环结构和不饱和脂肪链，这些结构往往含有很多荧光基团。三维荧光光谱分析结果表明，用城镇污水处理厂的活性污泥提取出来的EPS呈现出三个主要的自发荧光峰，它们分别为类蛋白荧光（Ex/Em=225-237/340-381nm）、色氨[2]酸类荧光（Ex/Em=275/340nm）以及类腐殖酸荧光（Ex/Em=330-340/420-430nm）。Kartal基金项目：教育部博士点基金（No:20130001120011）;国家自然科学基金委基金（No.51308007）作者简介：冯瑛（1994-），女，在读硕士研究生，主要研究方向：Anammox高效污水处理技术通信联系人：刘思彤（1983-），研究员，博导，主要研究方向：Anammox高效污水处理技术.E-mail:liusitong@iee.pku.edu.cn-1- 中国http://www.paper.edu.cn科技论文在线[3]等人对厌氧氨氧化污泥进行研究时，发现CandidatusBrocadia这种菌非常特殊，它的EPS40存在着与一般活性污泥所不同的自发荧光，其激发波长（Ex）为352nm和442nm，发射波长（Em）为464nm和521nm。对于CandidatusBrocadia的这种特殊的自发荧光，它的荧光特性、影响因素以及物质来源等都有待于深入探究。本研究运用超滤离心、荧光原位杂交、标准加入法、高效液相色谱等方法分析了Ca.Brocadia胞外聚合物产生的352/464nm和442/521nm两种荧光的物质来源，并探究了相应45的荧光特性，对于深入探讨Ca.Brocadia的代谢机制、菌群行为以及更好地调控Ca.Brocadia厌氧氨氧化反应器的运行具有重要意义。1材料与方法1.1厌氧氨氧化污泥胞外聚合物的提取[4]厌氧氨氧化菌胞外聚合物采用阳离子交换树脂法进行提取。首先，将厌氧氨氧化污泥50在4000g下离心10min，弃去上清液，沉淀用0.1MNaCl溶液清洗三次。再将清洗后的污泥沉淀稀释至一定体积，按70g/gVSS的比例加入阳离子交换树脂。将体系置于摇床内进行EPS提取，温度设为4℃，转速设为200rpm。3h后取出，静置3min后，吸取上清，9000g下离心20min。将离心后的上清用0.45μm的醋酸纤维膜过滤后即得EPS溶液。1.2荧光原位杂交55本实验中，荧光原位杂交（Fluorescenceinsituhybridization，FISH）选用针对浮霉状菌的通用探针Pla46，采用Cy5荧光染料进行5’末端标记，激发和发射波长分别为630nm和670nm。该探针由英俊公司（InvitrogenCompany,China）合成，其序列如下：5’-GACTTGCATGCCTAATCC-3’。1.3三维荧光光谱的测定60采用日立F7000荧光分光光度计进行三维荧光光谱（Excitation-emissionmatrix，EEM）测定。激发波长Ex扫描范围为200-500nm，采样间隔为5nm；发射波长Em扫描范围为300-600nm，采样间隔为2nm，狭缝宽度均为5nm。扫描速度为1200nm/min，PMT电压为600V。测样时，样品置于与仪器配套使用的石英池内，采用290nm滤光片消除二级瑞利散射。651.4辅酶NADH与核黄素的测定辅酶NADH采用试剂盒法进行测定，辅酶NAD(H)含量试剂盒购自索莱宝生物科技有限公司。核黄素采用HPLC进行测定，色谱柱为EclipseXDB-C18型（4.6*260mm），采用FLD检测器（Ex/Em=440/525nm），进样量为10μL，流速0.8ml/min。2结果与讨论702.1厌氧氨氧化污泥胞外聚合物的荧光特性用CY5标记的荧光探针对Ca.Brocadia进行荧光原位杂交，在激光共聚焦显微镜下可清晰地观察到细菌EPS所发出的绿色荧光，如图1所示。EPS紧密地包裹在厌氧氨氧化菌-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn外，形成空间网状结构。575图1厌氧氨氧化菌荧光原位杂交图（红色为厌氧氨氧化菌，绿色为胞外聚合物自发荧光）Fig.1FISHimageofanammoxbacteria(redrepresentanammoxbacteria,greenrepresentautofluorescenceofEPSreleasedbyanammoxbacteria)为进一步探究厌氧氨氧化菌胞外聚合物自发荧光的特性，采用离子交换树脂法提取Ca.80Brocadia型厌氧氨氧化污泥的胞外聚合物，用三维荧光光谱进行表征，结果如图2所示。