低温辅助超声波诱导活的非可培养状态鼠伤寒沙门氏菌及复苏研究.pdf 9页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn低温辅助超声波诱导活的非可培养状态鼠#伤寒沙门氏菌及复苏研究**蒋丽芬，廖红梅5（江南大学食品学院，无锡214122）摘要：低温辅助超声波（Thermosonication,TS）对于液态食品的杀菌已经有较为广泛的研究，但已有研究表明其在某些超声处理条件下会诱导细菌进入活的非可培养（VBNC）状态，这对食品安全和公共卫生构成了严重的威胁。且目前并无研究对TS诱导的细菌VBNC状态进行准确定量。本文结合反转录定量PCR（RT-qPCR）技术和平板计数法构建了VBNC态鼠10伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium）的定量检测方法，并探讨了TS对诱导VBNC态S.typhimurium的情况和复苏条件。结果表明：通过RT-qPCR测得的活菌总数和平板计数法测得可培养数差值可准确定量检测VBNC态细菌数量；在52℃、380W的条件下对纯培养体系中的S.typhimurium处理60min可使其进入VBNC状态；处于VBNC态的S.typhimurium最佳复苏温度为37℃。15关键词：低温辅助超声波；活的非可培养状态；鼠伤寒沙门氏菌；诱导；复苏中图分类号：TS201.3InductionofaViablebutNon-culturableStateinSalmonellatyphimuriumbyThermosonicationandResuscitation20JIANGLifen,LIAOHongmei(SchoolofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi214122)Abstract:Thermosonication(TS)isanon-thermaltechniqueusedforliquidfoodpreservation.However,ultrasoundprocessingmayinducepathogenicbacteriaintoaviablebutnon-culturable(VBNC)state,thusposingafoodsafetyandpublichealthrisk.Andtherearenoreportsonthequantitativedetectionof25VBNCstatebacteriainducedbyTS.Inthisstudy,theVBNCoccurrenceofS.typhimuriuminducedbyTStreatmentwasinvestigatedbyplatecountingmethodandreversetranscriptionquantitativePCR(RT-qPCR)assaysandVBNCcellswereresuscitatedbyincubationatdifferenttemperatures.TheresultsshowedthattheVBNCpopulationswerequantifiedusingRT-qPCRandS.typhimuriumwasinducedintotheVBNCstateat52℃for60minwhenexposedtoTSprocessingof380W.Theoptimalgrowth30temperature(i.e.37℃)wasthemostsuitabletemperaturetoresuscitatecellsfromtheVBNCstate.Keywords:Thermosonication;Viablebutnon-culturablestate;Salmonellatyphimurium;Induction;Resuscitation0引言活的非可培养（viablebutnonculturable，VBNC）状态是微生物在不利条件下存活的一35种特殊方式。处于该状态的微生物具有活性，但是失去了在常规培养基上生长繁殖的能力。基金项目：国家自然科学基金（31471714）作者简介：蒋丽芬（1991-），女，硕士研究生，主要研究方向：农产品加工通信联系人：廖红梅（1983-），女，副教授、硕导，主要研究方向：农产品加工.E-mail:hmeiliao@jiangnan.edu.cn-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn目前报道的能够使细菌进入VBNC态的因素主要有低温、高温、寡营养、光照、氧化压力、[1-3]低pH、次氯酸钠、双氧水等。而大多数VBNC态的细胞在一定环境条件下可以复苏，复苏的方法主要分为三种，取消诱导条件或采用与诱导条件相反的复苏条件，向培养基中添加化学物质如自由基清除剂（丙酮酸钠、过氧化氢酶）、吐温20、维生素B、肠杆菌自诱[1,4,5]40导物等，借助宿主实现复苏。因此对于能引起人类疾病的微生物来说，由于存在复苏的风险，VBNC态的病原菌严重威胁大众健康和生命安全。鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium）是国际公认的易引起肠道疾病的食源性致病[1]菌，并且发现其存在VBNC状态。低温辅助超声波（thermosonication,TS）杀菌已经被[6][7]证实具有较好的杀菌效果，但是有报道指出超声可以诱导细菌进入VBNC状态，然而45TS杀菌过程中产生的VBNC态病原菌的定量检测缺乏研究，尤其是S.typhimurium。此外VBNC态的细菌不能用传统的培养方法进行计数，而VBNC态细菌的研究主要集中于依靠[8]染色和镜检的定性研究。