两种硫氧化细菌CO2同化潜能解析及其影响因素.pdf 12页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn两种硫氧化细菌CO2同化潜能解析及其影响#因素**王亚楠，王磊，张赛伟，李欢5（同济大学环境科学与工程学院，上海200092）摘要：研究了两种典型硫氧化细菌（SOB）（ThiobacillusthioparusDSM505和HalothiobacillusneapolitanusDSM15147）自养培养过程中cbb基因转录特性，通过cbb基因启动子强度解析了二者的CO2同化潜能，并探讨了胞外游离有机碳（EFOC）对其cbb基因转录特性及自10养过程的影响。结果表明，DSM505的cbbL基因的启动子强度高于DSM15147，即DSM505-cbbL基因的转录潜能高于DSM15147；但其自养培养过程中的cbbL基因转录效率却比DSM15147的低，意味着DSM505的CO2同化潜能未能充分发挥。DSM505自我产生的EFOC对其cbb基因的转录和固碳效率有显著的抑制作用，DSM15147的EFOC对其固碳效率的影响相对较弱，即DSM505的cbbL基因转录过程及CO2同化潜能对胞外有机碳的反15馈抑制效应更为敏感。关键词：硫氧化细菌（SOB），固碳效率，cbb基因，CO2同化潜能，胞外游离有机碳（EFOC）中图分类号：X17220CO2assimilationpotentialintwosulfuroxidizingbacteriaanditsinfluencingfactorWangYa-nan,WangLei,ZhangSaiwei,LiHuan(CollegeofEnvironmentalScienceandEngineering,TongjiUniversity,Shanghai200092)Abstract:Inthisstudy,thecharacteristicsofcbbgenestranscriptionoftwosulfuroxidizingbacteria25(includingThiobacillusthioparusDSM505andHalothiobacillusneapolitanusDSM15147)duringautotrophicculturingprocesswereinvestigated.TheCO2assimilationpotentialwasanalyzedthroughthecbbgenespromoterstrength,andtheeffectsofextracellularfreeorganiccarbononcbbgenestranscriptionandautotrophicprocesswerediscussed.TheresultsshowedthatthepromoterstrengthofcbbLgeneinDSM505washigherthanthatinDSM15147,butthecbbLgenetranscriptionefficiency30wasmuchlowerthanthatofDSM15147,indicatingthatthecbbLgenetranscriptionpotentialinDSM505mightnotbeexertedsufficiently.Theself-generatedEFOCinDSM505hasasignificantinhibitioneffectoncbbgenestranscriptionandcarbonfixationefficiency;however,theself-generatedEFOCinDSM15147showedrelativelyweakerinhibitioneffectonitscarbonfixationefficiencythanthatofDSM505.ThesefindingsindicatedthatthecbbgenetranscriptionprocessandCO235assimilationpotentialofDSM505weremoresensitivetothefeedbackinhibitionofEFOC.Keywords:Sulfur-oxidizingbacteria(SOB),Carbonfixationefficiency,Cbbgenes,CO2assimilationpotential,Extracellularfreeorganiccarbon(EFOC)0引言40化能自养细菌对全球CO2固定具有重要的意义。硫氧化细菌（Sulfur-oxidizingbacteria，2−02−SOB）作为一类重要的化能自养细菌，通过氧化一些含硫化合物（如S、S和S2O3等）获得能量来源，并利用CO2作为碳源进行生长，因而，它们具有去除废水废气中含硫污染[1]物及固定环境中CO2的双重环境功能。基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（20130072110025）国家自然科学基金（21577101）作者简介：王亚楠（1987-），女，博士研究生，环境微生物固碳通信联系人：王磊（1963-），男，教授，博导，环境生物技术与生态工程.E-mail:celwang@tongji.edu.cn-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn[2,3]对于化能自养细菌，其用于细胞物质合成的有机碳必须由自身同化CO2而获得，因45此，CO2同化速率是决定化能自养细菌生长速度及表观固碳效率的一项关键内在因素。