香烟烟雾致BEAS-2B细胞恶性转化过程中基因组与PTPRM的DNA甲基化改变.pdf 10页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn香烟烟雾致BEAS-2B细胞恶性转化过程中#基因组与PTPRM的DNA甲基化改变**黄欢欢，纪雅慧，张佳玉，李建祥5（苏州大学医学部公共卫生学院，江苏苏州，215000）摘要：目的：探讨香烟烟雾致细胞恶性转化过程中基因甲基化改变及PTPRM甲基化改变对基因表达的影响。方法：以永生化人支气管上皮细胞（BEAS-2B）作为研究对象，建立细胞直接染烟的恶性转化的体外模型；利用流式细胞仪检测细胞周期、凋亡改变；软琼脂克隆技术分析细胞恶性转化状态；检测恶性转化细胞中全基因组甲基化的改变；采用Illumina450k10基因甲基化芯片检测恶性转化细胞中发生异常甲基化的基因；采用Realtime-PCR检测细胞中PTPRM基因表达改变和甲基化的影响。结果：染烟致恶性转化的细胞中细胞周期G1期明显缩短，S期延长，细胞处于增殖旺盛状态；随着染毒代数的增加，凋亡逐渐降低、克隆形成率逐渐上升；全基因组甲基化程度随着染毒代数增加逐渐下降；筛选出异常高甲基化的PTPRM基因，分析发现其mRNA表达随着恶性转化程度增加而逐渐降低,甲基化抑制剂155-AZA处理染烟细胞可以抑制其改变。结论：在香烟烟雾可以致BEAS-2B细胞出现恶性转化，全基因组甲基化水平降低及基因的特异性高甲基化改变都起着关键的作用。关键词：香烟；BEAS-2B；DNA甲基化；PTPRM中图分类号：R114DNAmethylationincigarettesmoke-inducedmalignant20transformationincellsHUANGHuanhuan,JIYahui,ZHANGJiayu,LIJianxiang(SchoolofPublicHealth,SoochowUniversity,Suzhou215000)Abstract:ThisstudyaimtoinvestigatetheeffectofmethylationofwholegenomeandtheroleofPTPRMmethylationongeneexpressionduringmalignanttransformationofhumanbronchialepithelial25cells(BEAS-2B)cellsinducedbycigarettesmoke.Methods:MalignanttransformationcellmodelwasestablishedbyBEAS-2Bcellexposedtocigarettesmoke.Cellcycleandapoptosiswereinvestigatedbyflowcytometry.Softagarcolonyformationweredeterminedforanalyzingthecharacteristicsofmalignanttransformation.AberrantmethylatedgeneswereselectedbyIllumina450KDNAmethylationchip.Real-timequantitativeRT-PCRwasusedtodetectthegeneexpressionofPTPRM.Results:Our30datashowthattheG1phaseofthecellcyclewassignificantlyshortened,whileitwasoppositeinSphase,andthecellswereproliferatedexuberantlyinthemalignanttransformedcells.Asconstantlyexposedtocigarettesmoke,theapoptosisrateandthelevelofgenome-wideDNAmethylationgraduaMethylationincigarettesmoke-inducedmalignanttransformationincellsllydecreased,whiletheclonalformationrateincreased.ThePTPRMgenewasscreenedoutfromtheIllumina450KDNAmethylationchip,35whichwasdecreasedongeneexpressionwiththeincreaseofmalignanttransformation.Methylationinhibitor，5-AZA,caninhibititschanges.Conclusion:Thedecreaseofgenome