反转录定量PCR（RT-qPCR）以RNA模板，因为RNA一般[9]只存活3-5min，可认为仅存在活细胞中，具有操作简便、检测限低、特异性强并可定量[10]的特点，已广泛应用于VBNC态的定量检测。50本文结合RT-qPCR和平板计数法研究TS时间对S.typhimurium的VBNC态诱导作用，并用稀释法观察温度对VBNC态的S.typhimurium复苏的影响。研究结果有助于评估TS杀菌的生物安全性并为改善TS技术提供参考。1材料与方法1.1菌株与培养条件55鼠伤寒沙门氏菌S.typhimurium（CMCC50115）由中国医学细菌保藏管理中心（CMCC）提供。细菌培养采用BPY液体培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L，葡萄糖5g/L，用5mM的NaOH调节pH为7.0，121℃灭菌15min备用。S.typhimurium接种到BPY液体培养基中，37℃培养10h至刚进入稳定生长期。液体培养基60中添加12g/L的琼脂粉即固体培养基，用于平板计数法计算可培养数。1.2试剂与仪器1.2.1试剂蛋白胨、牛肉膏购于北京奥博星生物科技有限公司；酵母粉、氯化钠、葡萄糖、琼脂粉购于国药集团上海化学试剂有限公司；TIANampBacteriaDNAKit购自天根生化科技（北65京）有限公司；细菌RNA提取试剂盒（SimplyPTotalRNAExtractionKit）购于杭州博日公司；RT-qPCR试剂盒（SYBRPremixExTaqTMⅡ（TliRnaseHPlus））、反转录试剂盒（PrimeScriptRTreagentKitWithgDNAEraser）、EASYDilution（forRealTimePCR）均购于日本Takara公司；qPCR试剂盒（QuantiFastSYBRGreenPCR）购于德国Qiagen公司；Live/DeadBaclight试剂购于美国MolecularProbes公司；琼脂糖、引物购于上海生物工程70有限公司。-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn1.2.2实验仪器荧光定量PCR仪：7900HT，美国应用生物系统公司；激光共聚焦荧光显微镜：LSM710，德国CarlZeissAG公司；超声波细胞粉碎机：SCIENTZ-ⅡD，宁波新芝生物科技股份有限公司；低温恒温槽：DC-0506，上海衡平仪器仪表厂；冷冻离心机：TGL-16M，上海卢湘仪75离心机仪器有限公司；生化培养箱：SPX-250B-Z，上海博讯医疗设备厂；立式压力蒸汽灭菌器：LDZX-30KBS，上海申安医疗器械厂；超净工作台：SW-CJ-2D，苏州净化设备有限公司；电泳仪：DYY-8C，上海六一仪器。1.3方法1.3.1VBNC态S.typhimurium的TS诱导780将夹套烧杯用75%酒精浸泡30min，用无菌水冲洗3遍，再用稀释到10CFU/mL的菌液润洗1遍，加入60mL菌液，打开水浴循环，温度达到52℃时启动超声波，在380W功率下进行TS处理60min，每隔5min取样，测定可培养数并立即进行DNA和RNA提取。诱导过程中用qPCR、RT-qPCR和平板计数法定量检测总菌数、活菌数和可培养数的变化，设3次平行。851.3.2DNA/RNA提取取2mLTS处理的菌液于4℃、12000rpm离心2min收集菌体，采用细菌DNA提取试剂盒（天根生化科技，北京）提取DNA，最终得到50μL的DNA样品；采用细菌RNA提取试剂盒（博日公司，杭州）提取RNA，得到最终体积50μL的RNA样品。1.3.3RNA反转录90为排除RNA样品的定量结果中DNA的干扰，用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（Takara，日本）去除基因组DNA，按说明书进行反转录获得cDNA样品。1.3.4qPCR/RT-qPCR检测利用ABI7900定量PCR仪以S.typhimurium的侵染基因invA进行定量检测。扩增序列为：上游引物5’-ACAGTGCTCGTTTACGACC-3’，下游引物5’-95ACTGGTACTGATCGATAAT-3’，扩增片段大小为240bp，引物由上海生工生物有限公司合成。qPCR反应体系20μL，包括2XmasterMix10μL、上、下游引物（10μM）各0.6μL、DNA模板2μL，最后无酶水补足到规定体积。RT-qPCR反应体系20μL，包括Mix8μL、上下游引物（10μM）0.4+0.4μL、模板cDNA2μL，无酶水补足体积。qPCR和RT-qPCR的扩增条件相同：95℃2min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。100实验数据用ABI7900HT随机软件分析，所有样品两次平行。1.3.5总菌数的定量检测将提取的DNA样品用EASYDilution（forRealTimePCR）进行10倍梯度稀释，一0-6共7个梯度10-10，然后将qPCR得到的荧光阈值（CT）与平板计数得到的菌落数的结果进行线性相关性分析建立qPCR与CFU两种计数方法间的标准曲线。总菌数就是CT值105在qPCR标准曲线上相对应的菌落数。-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn1.3.6VBNC态S.typhimurium菌落数的定量检测将反转录得到的cDNA样品用EASYDilution（forRealTimePCR）进行10倍梯度稀0-5释，一共6个梯度10-10，然后将RT-qPCR得到的CT值与平板计数得到的菌落数结果进行线性相关性分析建立RT-qPCR与CFU两种计数方法间的标准曲线。