卡尔文循环（Calvin-Bassham-Bensoncycle，CBBcycle）被认为是最主要的固碳途径，且RubisCO[4,5]酶（编码基因为cbb基因）是参与CBB循环的关键酶。大多数好氧硫氧化细菌（SOB）通过FormIIRubisCO同化CO2，诸多研究表明一些SOB能同时利用FormI和IIRubisCO[6-8][9][10]固碳。Yoshizawa和Badger等进一步指出，cbb基因的表达类型及转录效率是决定化50能自养细菌CO2同化能力的重要因素。然而，cbb基因转录受环境因素影响较大，且CO2同化产物—胞外游离有机碳（EFOC）[11-14]对RubisCO酶基因的表达有一定的反馈阻遏，因此，各种自养菌中RubisCO酶的实际表达量并不代表其潜在的表达能力。启动子强度是决定结构基因潜在表达效率的主要因素[15]，即关键固碳酶基因启动子的启动效率可以间接反映某种菌固碳关键酶的表达潜能。能55否通过固碳酶基因启动子活性解析不同SOB的CO2同化潜能？以及SOB的cbb基因启动子强度与实际转录效率之间的内在关系如何？目前未见相关报道。基于此，以典型SOB（ThiobacillusthioparusDSM505和HalothiobacillusneapolitanusDSM15147）为研究对象，研究内容包括：（1）考察它们自养培养过程中cbb基因的转录特性；（2）对比分析二者的cbb基因启动子强度，解析其CO2同化潜能；（3）60探讨胞外游离有机物对其cbb基因转录特性及自养过程的反馈抑制作用。1材料与方法1.1cbb基因转录量及转录效率测定研究所用的两株SOB从德国微生物及细胞保藏中心（GermanCollectionofMicroorganismsandCellCultures，DSMZ）购买。它们分别在装有40ml灭菌的无机培养基65的血清瓶中培养，依据DSMZ提供的培养基配方进行培养。接种1ml处于对数生长期的菌液至相应的培养基中，接种菌液浓度基本一致（1.0–1.5mg/LTOC）。随后，血清瓶用胶塞及封口膜密封，并充入21%O2及10%CO2。将血清瓶置于恒温摇床上（28°C，120rpm）连续培养7d，每组实验均设置3个平行样。SOB自养培养过程中，于不同的时间间隔（分别为24、72和144h）采集样品。一定70体积的混合样品经0.22μm滤膜过滤后截留获得菌体细胞样品。根据DNA抽提试剂盒®（UltraCleanDNAIsolationKit，MOBIOLaboratories）提供的操作步骤，抽提细菌总DNA。®菌体细胞总RNA提取采用TRIzolPlus（Invitrogen）结合RNA纯化试剂盒（AmbionbyLife[16,17]Technologies）的方法。在确定RNA的纯度、浓度能够满足下游实验的要求后，需进行逆转录，使RNA转变为cDNA。75据文献报道，DSM505和DSM15147采用I型和II型RubisCO（编码基因分别是cbbL和cbbM基因）进行固碳，我们前期研究结果也表明它们都含有cbbL和cbbM两种类型基因[18]。采用qPCR分析仪测定DNA和cDNA样品中的cbb基因拷贝数，它们分别代表cbb基[16,18]因丰度及cbb基因转录量，详见参考文献。Cbb基因转录效率，即单位拷贝的cbb基因转录量，表示为：cbb基因转录量/cbb基因丰度。801.2cbb基因启动子强度检测体系构建通过克隆各种硫氧化细菌RubisCO酶基因的启动子，并与绿色荧光蛋白（green-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn[19,20]fluorescentprotein,GFP）基因构建融合载体转化大肠杆菌，最后根据转化子的荧光强度评价各种SOB中RubisCO酶基因启动子的强度，进而间接表征各种菌在无抑制条件下RubisCO酶的最大表达潜力。851.2.1DNA样品、菌株及质粒DNA样品：DSM15147和DSM505的DNA样品。质粒和菌株：研究使用的含有GFP基因片段的质粒（pEGFP-N1Vector）由复旦大学遗传所赠送。所使用的初始质粒包括：pUC18及pMD18-T，并以此为基础构建一系列所需质粒。使用的宿主细胞为E.coliTop10。E.coli的普通培养采用LB液体培养基，于37°C培养。90筛选培养基则是含有100μg/ml氨苄青霉素（Amp）LB琼脂培养基。所使用及构建的菌株和质粒如表1所示。表1主要供试质粒和菌株Tab.1Mainplasmidsandstrainsfortested质粒性质来源RpUC18pBR322ori,Amp,LacZpromoter,2.7kbLabstockRpMD18ColE1ori,Amp,LacZoperater,2.7kbTaKaRapUC18derivative,containingtheGFPgene,betweenBamHIpUC18-GFPThisstudyandHindIIIsites,3.4kbpUC18-GFPderivative,containingtheP15147-cbbLgene,pUC18-GFP-P15147-cbbLThisstudybetweenSacIandBamHIsites,4.7kbpUC18-GFPderivative,containingtheP505-cbbL-Y+I+1gene,pUC18-GFP-P505-cbbL-Y+I+1ThisstudybetweenSacIandBamHIsites,4.9kbpUC18-GFPderivative,containingtheP505-cbbL-J+I+1gene,pUC18-GFP-P505-cbbL-J+I+1ThisstudybetweenSacIandBamHIsites,4.6kb菌株性质来源–F,mcrA,Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC),φ80lacZΔM15,ΔlacX74,E.coliTop10nupG,recA1,araD139,Δ(ara-leu)7697,galE15,galK16,LabstockR–rpsL(Str),endA1,λTop10(pUC18-GFP)E.coliTop10containingpUC18-GFPThisstudyTop10(pUC18-GFP-P15147-cbbL)E.coliTop10containingpUC18-GFP-P15147-cbbLThisstudyTop10(pUC18-GFP-P505-cbbL-Y+I+1)E.coliTop10containingpUC18-GFP-P505-cbbL-Y+I+1ThisstudyTop10(pUC18-GFP-P505-cbbL-J+I+1)E.coliTop10containingpUC18-GFP-P505-cbbL-J+I+1Thisstudy951.2.2主要反应试剂及工具酶主要反应试剂及工具酶包括：（1）rTaq酶PCR反应体系使用试剂：dNTPMixture、2+10×PCRBuffer(MgPlus)及rTaqDNAPolymerase；（2）保真酶PCR体系使用试剂：2+5×PrimeSTARBuffer(MgPlus)、PrimeSTARHSDNAPolymerase及dNTPMixture；（3）酶切反应所需试剂：QuickCutBamHI、QuickCutHindIII、QuickCutSacI及10×QuickCut®100GreenBuffer；（4）连接反应试剂：10×T4DNALigaseBuffer、T4DNALigase及pMD18-TVector。这些反应所需试剂均购自TaKaRa公司。其他：琼脂糖凝胶/PCR产物纯化试剂盒（BIOMIGA），B型超纯质粒中量提取试剂盒（BioDev-Tech北京博大泰恒生物技术有限责任公司）。-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn1.2.3引物设计及PCR反应体系及程序105反应所需引物如表2所示。对于已知基因序列的cbb基因启动子克隆，一般采用rTaq酶PCR反应体系及普通PCR反应程序。对于未知上游序列的cbb基因启动子克隆，采用[21]TAIL-PCR反应体系和相应的PCR程序以及保真酶PCR反应体系和相应的PCR程序。表2cbb基因上游启动子及GFP基因引物设计110Tab.2PrimersforcbbgenepromoterandGFPgene目标片段目标片段引物名称序列（5’-3’）酶切位点长度（bp）G1fCGCGGATCCGATGGTGAGCAAGGGCGAGBamHI720GFP片段G720rCCCAAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTCCAHindIIIDSM15147-cbbLhnLFTCCGAGCTCCACACCGGGAAGTTTGGCASacI1253启动子hnLRCGCGGATCCTAGTCCATGTCGGTCAGCAABamHI12NNNNNNNNNNNNN//第1轮V2F(SP1)GCCTTCSAGCTTGCCSACCRC/TAIL-PCR12NNNNNNNNNNNNN/第2轮/(DSM505)505L-R-II(SP2)CTTCAGGGTCGCTTCGTGC/12NNNNNNNNNNNNN/第3轮/505L-R-I(SP3)CGCGGATCCGTTCTCGTCGTCCTTGGTGBamHI505L-F-YDTCCGAGCTCACTGTCCGGGCTGGTTGAGGSacI1518505-cbbL-Y+I-1505L-R-I(-1)CGCGGATCCTTCTCGTCGTCCTTGGTGBamHI505L-F-YDTCCGAGCTCACTGTCCGGGCTGGTTGAGGSacI1519505-cbbL-Y+I505L-R-ICGCGGATCCGTTCTCGTCGTCCTTGGTGBamHI505-cbbL-Y+I+1505L-F-YDTCCGAGCTCACTGTCCGGGCTGGTTGAGGSacI1520(有效启动子)505L-R-I(+1)CGCGGATCCCGTTCTCGTCGTCCTTGGTGBamHI505L-F-JTCCGAGCTCCTGGCGAGCACCTGTTCCTTGTTGSacI1165505-cbbL-J+I-1505L-R-I(-1)CGCGGATCCTTCTCGTCGTCCTTGGTGBamHI505L-F-JTCCGAGCTCCTGGCGAGCACCTGTTCCTTGTTGSacI1166505-cbbL-J+I505L-R-ICGCGGATCCGTTCTCGTCGTCCTTGGTGBamHI505-cbbL-J+I+1505L-F-JTCCGAGCTCCTGGCGAGCACCTGTTCCTTGTTGSacI1167(有效启动子)505L-R-I(+1)CGCGGATCCCGTTCTCGTCGTCCTTGGTGBamHI注：a）下划线的碱基为酶切位点，斜体的为保护碱基。b）目标片段（含酶切位点）包括启动区域序列及一部分cbb基因序列。c）505-cbbL-Y+I+1及505-cbbL-J+I+1引物扩增的目标片段具有启动活性，而另外4组扩增的目标片段为无效启动子。1151.2.4重组质粒的构建方法基因克隆转化步骤包括：PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳→PCR产物纯化→限制性内切酶[16]酶切反应→琼脂糖凝胶产物回收及纯化→连接→转化→转化子鉴定→测序→质粒抽提。