-wideDNAmethylationlevelandthespecifichypermethylationofgenesplaykeyrolesintheprocessofmalignanttransformationofBEAS-2Bcellsinducedbycigarettesmoke.Keywords:Cigarettesmoke;BEAS-2B;DNAmethylation;PTPRM基金项目：国家自然科学基金（81172707，81573178）作者简介：黄欢欢（1991-），女，硕士生，卫生毒理学通信联系人：李建祥（1967-），男，副教授硕导，主要研究方向：吸烟致肺细胞癌变过程中凋亡逃逸相关DNA甲基化和组蛋白修饰变化.E-mail:aljxcr@suda.edu.cn-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn400引言肺癌目前是世界上第一大癌症。2008年，我国新增215020例肺癌患者，占新增癌症病[1][2]例的15%。男性吸烟者发生肺癌的危险度是非吸烟者的22倍，而女性则为12倍。在各种致肺癌的危险因素中，吸烟被广泛认为是导致肺癌的第一大危险因素，约有90%的肺癌[3]与吸烟有关。香烟中含有7000多种化学物质，至少69种物质具有致癌作用，如多环芳45烃、亚硝胺类、1,3-丁二烯、氨甲酸乙酯等，这些物质可以通过不同机制引起机体损伤并最[4,5]终导致肺癌的发生。因此，研究香烟暴露导致肺癌的机制，对于预防和控制香烟对人类健康产生的危害具有重要的知道意义。在香烟致肺癌发生的相关机制方面的研究中，传统遗传学内容已经取得了巨大的成就，研究发现了许多与香烟致癌相关的机制。近年，对表观遗传学的研究逐渐受到人们的关注。50DNA甲基化是表观遗传学研究的重要组成部分，它是指通过DNA甲基转移酶的作用下DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶的过程，它可以调控基[6]因的表达和维持基因组完整性。大量研究表明，全基因组甲基化水平的异常降低以及部分[7-9]基因的异常高甲基化都与肺癌的发生发展有关。全基因组低甲基化通常导致DNA序列的变化，而基因特异性高甲基化可能干扰细胞过程，如细胞周期，细胞凋亡，DNA修复等。[10]55因此，异常DNA甲基化在肿瘤发生中起重要作用。过去的研究中表明，大多数肺癌起源于上皮细胞，尤其是支气管上皮细胞，它们是香烟[11]烟气的主要攻击对象。BEAS-2B细胞是SV40病毒转染的人支气管上皮细胞，具有无限生长能力，但尚未获得恶性转化特性，是建立细胞模型来研究细胞恶性转化的良好选择。本研究对BEAS-2B细胞进行香烟染毒，建立体外恶性转化细胞模型，观察BEAS-2B细胞在60恶性转化过程周期、凋亡、软琼脂形成的改变，以及全基因组甲基化水平的改变，并且筛选出发生特异性甲基化改变的基因，来探索DNA甲基化在香烟致BEAS-2B恶性转化过程中的作用机制。1实验和方法1.1.细胞培养与分组265BEAS-2B细胞培养于不含胎牛血清的LHC-8培养基（Invitrogen，USA），5％CO、37℃培养箱中，每3天传代一次。细胞设立对照组（C组）和香烟烟雾处理组（Sm组）。在开始5实验前一天，将指数生长的细胞（1×10个细胞/孔）接种在Transwell培养皿中，每个Transwell培养皿中加入1ml培养基。在培养箱中培养24小时后，将Transwell培养皿放在香烟烟雾暴露装置中，使香烟烟雾直接作用于细胞，Transwell培养皿下方加入培养基保持细胞湿润。按照70表1染毒浓度和时间，使用CCK-8（Beyotime，China）确定实验中使用的香烟烟雾的最佳浓度和时间。根据实验结果确定暴露组香烟烟雾浓度为20%，每次染烟10min，对照组烟雾浓-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn度为0%。第二天再重复染烟1次，细胞连续染烟2次作为染毒1代（记作Sm1）。收集细胞常规培养，待细胞生长至对数期，进行下一次染毒，染烟至15代进行下一步实验。1.2.细胞周期分析75将指数生长期的对照组及Sm1、Sm5、Sm10、Sm15组细胞离心收集后，加入1ml75%冰乙醇，4℃固定过夜后弃乙醇，每个样品加入500μlPI重悬，室温避光染色30min后，流式细胞仪进行细胞周期检测。1.3.细胞凋亡率的检测收集对照组及Sm1、Sm5、Sm10、Sm15组细胞，加入500μlBindingBuffer重悬细胞，80加入PI和AnnexinV-FITC各5μl混匀，室温避光反应10min，流式细胞仪检测分析细胞凋亡情况。1.4.