图2厌氧氨氧化菌EPS三维荧光光谱Fig.2EEMfluorescencespectraofanammoxbacteriaEPS585由图2可知，Ca.Brocadia型厌氧氨氧化污泥的胞外聚合物具有强烈的自发荧光特性，用三维荧光光谱检测到的荧光峰主要有4个，即荧光峰A（Ex/Em=220-225/336-348nm），荧光峰B（Ex/Em=275-280/340-346nm），荧光峰C（Ex/Em=352/464nm）和荧光峰D5（Ex/Em=442/521nm）。其中，荧光峰A和B分别代表芳香类蛋白和色氨酸类蛋白及可溶性微生物副产物所发荧光，与普通城市污水处理厂的活性污泥的荧光峰类似，由反应器中的90厌氧氨氧化菌和其它微生物所含有的荧光物质共同产生；而荧光峰C和D属于类腐殖酸所[5]发荧光，而且即为文献中所报道的Ca.Brocadia胞外聚合物所产生的特殊的自发荧光。2.2厌氧氨氧化污泥胞外聚合物自发荧光来源为探究Ca.Brocadia胞外聚合物产生的352/464nm和442/521nm两种荧光的物质来源，-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn本研究首先运用超滤离心的方法将胞外聚合物中分子量小于3000MW、3000MW至1000095MW、大于10000MW的物质进行分级分离，对这三种范围分子量的物质进行三维荧光光谱扫描，结果如图3所示。图3不同分子量范围胞外聚合物的三维荧光光谱图0（a）＜1000MW（b）3000-10000MW（c）＞10000MW100Fig.3EEMfluorescencespectraofanammoxbacteriaEPSwithdifferentmolecularweight（a）<1000MW（b）3000-10000MW（c）＞10000MW结果表明，两种荧光峰集中在小于3000MW的范围内，说明这两种荧光物质的分子量均小于3000MW，进一步缩小了物质范围。再结合荧光的激发发射波长，猜想这两种物质[6][7]105分别为细菌代谢物辅酶NADH（Ex/Em=335/464nm）和核黄素（Ex/Em=440/534nm）。接下来，为验证该猜想，本研究采用标准加入法，向体系中加入一定量的辅酶NADH0和核黄素标准品，用三维荧光光谱分别表征了辅酶NADH、核黄素标准溶液以及加入标准溶液前后EPS的三维荧光光谱，结果如图4所示。0110图4标准加入法三维荧光光谱图（a）辅酶NADH标准液（b）核黄素标准液（c）加入标准物前胞外聚合物溶液（d）加入标准物后胞外聚合物溶液Fig.4EEMfluorescencespectraofstandardadditionmethod（a）CoenzymeNADHstandardsolution（b）5riboflavinstandardsolution（c）EPSwithoutstandardsolution（d）EPSwithstandardsolution5115加入标准品前后的三维荧光光谱对比结果表明，Ca.Brocadia胞外聚合物所产生的荧光峰C（Ex/Em=352/464nm）与辅酶NADH荧光峰的位置相重合，荧光峰D（Ex/Em=442/5210nm）与核黄素荧光峰的位置相重合，即这两种荧光峰分别由对应的两种物质产生，初步验-4- 中国http://www.paper.edu.cn科技论文在线证了上述猜想。最后，为进一步证实该猜想的科学性，分别采用试剂盒法和高效液相法检测到了EPS120中辅酶NADH和核黄素的含量，探明了Ca.Brocadia胞外聚合物产生的352/464nm和442/521nm两种荧光的物质来源。辅酶NADH是一种细胞代谢物，广泛存在于动物、植物、+微生物和培养细胞中，NAD是糖酵解和三羧酸循环（TCA）的主要氢受体，在细胞的能量[8]代谢中起着重要作用。而核黄素是辅酶黄素单核苷酸（FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）中的荧光基团，NADH可以将氢传递给FMN或FAD而生成还原型FMNH2和FADH2，核[9,10]125黄素的荧光变化显示了FMN或FAD浓度的变化。而Ca.Brocadia胞外聚合物产生的荧光则主要来源于辅酶NADH和核黄素的胞外分泌，且与细菌的代谢水平密切相关。2.3不同污泥中荧光物质的含量比较分别采用Ca.Brocadia型厌氧氨氧化污泥、Ca.Jettenia型厌氧氨氧化污泥以及硝化污泥进行胞外聚合物的提取，并测定了其胞外聚合物中辅酶NADH和核黄素这两种荧光物质的130含量，结果如图5所示。图5不同种类污泥中辅酶NADH与核黄素含量Fig.5CoenzymeNADHandriboflavincontentsindifferentsludges135图5所示结果表明，对于辅酶NADH，其含量Ca.Brocadia菌群＞硝化污泥＞Ca.Jettenia菌群。结合污泥活性和反应器脱氮能力的数据，可以发现荧光物质含量与这三种污泥的代谢水平呈现出相一致的趋势。而对于核黄素，Ca.Brocadia菌群与硝化污泥的含量相近，且明显高于Ca.Jettenia菌群的含量。