针对已知cbbL基因上游序列的DSM15147，以GFP基因作为报告基因，克隆到pUC18120克隆载体中，构建重组质粒pUC18-GFP；在此基础上，通过常规PCR技术对已知cbb基因上游序列的DSM15147-cbbL基因的启动子（P15147-cbbL）进行克隆。将P15147-cbbL与pUC18-GFP重组构成新质粒pUC18-GFP-P15147-cbbL，并转化到宿主细菌E.ColiTop10中；进而通过重组菌荧光强度检测来判断DSM15147的cbbL基因启动子强度。如图1所示。-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn125图1重组质粒pUC18-GFP-P15147-cbbL的构建示意图，其中，GFP基因PCR扩增片段首先插入到克隆载体pUC18中，酶切位点为BamHI和HindIII，形成重组质粒pUC18-GFP；随后，DSM15147-cbbL基因启动子PCR扩增片段（P15147-cbbL）插入到pUC18-GFP中，酶切位点为SacI和BamHI，构成重组质粒pUC18-GFP-P15147-cbbLFig.1ConstructiondiagramoftherecombinantplasmidpUC18-GFP-P15147-cbbL.Inwhich,thePCRamplification130fragementofGFPgenewasfirstlyinsertedintothecloningvectorpUC18andformedarecombinantplasmidpUC18-GFPwithBamHIandHindIIIrestrictionenzymesdigestion.Afterthat,thePCRamplificationfragementofcbbgeneprompter(P15147-cbbL)wasinsertedintopUC18-GFPandformedanewrecombinantplasmidpUC18-GFP-P15147-cbbLwithSacIandBamHIrestrictionenzymesdigestion针对未知cbbL基因上游序列的DSM505，基于TAIL-PCR技术对DSM505-cbbL基因135上游启动子强度进行检测，如图2所示。首先，通过PCR扩增及克隆转化测序获得DSM505-cbbL基因的部分序列；其次，在获得序列基础上设计3个反向特异性引物，并结合随机引物进行三轮TAIL-PCR扩增，经克隆转化测序获得DSM505-cbbL基因上游侧翼序列；之后，在获得上游侧翼序列的基础上，设计三组引物，获得三组pUC18-GFP-P505-cbb重组质粒，通过荧光强度判定具有启动活性的启动子（即GFP的起始密码子编码位置正确）。实140验中为了验证结果的可靠性，设计了两组不同的上游引物（见表2），其中，具有启动活性的启动子片段分别是：P505-cbbL-Y+I+1和P505-cbbL-J+I+1，对应的重组菌株分别是Top10(pUC18-GFP-P505-cbbL-Y+I+1)和Top10(pUC18-GFP-P505-cbbL-J+I+1)（见表1）。1.2.5cbb基因启动子强度检测将上步获得的重组菌（转化子PCR鉴定及测序结果正确）在含有抗性基因的LB液体145培养基中进行扩大培养，同时将原始E.coli接种于不含Amp的LB液体培养基作为空白对照。培养后通过重组菌荧光发光特性检测其启动子强度。取200μl菌液于比色杯中，采用多功能酶标仪测定菌液荧光强度，测定条件为：激发光Ex:470nm，发射光Em:510nm。同时采用Ex:470nm激发扫描对菌液样品进行波谱扫描（510nm处出现波峰）。测定之前，菌液用ddH2O洗3次以扣除LB培养基的本底荧光值。-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn150图2基于热不对称交错PCR方法（TAIL-PCR）研究未知DSM505-cbbL基因启动子强度示意图Fig.2SchematicdiagramforcbbLgenepromoterstrengthinDSM505withunknowngeneticsequencesbasedonThermalAsymmetricInterlacedPCR(TAIL-PCR)technology1.3EFOC影响两种SOB的cbb基因转录量/效率实验设计155研究EFOC对SOB的cbb基因转录量、转录效率及固碳效率的影响。两种菌在装有40ml灭菌的无机培养基的血清瓶中培养，另外，分别将DSM505和DSM15147自养培养至2d和7d产生的EFOC从体系中分离出来（0.22μm水性滤膜过滤后获得EFOC，并用MD341000D透析膜去除无机盐），按不同的浓度添加至相应的培养基中，如表3所示。1ml处于对数生长期的菌液接种到相应的培养基中，初始菌液浓度基本一致（1.0–1.5mg/LTOC）。160随后，血清瓶用胶塞及封口膜密封，血清瓶中充入21%O2及10%CO2。每一组实验均设置3个平行样，之后将血清瓶至于恒温摇床上连续培养3.5d，培养条件为28°C，120rpm。表3两种SOB培养基质中初始EFOC浓度Tab.3TheinitialconcentrationofEFOCinculturemediumofthetwoSOBstrains编号EFOC(mg/L)EFOC(mg/L)2d-L4.007d-L5.43DSM5052d-H8.017d-H10.872d-L3.647d-L4.75DSM151472d-H7.297d-H9.50165注：2d-L和2d-H分别代表培养前期（2d）低浓度和高浓度的EFOC，7d-L和7d-H分别代表培养后期（7d）低浓度和高浓度的EFOC。