软琼脂克隆形成实验收集对照组及Sm1、Sm5、Sm10、Sm15组细胞，在35mm平皿中加入1.5ml0.7%琼脂溶液(培养基和琼脂配制)，4℃冰箱过夜后，加入1.5ml0.35%琼脂糖细胞培养基混合液85(接种细胞为1000个/皿)，每皿加入2ml培养基，每组细胞设置3个平行样。每3d换液1次，21d后显微镜下计数细胞数多于50个的克隆数，按下式计算克隆成率(Colonyformingefficiency，CFE)。克隆形成率(CFE)=(克隆数/接种细胞数)×100%。1.5.全基因组甲基化水平检测6离心收集在对数生长期细胞中的对照组及Sm1、Sm5、Sm10、Sm15细胞，约10个细90胞，利用DNA提取试剂盒提取DNA。采用DNA甲基化检测试剂盒处理各组DNA样品后在450nm处测量吸光度来测定全基因组DNA甲基化水平。1.6.甲基化芯片筛选异常甲基化基因收集对照组以及Sm15代细胞提取DNA进行异常甲基化基因的筛选。采用Illumina450k甲基化芯片进行甲基化异常分析，芯片共可分析485577个CpG位点，在过滤过程中去除缺95失值位点，非CpG位点和SNP，通过质量控制分析保留483895个位点并在组之间进行比较。β值作为甲基化通道的强度是甲基化和非甲基化探针强度的总和，并且β值的差异变化则为暴露和对照细胞之间甲基化的改变。β变化范围在-1和1之间，当β在-1到0之间则被认为是低甲基化改变的基因，而在0到1之间作为高甲基化基因。1.7．PTPRM基因mRNA表达水平检测100根据上述的香烟烟雾染毒条件，细胞继续染烟至40代，利用芯片筛选结果，对筛选出的异常高甲基化的PTPRM基因进行进一步的研究，观察其在长期染毒过程的表达改变。并利用甲基化抑制剂5-AZA处理染烟细胞，5-AZA在处理细胞过程中的终浓度为1μmol/L，且5-AZA的溶剂DMSO在培养基中的浓度始终少于0.1%，观察PTPRM基因在甲基化抑制-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn剂作用前后的表达改变。提取对照组、染烟组Sm1、Sm10、Sm20、Sm30和5-AZA处理的105染烟各代细胞中总RNA，应用逆转录试剂盒逆转录合成cDNA，上游引物：5’ATGGACACGCACAATCTGAA3’，下游引物：5’GCACAAATGGGTCTGGGTAA3’,SYBRGreenPCRMasterMix进行实时定量PCR扩增，以GAPDH为内参，取Ct值作为测量值，采用2–ΔΔCt法对基因的表达水平进行定量。每个检测样品均设3个平行样品，重复至少3次，引物由生工科技有限公司设计合成。ΔΔCt=(染毒组目的基因Ct值均数−染毒组110GAPDHCt值均数)−(对照组目的基因Ct值均数−对照组GAPDHCt值均数)。1.8.统计学分析以上所有试验均重复3次以上，结果来源于代表性的实验。数据以均数±标准误表示，用SPSS17.0处理统计结果。用单因素方差分析检验来统计对照组与染烟组之间的统计学差异，组间比较用SNK检验，当P<0.05认为两组间具有统计学意义。1152结果2.1香烟染毒后细胞增殖抑制率的改变BEAS-2B细胞在不同浓度和作用时间的香烟烟雾染毒后呈现不同的细胞增殖抑制，根据实验结果选择一个最佳的染毒浓度和作用时间，在确保细胞存活率的情况下保证染烟顺利120进行。以5%、10%、20%香烟烟雾浓度分别对细胞染烟5min、10min、20min，完成一次染烟后采用CCK-8检测细胞增殖抑制率，结果如表1所示。随着香烟烟雾浓度的增加和染烟时间的延长，细胞增殖抑制率逐渐升高。最终选定以烟雾浓度为20%，染毒时间10min的条件进行香烟烟雾染毒。对照组暴露于烟雾浓度为0%，其他条件均相同。表1香烟烟雾染毒对细胞增殖抑制率的影响（±s，%）香烟烟雾浓度5min10min20min0%000bdc5%8.33±1.2216.47±0.8821.19±0.80dbd10%16.28±0.6526.32±1.6030.05±0.78dcb20%30.85±0.4441.24±0.3850.86±0.60125注：同一时间相比，字母不同表示两组间有统计学差异，P<0.05；同一浓度相比，不同字母表示两组间有统计学，P<0.05.2.2细胞周期改变利用流式细胞仪检测各染毒代数细胞周期。与对照组相比，各染毒组细胞G1期均有不同程度缩短，S期有不同程度延长，其中在Sm15组周期变化最为显著（P<0.05），如图1所示,表明染烟后细胞出现了一定程度的增殖失控。-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn130注：与对照组细胞相比，*P<0.05.图1.