VBNC态细胞110数是CT值在RT-qPCR标曲上对应的活菌数与平板计数法得到的可培养数之间的差值。1.3.7VBNC态S.typhimurium的复苏为排除来自少量未检测到的可培养细菌的再生长导致的复苏，采用稀释法进行复苏研究。取2mLTS（52℃60min380W）诱导进入VBNC态S.typhimurium于12000rpm离心2min收集菌体，用2mL无菌的BPY液体培养基重悬，并进行10倍梯度稀释，即200μL重115悬液加到1.8mL无菌BPY培养液中，将稀释液加到样品瓶中，分别于4℃、25℃、37℃培养，定点取样进行菌落数计数和拍照。如果出现可培养S.typhimurium菌落则表明实现了复苏。2结果与讨论2.1标准曲线的建立120为了能够定量TS前后沙门的总菌数和活菌数，以qPCR/RT-qPCR得到的CT值和平板计数得到的CFU菌落数为基础建立标准曲线。图1a说明qPCR定量结果能够与CFU2计数结果建立很好的线性相关性，定量标准曲线公式y=-3.3136x+34.967，R=0.9998，扩增效率100%；同时图2a说明RT-qPCR定量结果能够与CFU计数结果建立很好的线性相关2性，定量标准曲线公式y=-2.966x+34.967，R=0.9926，扩增效率117%。通过图1b、图2b125的扩增曲线和图1c、图2c琼脂糖凝胶电泳图确定了qPCR和RT-qPCR的特异性。qPCR的171定量结果在10-10CFU/mL有良好的线性关系，检测限为10CFU/mL。RT-qPCR定量结果272[10]在10-10CFU/mL有良好的线性关系，检测限为10CFU/mL，这与Jiang等报道的定量检测限相吻合。此方法检测限低、范围广，可以用于后续试验活菌数的定量检测。33302724值T21C1815y=-3.3136x+37.7762R=0.999812E=100%12345678LogCFU/mL10130a-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnbc图1鼠伤寒沙门氏菌qPCR标准曲线（a）、扩增曲线（b）和扩增产物琼脂糖凝胶电泳图（c）。1-7：DNA0-6梯度稀释10-10；8：无酶对照组；9：无模板对照。135Fig.1Standardcurves(a),amplificationcurves(b)andagarosegelelectrophoresis(c)analysisforquantitativedetectionofS.typhimuriumbyqPCR.Gelelectrophoresis:Lanes1–7:serialdilutionsfromDNAsamplesofS.0-6typhimuriumatstationaryphaserangingfrom10to10,Lane8:negativecontrol,Lane9:enzyme-freecontrol.33302724值TC2118y=-2.966x+34.967152R=0.9926E=117%122345678LogCFU/mL10a140bc图2鼠伤寒沙门氏菌RT-qPCR标准曲线（a）、扩增曲线（b）和扩增产物琼脂糖凝胶电泳图（c）。1-6：0-5cDNA梯度稀释10-10；7：无酶对照组；8：无模板对照。Fig.2Standardcurves(a),amplificationcurves(b),agarosegelelectrophoresis(c)analysisforquantitative145detectionofS.typhimuriumbyRT-qPCR.Gelelectrophoresis:Lanes1–6:serialdilutionsfromcDNAsamplesof06S.typhimuriumatstationaryphaserangingfrom10to10,Lane7:negativecontrol,Lane8:RTenzyme-freecontrol.-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn2.2VBNC态S.typhimurium的TS诱导以时间为变量，研究52℃380W条件下时间对诱导S.typhimurium进入VBNC态的影150响。如图3，随着时间的增加，总菌数、活菌数、可培养数呈下降趋势，VBNC态数目呈上升趋势。S.typhimurium在TS处理35min内的基本没有VBNC态细胞，35min后明显增加，50min时最高达3.88log10CFU/mL。TS处理组与对照组相比，通过核酸定量的总菌数和活菌数数都下降，可能是TS导致了核酸的破坏。结果显示TS可以诱导S.typhimurium进入VBNC态，处理时间越长，VBNC态细胞数越多。为保证实验体系中没有可培养的细155菌，复苏实验的诱导条件都采用52℃60min380W的TS处理条件。综上所述，TS可以诱导S.typhimurium进入VBNC状态，所以我们需要谨慎评估TS杀菌技术的有效性。值得注意的是，有研究指出UV和H2O2产生的自由基可诱导E.coli和[4,11][12-14]Salmonella进入VBNC态状态，而超声过程中也会产生自由基，关于TS诱导沙门进入VBNC态的影响因子是TS过程中产生的自由基还是其他因素，还需进一步研究。9总菌数活菌数8可培养数VBNC数7654CFU/mL103Log210-1051015202530354045505560时间（min）160图3TS处理时间（52℃380W）对诱导VBNC态S.typhimurium的影响oFig.3VariationsinS.typhimuriumcountstreatedbyTSat52Cand380Wfor0-60min.2.3VBNC态S.typhimurium的复苏温度在VBNC态的诱导和复苏有着很重要的影响。