-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn2结果与讨论2.1两种硫氧化细菌的cbb基因转录特性据相关研究报道，DSM505和DSM15147都是通过CBB途径固碳，它们都含有cbbL和[18]170cbbM两种类型的基因。两种菌自养培养过程中的cbb转录总量（cbbL与cbbM转录量之和）64如图3（a）所示。DSM505的cbb转录总量呈现明显降低的趋势，从10copies/ml降低至1065copies/ml，DSM15147的cbb转录总量从10copies/ml降低至10copies/ml。由于cbb转录总量受cbb基因丰度（图3（b））的影响，因此，对cbb转录效率（cbb基因转录量/cbb基因丰度，即单位细菌的cbb基因转录量）进行了分析（图3（c））。自养培养–1–3–3–5175过程中，DSM15147和DSM505的cbb基因转录效率降低变化分别是10至10、10至105–66–7（图3（c））。总体上，DSM505和DSM15147的平均cbb基因转录量分别是10和10–4–2copies/ml，平均转录效率分别为10和10，即DSM505的转录效率远远低于DSM15147（图3（d））。如表4所示，两种菌在自养培养过程中，cbbL和cbbM基因的转录量和转录效率之间存180在显著的差异。DSM505的cbbL和cbbM基因转录量所占比例分别为54–68%和32–46%；其转录效率所占比例分别为56–70%和30–44%。DSM15147的cbbL基因转录量所占比例为78–93%，cbbL基因转录效率所占比例高达80–95%。通常，FormI型RubisCO酶的CO2亲[2,10]和性和比催化活性高于FormII型的，两种SOB的cbbL基因转录量和转录效率所占比例较高，尤其是DSM15147；意味着它们的CO2同化过程基本上是由其cbbL基因的转录过185程所决定。693.0x101.5x10(a)24h(b)24h62.4x1072h72h9144h1.2x106144h1.8x10681.2x109.0x10geneabundance8(copies/mL)5(copies/mL)6.0x10genetranscriptionyield4.50x10cbbcbb53.00x10Total83.0x10Total1.50x1050.000.0DSM505DSM15147DSM505DSM15147010(c)24h7Averagecbbgenetranscriptionyield0-110(d)Averagecbbgenetranscriptionefficiency101072h-2144h6-1101010-3105-21010-4104-310103.0x10-5genetranscriptionyield(copies/mL)3-41010genetranscriptionefficiencycbbgenetranscriptionefficiency-52.0x102-5cbb1010cbb-51.0x10Average1-6Total10100.00.00.0AverageDSM505DSM15147DSM505DSM15147图3两种SOB自养培养过程中cbb基因转录量（a）、cbb基因丰度（b）、cbb基因转录效率的变化（c）-7- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn190及平均cbb基因转录量及转录效率（d）（样品于24、72和144h采集测定，且平均转录量及转录效率是24、72和144h数据的平均值）Fig.3Variationinthetotalcbbgenetranscriptionyield(a),thetotalcbbgeneabundance(b)thetotalcbbgenetranscriptionefficiency(c),andtheaveragecbbgenetranscriptionyieldandefficiency(d)ofthetwoSOBstrainsduringchemoautotrophiccultivation.Sampleswerecollectedandmeasuredat24,72and144h,andtheaverage195cbbgenetranscriptionyieldandefficiencywereaveragedfromthoseat24,72and144h表4两种SOB自养培养过程中cbbL和cbbM基因转录量和转录效率的比例Tab.4TheproportionoftranscriptionlevelandtranscriptionefficiencyofcbbLandcbbMgenesduringautotrophicculturingprocessinthetwoSOBstrainscbb基因转录量cbb基因转录效率TimeDSM505DSM15147DSM505DSM15147cbbLcbbMcbbLcbbMcbbLcbbMcbbLcbbM24h0.6860.3140.7890.2110.7060.2940.8040.19672h0.5540.4460.9360.0640.6040.3960.9510.049144h0.5430.4570.8490.1510.5680.4320.8400.1602002.2两种硫氧化细菌CO2同化潜能解析如上所述，两种SOB的CO2同化过程主要由cbbL基因所决定，且关键固碳酶基因启动子的启动效率可以间接反映某种菌固碳关键酶的表达潜能。因此，通过cbbL启动子强度来解析它们的CO2同化潜能。