不同时程铅暴露对海马神经元AMPA受体表达的影响.pdf 10页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn不同时程铅暴露对海马神经元AMPA受体#表达的影响**丁锦君，邹容欣，汪惠丽5（合肥工业大学食品科学与工程学院）摘要：环境铅损伤学习记忆功能，但铅对AMPA受体各亚型表达的影响尚不清楚。本研究利用培养的原代海马神经元体系，采用电生理，免疫细胞化学和分子生物学等方法，研究了不同时程铅暴露对突触基本传递和AMPA受体表达的影响。结果发现，神经元分别铅暴露5分钟，15分钟，4小时和24小时，微小的兴奋性突触后电位的幅度和频率均无明显的变10化；在铅暴露5分钟，15分钟和4小时后，AMPA受体亚基GluR1和GluR2总体蛋白表达量没有明显的变化，但是在铅暴露15分钟后，兴奋性突触后膜上GluR1蛋白量明显升高。综上，急性铅暴露15分钟能引起GluR1突触膜转运的效能。关键词：食品生物化学；铅；突触传递；AMPA受体中图分类号：TS201.615LeadexposurefordifferenttimeeffectsAMPAreceptorexpressiononhippocampalneuronsDingJinjun,ZouRongxin,WangHuili(HefeiUniversityofTechnology,CollegeofFoodScienceandEngineering)Abstract:Environmentalleaddamagethefunctionoflearningandmemory,butthemechanismoflead20influencesubtypesofAMPAreceptorexpressionisunclear.Thisresearchusedprimaryculturedhippocampalneuronsandadoptedelectrophysiological,immunocytochemistryandmethodsofmolecularbiologytoinvestigatetheeffectsofdifferenttimeleadexposureonsynapticbasictransmissionandAMPAreceptorexpression.Theresultsfoundthatamplitudeandfrequencyofminiatureexcitatorypostsynapticcurrentshadnosignificantchangesafterneuronsrespectivelylead25exposurefor5minutes,15minutes,4hoursand24hours;TotalproteinexpressionofAMPAreceptorsubunitsGluR1andGluR2hadnoobviouschangesafterleadexposurefor5minutes,15minutes,4hours.ButtheproteinexpressionofexcitatorypostsynapticmembraneGluR1increasedsignificantlyafterleadexposurefor15minutes.Inconclusion,15minutesofacuteleadexposurecancauseGluR1synapticmembranetraffickingefficiency.30Keywords:Foodbiochemistry;lead;synaptictransmission;AMPAreceptor0引言环境问题严重威胁着人类的健康，且与食品安全密切相关。重金属污染是世界范围内的[1]环境问题，金属铅污染危害比较严重，铅对儿童健康的影响是毒理学和食品科学等领域研[2,3][4]究的热点。慢性铅暴露可损害发育中的中枢神经系统，学习记忆及认知障碍，并伴有[5,6]35临床上的多动症(ADHD)。已研究表明发育期铅暴露能引起NMDA受体表达、分布以及[7]转运的异常，但还没有铅暴露对AMPA受体表达的研究。在神经系统中，大量神经元通过突触相互联系，兴奋性突触主要以谷氨酸为神经递质，突触前神经元释放谷氨酸，通过突基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（博导类）(20130111110024)作者简介：丁锦君（1992-），男，博士在读研究生，环境毒理与食品安全通信联系人：汪惠丽（1974-），女，教授，博导，环境毒理与食品安全.E-mail:wanghl@hfut.edu.cn-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn触后谷氨酸受体（AMPA受体和NMDA受体），将突触前神经元信号传递给突触后。突触可塑性是指在不同环境刺激下，突触的结构和功能发生改变，以适应新环境的过程，它是神[8,9]40经系统的最重要特性之一。在神经系统的发育、学习和记忆、脑的认知等高级神经活动[10,11]过程中，均存在突触可塑性变化。突触可塑性主要表现形式为-长时程增强(Long-termpotentiation)和长时程抑制(Long-termdepression)，这两者已被公认为是学习记忆活动的细胞水平的生物学基础。[12-14]通过调节突触强度使神经元保持稳态的这种稳态突触可塑性叫做synapticscaling。