对照组与各染烟组细胞周期变化2.3细胞凋亡率的改变与对照组细胞相比，染毒细胞凋亡率均升高，且在染毒早期（Sm1）凋亡最高；与染毒135早期细胞相比，染毒代数增加(Sm5、Sm10、Sm15)凋亡均降低，差异具有统计学意义（P<0.05），如图2所示，表明在长期染烟过程中细胞存在一些可能的机制使细胞凋亡受到抑制，受损的BEAS-2B细胞不易发生凋亡，从而促进了细胞的恶性转化。注：与对照组细胞相比，*P<0.05.140图2.对照组与各染烟组细胞凋亡率-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn2.4软琼脂克隆形成测定细胞在双层软琼脂中的克隆形成率，结果发现：对照组在半固体软琼脂中生长较少，随着染毒代数增加，细胞在半固体软琼脂中形成的能力增强；与染毒早代细胞相比，细胞随着染毒代数增加(Sm5、Sm10、Sm15)在软琼脂克隆形成增加，差异具有统计学意义（P<0.05），145如图3所示。表明染毒后细胞均表现出锚着独立性生长能力，克隆数量和克隆体积均大于对照组细胞，表明细胞具有了恶性转化特性。注：与对照组细胞相比，*P<0.05；与Sm1组相比，#P<0.05.图3.对照组与各染烟组细胞软琼脂克隆形成率变化1502.5全基因组甲基化水平的改变全基因组甲基化水平结果显示，全基因组甲基化水平随染烟代数增加而逐渐降低，并且在Sm15组细胞降至最低，如图4所示。注：与对照组细胞相比，*P<0.05.155图4.对照组与各染烟组细胞全基因组甲基化表达水平2.6甲基化芯片筛选异常甲基化及相关信号通路采用Illumina450k甲基化芯片筛选分析染烟所致的甲基化差异。通过对芯片所得数据进行分析及对比后发现，与对照组细胞相比，染烟15代细胞中有69个基因启动子区发生异常高甲基化，同时有48个基因启动子区的甲基化水平低于对照组细胞。利用KEGG等生物-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn160信息分析软件与文献查询，将这些基因富集到不同的信号通路中，富集到基因数量位于前四的信号通路如表2所示，主要富集在轴突导向通路、NOD样受体信号通路、细胞粘附分子（CAM）通路及细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路。表2.KEGG分析所得富集基因数前4的信号通路pathwaycountinvolvedgenesAxonguidance3NTNG2、PAK7、RHODNOD-likereceptorsignalingpathway2LRP1、CARD8Celladhesionmolecules(CAMs)2NTNG2、PTPRMCytokine-cytokinereceptorinteraction2IL11RA、CCL262.75-AZA作用前后PTPRM基因表达改变165甲基化芯片结果分析发现染烟后出现PTPRM甲基化升高，观察其mRNA表达水平。与对照组相比，各染烟组PTPRM基因mRNA随着染毒代数的增加，表达逐渐降低，具有统计学意义（P<0.05）；而进行甲基化抑制剂5-AZA处理染烟各代细胞后，与未处理前相比，PTPRM基因的表达都有不同程度的恢复，与对照组细胞相比，其表达水平无明显变化,说明PTPRM基因表达下降是由该基因异常高甲基化引起，基因的表达受到DNA甲基化的170调控。注：与对照组细胞相比，*P<0.05;与无5-AZA处理组相比，#P<0.05.图5.对照组与各染烟组细胞5-AZA作用前后PTPRM基因mRNA表达量3讨论175肺癌是导致人类死亡的重大原因，根据流行病学调查研究发现，吸烟是导致肺癌的首要原因，但香烟致肺癌的表观遗传学机制研究尚不明确。在以往的很多研究中，通常以香烟烟雾成分提取的方式作用于细胞，而在本实验中，将BEAS-2B细胞直接暴露香烟烟雾中，更好地模拟了人类吸烟过程中支气管上皮细胞所处环境。以不同的香烟烟雾浓度以及不同的暴露时间，将BEAS-2B细胞暴露在香烟烟雾中，细胞出现了不同程度的增殖抑制，为保证香180烟烟雾对细胞产生一定程度的损伤作用，且损伤无法被细胞完全修复，而又要保证细胞有一-7- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn定的存活率以确保连续传代，最终选择香烟烟雾浓度为20%，染毒时间10min作为染毒条件。细胞周期提供了有丝分裂调节的精确时间节点，严格调控细胞的增殖。实验数据显示，将细胞持续暴露在香烟烟雾中，随着暴露时间增加，G1期逐渐缩短，S期延长，这表明细185胞DNA合成增加，是大多数肿瘤细胞的典型征兆。另一方面，对细胞凋亡的抑制也是细胞恶性转化的关键特征。我们的研究结果表明，暴露组的细胞凋亡率随着暴露时间延长逐渐下降。DNA甲基化是被甲基转移酶调控的一种表观遗传修饰，主要发生在基因5’端启动子区[12]域的CG核苷酸密集区，即CpG岛中。