如图4（a）所示，重组菌株E.coliTop10(pUC18-GFP-P505-cbbL-Y+I+1)和E.coliTop10(pUC18-GFP-P505-cbbL-J+I+1)的荧光强度高于E.coliTop10205(pUC18-GFP-P15147-cbbL)，表明DSM505-cbbL基因的启动子强度高于DSM15147。图4（b）为重组菌液培养96h的470nm激发扫描波谱图，结果显示它们在510nm处均有激发波峰，其中，E.coliTop10(pUC18-GFP-P505-cbbL-Y+I+1)和E.coliTop10(pUC18-GFP-P505-cbbL-J+I+1)的波峰高于E.coliTop10(pUC18-GFP-P15147-cbbL)，进一步表明DSM505-cbbL基因的启动子强度高于DSM15147-cbbL的启动子强度。2103000Negative(b)Negative(a)505-cbbL-Y2000505-cbbL-Y2500505-cbbL-J505-cbbL-J15147-cbbL15147-cbbL1500200015001000RFU1000500FluorescenceIntensity5000012243648607296120500520540560580600Time(h)Wavelength(nm)图4重组菌株E.coliTop10(pUC18-GFP-P505-cbbL-Y+I+1)、E.coliTop10(pUC18-GFP-P505-cbbL-J+I+1)和E.coliTop10(pUC18-GFP-P15147-cbbL)的荧光强度（a）及其培养96h的470nm激发扫描波谱（b）Fig.4FluorescenceintensityfromtherecombinantbacteriasolutionofE.coliTop10(pUC18-GFP-P505-cbbL-Y+I+1),215E.coliTop10(pUC18-GFP-P505-cbbL-J+I+1)andE.coliTop10(pUC18-GFP-P15147-cbbL)(a),andtheexcitationscanningspectrumof470nmat96hduringcultivation(b).-8- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn从理论上讲，DSM505的cbbL基因具有更强的启动强度，表明其cbbL基因转录潜能较高，相应地，其转录效率也应当较高；但实际上，DSM505的cbbL的转录效率却远远低于DSM15147（表5）。这意味着DSM505的CO2同化潜能未能充分发挥。由于固碳酶基220因的转录活性会受到环境因素的影响，进一步推断，相比于DSM15147，DSM505的cbbL[9,10,22]基因实际转录效率可能对不利因素更敏感，例如，受到CO2浓度的调节作用，或是受[11-13]到胞外有机物的抑制作用等。表5两种硫氧化细菌cbbL基因启动子强度与转录效率比对225Tab.5ComparisonofcbbLgenepromoterintensityandcbbgenetranscriptionefficiencyinthetwoSOBstrains名称启动子强度（最大荧光值）cbbL基因平均转录量cbbL基因转录平均效率505-cbbL-Y26701.17E+057.16E-04505-cbbL-J25861.17E+057.16E-0415147-cbbL9291.19E+064.24E-02注：启动子强度数据源于图4中72h数据，以最大荧光强度作为其启动子强度；cbbL基因转录效率数据源于图3和表4，为自养培养过程中（24、72和144h）的平均转录量和转录效率。2.3两种硫氧化细菌胞外游离有机物对cbb基因转录特性的影响230通常CO2同化产物—胞外游离有机碳（EFOC）对RubisCO酶基因的表达有一定的反馈[14,23]阻遏。上述结果表明，相比于DSM15147，DSM505的实际转录效率可能对不利因素的影响更为敏感，为了进一步明确SOB自我产生的EFOC其cbb基因转录及表观固碳的反馈抑制，将DSM505和DSM15147不同生长阶段产生的EFOC分离出来，并按不同的浓度分别添加至培养基质中，考察了SOB自我产生的EFOC对两种SOB固碳效率以及cbb基因235转录特性的影响。DSM505和DSM15147在不同生长阶段的不同浓度EFOC下的净固碳量如图5所示。不管是培养前期的EFOC还是培养后期的EFOC，它们对DSM505的净固碳量都有一定的抑制作用。其中，7d-L的EFOC抑制作用相对较弱，净固碳量为空白对照的36%；而其他三种情形下，净固碳量仅为空白对照的8%–10%。不管是培养前期的EFOC还是培养后期的240EFOC，它们对DSM15147的净固碳量也都有一定的抑制作用，但是其抑制作用整体较弱，其净固碳量仅仅低于空白对照组约10–20%。这些结果明确表明，DSM505在自养培养过程中自我产生的EFOC对其表观固碳效率的反馈抑制更为敏感。7048(b)DSM15147(a)DSM505604050324024301620NetfixedTOC(mg/L)NetfixedTOC(mg/L)10800CK2d-L2d-H7d-L7d-HCK2d-L2d-H7d-L7d-H245图5两种SOB在不同浓度EFOC下的净固碳量，其中，2d-L和2d-H分别代表培养前期（2d）分离出的低-9- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn浓度和高浓度EFOC，7d-L和7d-H分别代表培养后期（7d）分离出的低浓度和高浓度EFOCFig.5ThenetfixedcarbonofthetwoSOBstrainswithdifferentconcentrationsofEFOC.Inwhich,2d-Land2d-HrepresentthelowandhighconcentrationofEFOCisolatedfromtheculturingsystemat2d,respectively;7d-Land7d-HrepresentthelowandhighconcentrationofEFOCisolatedfromtheculturingsystemat7d,250respectively.