45Synapticscaling最早是在培养的新皮层神经元上发现的，扰乱神经网络的活动，神经元会通过钙依赖的感受器来探测神经活动的改变，然后通过受体转运使突触后膜上的受体数目增加或减少，从而改变突触强度，神经元会通过对突触强度进行补偿调节，使神经活动回到正常[14]水平。突触强度可以通过记录微小的兴奋性突触后电流（mEPSC）来衡量，mEPSC的幅度增加了，说明神经元的突触强度增强了；mEPSC的幅度降低了，说明神经元的突触强度50变弱了。调节兴奋性的突触强度最直接的方法就是增加或减少AMPA受体在突触后膜上的累积，突触部位的AMPA受体是高度动态的，可以在突触后膜表面和质内相互转运。许多形式的突触可塑性（包括LTP和LTD）都是通过改变一种或更多的受体转移到突触后膜上[15,16][17-21]来诱导的，而synapticscaling主要是改变AMPA受体在突触后膜上的累积，AMPA受体的转运在多种形式的synapticscaling中，起着非常重要的作用。55研究铅暴露对AMPA受体表达和转运的影响，有助于进一步认识铅暴露后引起突触传递的影响，稳态突触可塑性调节的紊乱，有助进一步预防和治疗铅暴露导致的神经性疾病。1材料与方法1.1原代海马神经元的培养将刚出生24小时以内的SD大鼠用酒精消毒，断头取出大脑组织后，在解剖显微镜下60取大脑海马，置于0.03%的胰蛋白酶消化液中酶解19分钟后，用HBSS终止反应并洗去胰酶，尽量吸干液体后，加入少量的Serummedia后将海马组织吹打为细胞悬浮液。细胞计数板测定细胞悬浮液的细胞浓度后，酌情吸取细胞悬浮液加入Serummedia中，混匀后加入盛有多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine）包被过的玻璃片的24培养板中培养。培养过夜后，将70%的血清培养基换为无血清培养基Neurobasal（含有Glutamax和B27），培养7天后，50%换65液，第14天进行试验。1.2电生理试验本文中主要采用了利用全细胞膜片钳技术记录离体培养14天原代海马神经元的微小的突触后膜电位（mEPSC）的方法。玻璃微电机内注入电极内液，进入浴槽后，阻抗为4-6MΩ，电极内液成分为(mmol／L)：120CsCl2,5EGTA,10HEPES,2MgCl2,4Na2-ATP和0.370Na3-GTP,pH7.35；记录时，离体神经元一直置于灌流的胞外液中，胞外液配方为(mmol／L)：100NaCl,26NaHCO3,2.5KCl,11glucose,2.5CaCl2,1.3MgSO4和1.0NaH2PO4。使用前先放入水浴锅预热，然后通氧气-二氧化碳混合气15分钟。记录mEPSC时，在胞外液中加入TTX(1μM)阻断动作电位，pictotoxin(100μM)阻断GABAA受体，去除抑制性电流。全细胞膜片钳记录是，细胞的钳制电压为-60mV。-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn751.3免疫细胞化学原代神经元离体培养14天后，吸去24孔板的培养基，PBS洗3遍后，4%的多聚甲醛室温固定10分钟后，PBS洗净多聚甲醛，5%BSA封闭1小时，4℃过夜孵育GluR1和GluR2抗体后，用带有FITC荧光基团标记的二抗来标记GluR1和GluR2，二抗室温孵育1小时，封片观察。801.4图像采集和数据处理利用蔡司710共聚焦成像系统对细胞进行拍照，图片分析使用NIHImageJ软件和PhotoshopCS6.0处理。数据使用SPSS17.0软件统计分析，两组数据之间的差异采用独立样本t检验，三组及以上数据之间的差异采用ANOVA方差分析，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。所有统计数据均以平均值±标准误表示。852结果2.1单独1μM铅暴露不能诱导synapticscaling[22]铅暴露会降低一些参与神经递质释放的关键蛋白的表达，扰乱突触前正常的神经递[23-25][26,27]质释放。铅会阻断NMDA受体，影响NMDA受体依赖的下游信号通路。正常的神经活动被改变了，神经系统势必会做出调整来保持正常的神经活动，面对铅暴露对正常神90经活动的扰乱，神经网络会不会进行稳态突触可塑性调节，来保持正常的神经活动？因此，首先要核实铅暴露能否诱导出稳态突触可塑性调节。AMPA受体的转运是synapticscaling[28]稳态调节过程中的核心问题，而AMPA受体在许多神经活动过程中有非常重要的作用（如LTP、LTD、突触沉默、synapticscaling等），是一个高度动态的受体，例如，在用甘氨酸诱导化学LTP的过程中，甘氨酸刺激后，突触后膜上的钙通透的AMPA受体增加了，随着95时间的改变，AMPA受体由钙通透型的向钙不通透型的转变。借鉴于甘氨酸短时间处理会引起AMPA受体的高度动态变化，首先，在培养基里加入铅（工作浓度为1μM），分别处理海马神经元5分钟、15分钟，在胞外液中加入TTX阻断动作电位，加入picrotoxin阻断GABAA受体，去除抑制性电流成分，然后记录mEPSC（Fig.1和Fig.2）。结果发现，mEPSC的幅度和频率都没有显著性变化（标准化后结果，5分钟，n=22，幅度：106±2.9%，p>0.19；100频率：94±12.5%，P>0.74。15分钟，n=37，幅度：101±2.9%，p>0.59；频率：94±8.8%，P>0.72）。mEPSC频率表征突触前兴奋性的谷氨酸神经递质释放的快慢，幅度表征突触后膜上谷氨酸受体数目的多少。mEPSC的频率没有改变，说明1μM铅可能不会影响自发放的神经递质的释放，幅度没有改变说明1μM铅没有导致突触后膜上谷氨酸受体的数目发生变化，由此可见，用1μM铅处理海马神经元5分钟和15分钟都不能诱导synapticscaling。