一方面，低温可以诱导某些微生物，[15]165如E.coli和S.typhimurium，进入VBNC状态，另一方面，微生物的培养温度可以[1]使VBNC态细胞复苏。考虑到温度是VBNC态细胞复苏的一个重要因素，所以本实验研究了温度对VBNC态S.typhimurium的复苏影响。利用BPY培养基考察了4℃、25℃、37℃三个温度条件下对52℃60min380WTS诱导产生的VBNC态S.typhimurium细胞的复苏能力，同时为了排除复苏现象来自少量为检170测到的可培养细菌的再生长，采用稀释法对复苏现象进行研究。如图4所示，25℃培养24h就有可培养数，稀释10倍的VBNC态96h出现可培养细胞；37℃培养6h的S.typhimurium出现可培养菌落数，稀释10倍的VBNC态48h有可培养数；4℃观察90d仍没有可培养-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn数，说明4℃90d没有复苏。由结果可知，温度越接近培养温度越容易复苏。所有稀释度的8细胞数都达到10CFU/mL左右，说明复苏现象并不是由少量未检测到的可培养细胞的再生175长引起，而是来自VBNC态细胞的复苏。这些细胞通过繁殖达到生长稳定期，所以不同稀释度的样品出现了相同数量级的菌落数。由图5可知，4℃复苏条件下培养基澄清没有出现浑浊现象，说明VBNC态细菌没有复苏或者已经死亡；25℃培养24h培养基浑浊说明有菌体复苏，96h后，稀释10倍的培养基也出现浑浊现象，说明VBNC态的复苏并非由少量未检测到的细胞生长造成；37℃条件下18012h就出现浑浊现象，稀释10倍的菌体48h浑浊，相较25℃培养条件下，VBNC态细胞复苏较快。综合图4和图5的实验结果可得出37℃条件下最适合S.typhimurium的复苏，与Pinto[16]等得出的结论一致，即VBNC态的E.coli在37℃条件下比在25℃和4℃条件复苏的快。最佳生长温度有利于VBNC态细胞的自我修复，可能是因为VBNC状态是微生物在不利条185件下的亚致死损伤状态。A104℃25℃937℃8765CFU/mL104Log321001224364860728496时间（h）ooo4C25C37CB1024h48h72h96h98765CFU/mL104Log32100-1-2-30-1-2-30-1-2-30-1-2-310101010101010101010101010101010稀释度-7- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图4温度对VBNC态S.typhimurium复苏的影响（52℃60min380WTS诱导）。A:VBNC态S.typhimurium复苏0-96h的可培养数；B:VBNC态S.typhimurium复苏24h，48h，72h和96h的可培190养数（稀释法）Fig.4EffectsofincubationtemperatureonresuscitationofVBNCS.typhimuriumcells:(A)platecountsat0–96hand(B)platecountsforseriallydilutedsamples.a195bcdefg200hij图5TS（52℃60min380W）诱导产生的VBNC态S.typhimurium的复苏情况（稀释法）。a:未经TS处理的正常细胞；b-d：VBNC态细胞在4℃条件下培养12h、96h和90d；e-f:VBNC态细胞在25℃条件下培养12h、24h和96h；h-j：VBNC态细胞在37℃条件下培养6h、12h和48h。4℃、25℃、37℃-1-2-3标记的样品：未稀释的菌液；1、2、3：菌液梯度稀释10、10、10；没有标记的样品瓶：BPY培养基。o205Fig.5ResuscitationofVBNCS.typhimuriuminducedbyTStreatment(52C60min380W)(dilutionomethod).a:cellsatstablestage;b-d:VBNCstatecellsincubatedat4Cfor12h,96hand90d;e-f:VBNCstateooocellsincubaatedat25Cfor12h,24hand96h;h-j:VBNCcellsincubatedat37Cfor6h,12hand48h.4C,oo0-1-2-325C,37C:bacteriadealtwithTStreatmentandwithoutdilution;1,2,3:dilutiondegreeofcells10,10,10,10；bottleswithoutmarkers:BPYmediumwithoutbacteria.2103结论RT-qPCR结合平板计数法可以有效快速的检测TS诱导的VBNC态S.typhimurium，克服了传统的平板计数法漏检VBNC状态菌的缺陷。S.typhimurium在52℃380WTS作-8- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn用条件下，处理35min以上时，部分沙门就可进入VBNC状态。同时25℃和37℃直接升温法可使VBNC态S.typhimurium复苏，最适培养温度37℃更有利VBNC态细胞的复215苏。[参考文献](References)[1]LIL,MENDISN,OLIVERJD,etal.Theimportanceoftheviablebutnon-culturablestateinhumanbacterialpathogens[J].FrontiersinMicrobiology,2014,5(4):258.