为了进一步明确DSM505和DSM15147自我产生的EFOC对cbb基因转录的影响，将不同EFOC条件下的cbb基因转录量和转录效率进行了分析。由于cbbM基因总体转录效率[2,10]低于cbbL基因转录效率且FormIIRubisCO的比催化活性通常低于FormIRubisCO，因而主要分析了EFOC对cbbL基因转录的抑制效应。255如图6（a）所示，7d-LEFOC条件下的cbbL基因转录量约为空白对照组的25%，而其他三种条件下的cbbL基因转录量低于空白对照组2–3个数量级。2d-LEFOC条件下的cbbL基因转录效率远远低于空白对照组，仅为空白对照组的8%；而其他三种EFOC条件下的cbbL基因转录效率约为空白对照组的25–80%（图6（b））。这些结果表明了DSM505自我产生的EFOC对其cbb基因转录总量和转录效率都有一定的抑制作用。2606(a)DSM5054.50x10-3(b)DSM5054x10cbbLcbbL3x106cbbMcbbM-33.00x1062x10-31x1061.50x10-453.6x101.2x10-42.7x1048.0x10-41.8x10genestranscriptionefficiency4genestranscriptionlevel(copies/L)4.0x109.0x10-5cbbcbb0.00.0CK2d-L2d-H7d-L7d-HCK2d-L2d-H7d-L7d-H7-18.0x104.0x10(d)DSM15147cbbL(c)DSM151477cbbL-1cbbM6.0x103.0x10cbbM7-14.0x102.0x107-12.0x101.0x105-36.0x104.0x10-353.0x104.0x10-3genestranscriptionefficiency2.0x105genestranscriptionlevel(copies/L)2.0x10-3cbb1.0x10cbb0.00.0CK2d-L2d-H7d-L7d-HCK2d-L2d-H7d-L7d-H图6DSM505和DSM15147在不同浓度EFOC下的cbb基因转录量和cbb基因转录效率，其中，2d-L和2d-H分别代表培养前期（2d）分离出的低浓度和高浓度EFOC，7d-L和7d-H分别代表培养后期（7d）分265离出的低浓度和高浓度EFOCFig.6ThecbbgenestranscriptionlevelandtranscriptionefficiencyofDSM505and15147withdifferentconcentrationsofEFOC.Inwhich,2d-Land2d-HrepresentthelowandhighconcentrationofEFOCisolatedfromtheculturingsystemat2d,respectively;7d-Land7d-HrepresentthelowandhighconcentrationofEFOCisolatedfromtheculturingsystemat7d,respectively.270对于DSM15147，7d-LEFOC条件下的cbbL基因转录量仅为空白对照组的0.3%，而其他三种条件下的cbbL基因转录量为空白对照组的11–54%（图6（c））。2d-LEFOC条件-10- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn下的cbb基因转录效率接近空白对照组，而其他三种EFOC条件下的cbb基因转录效率约为空白对照组的2-40%（图6（d））。总体上，DSM15147自我产生的EFOC对其cbb基因转录总量也有一定的抑制作用。275综上，DSM505和DSM15147的cbb基因转录量/效率及固碳效率都受到EFOC的影响，但是DSM505的EFOC对其cbb基因转录量和固碳效率的反馈抑制作用更为突出。进一步推断，相比于DSM15147，DSM505的cbbL基因实际转录过程可能对胞外有机碳的反馈抑制效应更为敏感，导致其CO2同化潜能受到有机物的抑制作用，难以充分发挥。EFOC的积累可能是DSM505持续固碳的一个瓶颈，如果EFOC能够从自养培养系统中去除，那280么，EFOC对cbb基因转录的抑制作用可能减弱，进而，DSM505的固碳潜能能够被充分激发，CO2固定过程得以持续进行。3结论（1）DSM505的cbbL基因的启动子强度高于DSM15147，即DSM505-cbbL基因的转录潜能高于DSM15147；然而DSM505自养培养过程中的cbbL基因转录效率却比DSM28515147的低，意味着DSM505的CO2同化潜能未能充分发挥。（2）DSM505和DSM15147在自养培养过程中自我产生的EFOC对它们表观固碳效率都有一定的反馈抑制作用，但是DSM505的cbbL基因转录过程对胞外有机碳抑制效应更为敏感，这也是DSM505的实际转录效率偏低的一个重要原因。[参考文献](References)290[1]KellyDP,ShergillJK,LuWP,etal.Oxidativemetabolismofinorganicsulfurcompoundsbybacteria[J].AntonievanLeeuwenhoek,1997,71(1):95-107.