综上结果表明，Ca.Brocadia在厌氧氨氧化菌中比较特殊，可以向胞外分泌较多辅酶NADH和核黄素等荧光物质，体现出胞外聚合物自发荧光的特性，140且荧光越强，荧光物质含量越高，污泥的代谢水平也更高。因此，352/464nm和442/521nm这两种特殊的荧光可以在一定程度上灵敏地反映厌氧氨氧化污泥的代谢水平，并对菌种组成具有一定指示作用。3结论（1）Ca.Brocadia型厌氧氨氧化污泥的胞外聚合物具有强烈的自发荧光特性，用三维荧光145光谱检测到的荧光峰主要有4个，包括两种类蛋白荧光峰两种类腐殖酸荧光峰。（2）通过标准加入法、高效液相等方法证明Ca.Brocadia胞外聚合物产生的352/464nm和442/521nm两种荧光分别来源于辅酶NADH和核黄素的胞外分泌。-5- 中国http://www.paper.edu.cn科技论文在线（3）在Ca.Brocadia型厌氧氨氧化污泥中的分泌水平高于其它厌氧氨氧化污泥与硝化污泥,352/464nm和442/521nm这两种特殊的荧光可以在一定程度上灵敏地反映厌氧氨氧化污150泥的代谢水平，并对菌种组成具有一定指示作用。致谢本工作受到教育部博士点基金（No:20130001120011）的资助，特此致谢！[参考文献](References)[1]刘晓猛.微生物聚集体的相互作用及形成机制[D].合肥：中国科学技术大学，2008.155[2]姚萌，罗红元，谢小青等.城市污水厂活性污泥胞外聚合物的三维荧光特性分析[J].中国环境科学，2012，32(1)：94-99.[3]KartalB,VanNiftrikL,RattrayJ,etal.Candidatus"Brocadiafulgida":anautofluorescentanaerobicammoniumoxidizingbacterium[J].FEMSMicrobiologyEcology,2008,63(1):46-55.[4]HouX,LiuS,ZhangZ.Roleofextracellularpolymericsubstanceindeterminingthehighaggregationability160ofanammoxsludge[J].Waterresearch,2015,75:51-62.[5]ChenW,WesterhoffP,LeenheerJA,etal.Fluorescenceexcitation-emissionmatrixregionalintegrationtoquantifyspectrafordissolvedorganicmatter[j].Environmentalscience&technology,2003,37(24):5701-5710.[6]Wos,M.,&Pollard,P.SensitiveandmeaningfulmeasuresofbacterialmetabolicactivityusingNADHfluorescence[J].WaterResearch,2006,40(10):2084-2092.165[7]Marsili,E.,Baron,D.B.,Shikhare,I.D.,Coursolle,D.,Gralnick,J.a,&Bond,D.R.Shewanellasecretesflavinsthatmediateextracellularelectrontransfer[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2008,105(10):3968-3973.[8]张积仁.辅酶NADH保护和修复细胞损伤的研究[J].解放军医学杂志，2002，(03)：189-191.[9]Yong,Y.C.,Cai,Z.,Yu,Y.Y.,Chen,P.,Jiang,R.,Cao,B.,…Song,H.Increaseofriboflavinbiosynthesis170underliesenhancementofextracellularelectrontransferofShewanellainalkalinemicrobialfuelcells[J].BioresourceTechnology,2013,130,763-768.[10]Zhang,Y.,Liu,Y.,Hu,M.,&Jiang,Z.Acclimationofthetrichloroethylene-degradinganaerobicgranularsludgeandthedegradationcharacteristicsinanupflowanaerobicsludgeblanketreactor.WaterScienceandTechnology,2014,69(1),120–127.175-6-'