[2]WUB,LIANGW,KANB.GrowthPhase,Oxygen,Temperature,andStarvationAffecttheDevelopmentof220ViablebutNon-culturableStateofVibriocholerae[J].FrontiersinMicrobiology,2016,7:404.[3]ZHAOF,WANGY,ANH,etal.NewInsightsintotheFormationofViablebutNonculturableEscherichiacoliO157:H7InducedbyHigh-PressureCO2[J].Mbio,2016,7(4):e00961-16.[4]MORISHIGEY,FUJIMORIK,AMANOF.DifferentialResuscitativeEffectofPyruvateanditsAnaloguesonVBNC(ViableButNon-Culturable)Salmonella[J].MicrobesandEnvironments,2013,28(2):180-186.225[5]JIANGN,LVQY,XUX,etal.InductionoftheviablebutnonculturablestateinClavibactermichiganensissubsp.michiganensisandinplantaresuscitationofthecellsontomatoseedlings[J].PlantPathology,2015,2(5):92-101.[6]KIANGWS,BHATR,ROSMAA,etal.EffectsofthermosonicationonthefateofEscherichiacoliO157:H7andSalmonellaEnteritidisinmangojuice[J].LettersinAppliedMicrobiology,2013,56(4):251-257.230[7]DECLERCKP,VANYSACKERL,HULSMANSA,etal.EvaluationofpowerultrasoundfordisinfectionofbothLegionellapneumophilaanditsenvironmentalhostAcanthamoebacastellanii[J].WaterResearch,2010,44:703-710.[8]ZENGB,CAOXH,YANGZ,etal.FormationandResuscitationofViablebutNonculturableSalmonellatyphi[J].BiomedResearchInternational,2013,2013:907170.235[9]CONWAYT,SCHOOLNIKGK.Microarrayexpressionprofiling:capturingagenome-wideportraitofthetranscriptome[J].MolecularMicrobiology,2003,47(4):879-889.[10]JIANGQ,FUB,CHENY,etal.Quantificationofviablebutnonculturablebacterialpathogensinanaerobicdigestedsludge[J].AppliedMicrobiologyBiotechnology,2013,97(13):6043-6050.[11]ZHANGS,YEC,LINH,etal.UVDisinfectionInducesaVBNCStateinEscherichiacoliandPseudomonas240aeruginosa[J].EnvironmentScienceandTechnology,2015,49:1721-1728.[12]PIYASENAP,MOHAREBE,MCKELLARRC.Inactivationofmicrobesusingultrasound:areview[J].InternationalJournalofFoodMicrobiology,2003,87:207-216.[13]SORIAAC,VILLAMIEM.Effectofultrasoundonthetechnologicalpropertiesandbioactivityoffood:areview[J].TrendsinFoodScienceandTechnology,2010,21:323-331.245[14]WUXG,JOYCEEM,MASONTJ.EvaluationofthemechanismsoftheeffectofultrasoundonMicrocystisaeruginosaatdifferentultrasonicfrequencies[J].WaterResearch,2012,46:2851-2858.[15]OLIVERJD,DagherM,LindenK.InductionofEscherichiacoliandSalmonellatyphimuriumintotheviablebutnonculturablestatefollowingchlorinationofwastewater[J].JournalofWaterandHealth,2005,43:93-100.[16]PINTOD,ALMEIDAV,SANTOSMA,etal.ResuscitationofEscherichiacoliVBNCcellsdependsona250varietyofenvironmentalorchemicalstimuli[J].JournalofAppliedMicrobiology,2011,110:1601-1611.-9-'