105会不会是处理的时间不够长呢？接着用1μM铅分别处理神经元4小时和24小时（Fig.3和Fig.4），结果发现mEPSC的幅度和频率依然没有显著性变化（标准化后的结果，4h，n=39，幅度：99±1.8%，p>0.76；频率：112±7.9%，P>0.99。24h，n=39，幅度：103±2.1%，p>0.19；频率：100±7.1%，P>0.36)，结果说明1μM铅处理海马神经元4小时和24小时也不能诱导synapticscaling。这说明，单独1μM铅暴露可能不能诱导synapticscaling，不会影响110突触传递效能的改变。-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图11M铅处理神经元5分钟不能诱导synapticscaling。A，用1M铅处理神经元5分钟记录的mEPSC样图（n=21-22，数据来自于3次独立的实验）。B，mEPSC的幅度没有显著性变化（P>0.05）。C，mEPSC的频率没有显著性变化（P>0.05）。比例尺：mEPSC，10pA，0.5s。115Fig.11Mleadtreatmentfor5mindidn’tsuccessfullyinducesynapticscaling.A,ThemEPSCrecordingfromtheneuronstreatedwith1Mleadfor5min(n=21-22from3independentexperiments).B,themEPSCamplitudewasnotsignificantlychanged(P>0.05).C,themEPSCfrequencywasnotsignificantlychanged(P>0.05).Scalebar:10pA,0.5s.-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn120图21M铅处理神经元15分钟不能诱导synapticscaling。A，用1M铅处理神经元15分钟记录的mEPSC样图（n=37-41，数据来自于4次独立的实验）。B，mEPSC的幅度没有显著性变化（P>0.05）。C，mEPSC的频率没有显著性变化（P>0.05）。比例尺：mEPSC，10pA，0.5s。Fig.21Mleadtreatmentfor15mindidn’tsuccessfullyinducesynapticscaling.A,ThemEPSCrecordingfrom125theneuronstreatedwith1Mleadfor15min(n=37-41from4independentexperiments).B,themEPSCamplitudewasnotsignificantlychanged(P>0.05).C,themEPSCfrequencywasnotsignificantlychanged(P>0.05).Scalebar:10pA,0.5s.-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn130图31M铅处理神经元4小时不能诱导synapticscaling。A，用1M铅处理神经元4小时记录的mEPSC样图（n=38-39，数据来自于4次独立的实验）。B，mEPSC的幅度没有显著性变化（P>0.05）。C，mEPSC的频率没有显著性变化（P>0.05）。比例尺：mEPSC，10pA，0.5s。Fig.31Mleadtreatmentfor4hdidn’tsuccessfullyinducesynapticscaling.A,ThemEPSCrecordingfromtheneuronstreatedwith1Mleadfor4h(n=38-39from4independentexperiments).B,themEPSCamplitudewas135notsignificantlychanged(P>0.05).C,themEPSCfrequencywasnotsignificantlychanged(P>0.05).Scalebar:10pA,0.5s.-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图41M铅处理神经元24小时不能诱导synapticscaling。A，用1M铅处理神经元24小时记录的mEPSC140样图（n=36，数据来自于4次独立的实验）。B，mEPSC的幅度没有显著性变化（P>0.05）。C，mEPSC的频率没有显著性变化（P>0.05）。比例尺：mEPSC，10pA，0.5s。Fig.41Mleadtreatmentfor24hdidn’tsuccessfullyinducesynapticscaling.A,ThemEPSCrecordingfromtheneuronstreatedwith1Mleadfor24h(n=36from4independentexperiments).B,themEPSCamplitudewasnotsignificantlychanged(P>0.05).C,themEPSCfrequencywasnotsignificantlychanged(P>0.05).Scalebar:10145pA,0.5s2.2铅暴露能诱导GluR1向突触后膜转运电生理实验表明单纯的铅可能不能诱导synapticscaling的发生，为了进一步探究，在铅暴露后，原代培养神经元的GluR1和GluR2总蛋白量进行的检测和分析（Fig.5），发现不管是铅暴露5分钟，15分钟和4小时，GluR1和GluR2总蛋白量都没有显著变化。