人类基因组中包含有29000个CpG岛，其中一半[13]190的CpG岛与启动子区域有关。研究表明全基因组异常低甲基化和部分基因启动子区域的[14,15]特异性高甲基化与肺癌的发生有关，是癌症相关的表观遗传学标志。全基因组的低甲[13]基化引起的染色质不稳定可以导致原癌基因激活、突变热点形成和突变率增加等改变。在本次实验中，我们在香烟导致的恶性转化的细胞中观察到了全基因组甲基化降低的现象。细胞增殖失控和凋亡的抑制作为癌症细胞的典型特征，它们在癌症细胞中的改变与其相关的195基因发生了异常甲基化有关。有研究报道，调控细胞周期以及细胞凋亡的基因，如p16和[16,17]RASSF1A，在各种不同的肿瘤细胞中都出现了异常甲基化。在本次研究中暴露于香烟烟气的恶性转化细胞周期失控以及凋亡的抑制与异常甲基化可能存在密切联系，其中的关系值得我们进一步深入的研究。所以，我们采用了Illumina450k基因甲基化芯片对恶性转化的BEAS-2B细胞进行异常甲基化基因的筛选。200我们将筛选出的基因，利用KEGG进行通路的富集，结果如表2所示。其中，轴突生长诱向因子G2（NTNG2）、P21活化激酶（7PAK7）及Ras同源基因家族成员D基因（RHOD）参与了轴突导向信号通路。轴突导向是神经元网络形成的关键阶段。生长锥受体读取各种指导因素，受体下游的信号转导途径会聚到RhoGTP酶上以引发细胞骨架组织的变化，决定生长锥将转向的方式。低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1）、胱天蛋白酶募集域蛋白2058(CARD8)基因参与了NOD样受体信号通路，模式识别受体的特定家族负责检测各种病原体并产生先天免疫应答。轴突生长诱向因子G2（NTNG2）和蛋白酪氨酸磷酸酶M型受体（PTPRM）参与了细胞粘附分子信号通路。细胞粘附分子是在细胞表面上表达的（糖）蛋白，并在广泛的生物过程中发挥关键作用，包括止血，免疫应答，炎症，胚胎发生和神经元组织的发育等。白细胞介素11受体亚基α（IL11RA）和C-C基序趋化因子配体26（CCL26）210参与了细胞因子—细胞因子受体相互作用信号通路。细胞因子是可溶性胞外蛋白或糖蛋白，是关键细胞间参与先天及适应性炎症宿主防御、细胞生长、分化、细胞死亡、血管生成和恢复体内平衡的发育及修复过程的调节剂和动员者。我们对甲基化芯片筛选出的异常高甲基化基因PTPRM基因进行进一步的研究，发现随着染毒代数的增加，其mRNA和蛋白表达都出现了逐渐下降的趋势，利用甲基化抑制剂2155-AZA处理暴露组细胞后，PTPRM基因的表达在各染毒代数都出现了不同程度的恢复，说-8- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn明PTPRM基因的表达降低正是受到了恶性转化细胞中PTPRM基因启动子区域异常高甲基化的调控。PTPRM基因是蛋白络氨酸磷酸酶（PTP）家族的成员，它可以调节多种细胞过[18]程，如细胞生长、分化、有丝分裂和细胞恶性转化等。研究表明PTPRM基因表达产物通[19]过与其他分子的相互作用介导细胞与细胞的聚集。在对胶质母细胞瘤的研究中发现，与220正常脑组织相比，胶质母细胞瘤中的PTPRM的表达下调，它可以调节细胞的黏附和迁移功[20,21]能，其表达下调可以促进细胞的迁移。PTPRM的表达减少也调控ERK和JNK的酪氨[22]酸磷酸化异常使乳腺癌不良预后的发生。本实验结果为PTPRM基因的异常甲基化使其表达改变可能是香烟致细胞恶性转化过程一个潜在的生物标志提供了证据。4结论225综上所述，本实验建立体外香烟烟雾诱导BEAS-2B细胞恶性转化模型，细胞在恶性转化过程出现周期失控、凋亡抑制、克隆增加等恶性转化特征，在细胞染毒过程中出现了全基因组甲基化降低的特征，同时筛选出甲基化异常升高的基因PTPRM。香烟染毒过程中发生的甲基化改变可能在BEAS-2B细胞的恶性转化中起着重要的作用。230[参考文献](References)[1]JemalA,SiegelR,WardE,etal.Cancerstatistics,2008[J].CA:acancerjournalforclinicians,2008,58(2):71-96.[2]HoffmannD,HoffmannI,El-BayoumyK.Thelessharmfulcigarette:acontroversialissue.atributetoErnstL.Wynder[J].Chemicalresearchintoxicology,2001,14(7):767-90.235[3]TyczynskiJE,BrayF,ParkinDM.LungcancerinEuropein2000:epidemiology,prevention,andearlydetection[J].TheLancetOncology,2003,4(1):45-55.