[2]BergIA.EcologicalaspectsofthedistributionofdifferentautotrophicCO2fixationpathways[J].Applied&EnvironmentalMicrobiology,2011,77(6):1925-1936.[3]周群英,王士芬.环境工程微生物学（第3版）[M].北京:高等教育出版社,2007.295[4]TabitaFR,SatagopanS,HansonTE,etal.DistinctformI,II,III,andIVRubiscoproteinsfromthethreekingdomsoflifeprovidecluesaboutRubiscoevolutionandstructure/functionrelationships[J].JournalofExperimentalBotany,2008,59(7):1515-1524.[5]TabitaFR,HansonTE,LiHY,etal.Function,structure,andevolutionoftheRubisCO-likeproteinsandtheirRubisCOhomologs[J].Microbiology&MolecularBiologyReviews,2007,71(4):576-599.300[6]StonerMT,ShivelyJM.CloningandexpressionoftheD-ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase/oxygenaseformIIgenefromThiobacillusintermediusinEscherichiacoli[J].FEMSMicrobiologyLetters,1993,107(2-3):287-292.[7]BakerSH,JinS,AldrichHC,etal.InsertionmutationoftheformIcbbLgeneencodingribulosebisphosphatecarboxylase/oxygenase(RuBisCO)inThiobacillusneapolitanusresultsinexpressionofformII305RuBisCO,lossofcarboxysomes,andanincreasedCO2requirementforgrowth[J].JournalofBacteriology,1998,180(180):4133-4139.[8]HernandezJM,BakerSH,LorbachSC,etal.Deducedaminoacidsequence,functionalexpression,anduniqueenzymaticpropertiesoftheformIandformIIribulosebisphosphatecarboxylase/oxygenasefromthechemoautotrophicbacteriumThiobacillusdenitrificans[J].JournalofBacteriology,1996,178(2):347-356.310[9]YoshizawaY,ToyodaK,AraiH,etal.CO2-responsiveexpressionandgeneorganizationofthreeribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase/oxygenaseenzymesandcarboxysomesinHydrogenovibriomarinusstrainMH-110[J].JournalofBacteriology,2004,186(17):5685-5691.[10]BadgerMR,BekEJ.MultipleRubiscoformsinproteobacteria:theirfunctionalsignificanceinrelationtoCO2acquisitionbytheCBBcycle[J].JournalofExperimentalBotany,2008,59(7):1525-1541.315[11]FriedrichCG,FriedrichB,BowienB.FormationofenzymesofautotrophicmetabolismduringheterotrophicgrowthofAlcaligeneseutrophus[J].JournalofGeneralMicrobiology,1981,122(1):69-78.[12]LondonJ,RittenbergSC.EffectsoforganicmatteronthegrowthofThiobacillusintermedius[J].JournalofBacteriology,1966,91(3):1062-1069.[13]MatinA,RittenbergSC.RegulationofglucosemetabolisminThiobacillusintermedius[J].Journalof320Bacteriology,1970,104(1):239-246.[14]JouanneauY,TabitaFR.InvivoregulationofformIribulose1,5-bisphosphatecarboxylase/oxygenasefrom-11- 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