150铅暴露对于GluR1和GluR2总蛋白量没有明显改变，那铅能否改变GluR1和GluR2在树突膜上的分布呢？能否干扰AMPA受体转运呢？接下来，利用免疫细胞化学的实验，分别标记了树突膜表面的GluR1和GluR2（Fig.6），结果发现，铅暴露5分钟，15分钟和4小时，树突膜表面GluR2没有明显的变化，铅暴露5分钟和4小时，树突膜表面GluR1也没有明显的变化。但是，在铅暴露15分钟后，树突膜表面GluR1发生了明显的升高。这些结果表155明，铅暴露后，AMPA受体的转运发生了变化，而AMPA受体转运在突触传递效能中起重要的作用，可以推论出铅暴露能潜在影响AMPA受体转运，从而潜在影响突触传递效能。-7- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图51μM铅暴露5min、15min和4h，海马细胞GluR1、GluR2蛋白总体表达水平并没有发生显著变化。Mean±SEM.160Fig.5After1Mleadexposurefor5min、15minand4honprimaryhippocampalneurons,expressionoftotalGluR1andGluR2didnotchangesignificantly.Mean±SEM.图61μM铅暴露5min、15min和4h，对树突膜表面的GluR1、GluR2的影响。（A）铅暴露后树突膜表面165GluR1的变化（B）铅暴露后树突膜表面GluR2的变化。Mean±SEM，比例尺10μm。P<0.05-8- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnFig.61μMleadexposurefor5min、15minand4honprimaryhippocampalneuronsinfluenceGluR1andGluR2ofdendriticmembranesurface.Mean±SEM,Scalebar10μm.P<0.053讨论170本次实验发现单独1μM铅暴露可能不能成功诱导synapticscaling。这并不能说1μM铅暴露对突触传递效能和突触可塑性没有影响。这次没有诱导出synapticscaling可能是铅暴露的浓度太低而导致没有成功诱导。MariaF.M.Braga的研究发现，用1μM铅急性灌流处理海马神经元，从2分钟开始微小的突触后电流（mPSC）的频率会逐渐升高，在15分钟时达到最大值，改用10μM铅处理，mPSC的频率会继续升高，用不含铅的胞外液洗过后，频175率部分下降，整个实验过程中幅度都没有显著性变化。用阻断剂将兴奋性电流与抑制性电流分开，用铅灌流处理神经元，分别记录mEPSC和mIPSC，结果铅既增加了mEPSC的频率，也增加了mIPSC的频率，但铅对mEPSC和mIPSC的幅度都没有显著性影响。这些结果说明铅增加自发放的神经递质的释放是铅浓度依赖的，而且是部分可逆的。用拮抗剂将兴奋性电流成分跟抑制性电流成分分开，结果，mEPSC和mIPSC的频率都显著性提高了，幅度没180有显著性变化，说明铅会同时增强自发放的兴奋性和抑制性的神经递质的释放[25]。本实验所得结果和MariaF.M.Braga的工作不尽相同，本实验中1μM铅暴露不管是短时程的5分钟和15分钟，还是长时程的4小时和24小时，海马神经元mEPSC的频率都没有发生显著性的改变。分析原因，认为可能是铅暴露方式有别于MariaF.M.Braga的铅暴露方式，本实验是在培养基里加入铅分别处理5分钟，15分钟，4小时，24小时，然后转移到chamber185里，用不含铅的胞外液灌流，可能在记录的过程中铅被洗掉了，所以没有记录到mEPSC频率升高这个过程，这也说明1μM铅对兴奋性的微小的神经递质释放的增强是完全可逆的。后续的实验发现1μM铅暴露5min，15min和4h均不会改变AMPA受体亚型GluR1和GluR2总体蛋白表达量，但是很有趣的是，发现显示急性铅暴露15min后，树突膜表面的GluR1有显著性的升高，而树突膜表面的GluR2没有显著性变化。GluR1总体表达水平没变，190而在膜表面的GluR1增多，表明不是GluR1的合成增多，而是在其他位置的GluR1迁移至树突膜表面。这说明1μM铅暴露有影响AMPA受体转运的功能，而AMPA受体转运与突触传递效能密切相关，可以推测出1μM铅暴露有能够影响突触传递效能的作用。铅暴露如何影响突触传递效能以及如何影响AMPA受体转运还需要进一步的研究。4结论195急性铅暴露15min能引起GluR1突触膜转运的效能，可能引起突触传递异常，导致神经系统异常。[参考文献](References)[1]Fang,Y.,etal.,Concentrationsandhealthrisksoflead,cadmium,arsenic,andmercuryinriceandedible200mushroomsinChina.FoodChem,2014.147:p.147-51.[2]Nigg,J.T.,etal.,Lowbloodleadlevelsassociatedwithclinicallydiagnosedattention-deficit/hyperactivitydisorderandmediatedbyweakcognitivecontrol.BiolPsychiatry,2008.63(3):p.325-31.-9- 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