[4]ChoiMS,ShimYH,HwaJY,etal.ExpressionofDNAmethyltransferasesinmultistephepatocarcinogenesis[J].Humanpathology,2003,34(1):11-7.[5]HechtSS.Tobaccosmokecarcinogensandlungcancer[J].JournaloftheNationalCancerInstitute,1999,24091(14):1194-210.[6]JaenischR,BirdA.Epigeneticregulationofgeneexpression:howthegenomeintegratesintrinsicandenvironmentalsignals[J].Naturegenetics,2003,33Suppl(245-54.[7]TingAH,McgarveyKM,BaylinSB.Thecancerepigenome--componentsandfunctionalcorrelates[J].Genes&development,2006,20(23):3215-31.245[8]UshijimaT.Detectionandinterpretationofalteredmethylationpatternsincancercells[J].NaturereviewsCancer,2005,5(3):223-31.[9]KanaiY,HirohashiS.AlterationsofDNAmethylationassociatedwithabnormalitiesofDNAmethyltransferasesinhumancancersduringtransitionfromaprecanceroustoamalignantstate[J].Carcinogenesis,2007,28(12):2434-42.250[10]HellebrekersDM,MelotteV,VireE,etal.Identificationofepigeneticallysilencedgenesintumorendothelialcells[J].Cancerresearch,2007,67(9):4138-48.[11]WilleyJC,BroussoudA,SleemiA,etal.Immortalizationofnormalhumanbronchialepithelialcellsbyhumanpapillomaviruses16or18[J].Cancerresearch,1991,51(19):5370-7.[12]ClarkSJ,MelkiJ.DNAmethylationandgenesilencingincancer:whichistheguiltyparty?[J].Oncogene,2552002,21(35):5380-7.[13]DasPM,SingalR.DNAmethylationandcancer[J].Journalofclinicaloncology:officialjournaloftheAmericanSocietyofClinicalOncology,2004,22(22):4632-42.[14]PogribnyIP,BelandFA.DNAhypomethylationintheoriginandpathogenesisofhumandiseases[J].Cellularandmolecularlifesciences:CMLS,2009,66(14):2249-61.260[15]HanahanD,WeinbergRA.Hallmarksofcancer:thenextgeneration[J].Cell,2011,144(5):646-74.[16]FernandesMS,CarneiroF,OliveiraC,etal.ColorectalcancerandRASSFfamily--aspecialemphasisonRASSF1A[J].Internationaljournalofcancer,2013,132(2):251-8.[17]HermanJG,MerloA,MaoL,etal.InactivationoftheCDKN2/p16/MTS1geneisfrequentlyassociatedwithaberrantDNAmethylationinallcommonhumancancers[J].Cancerresearch,1995,55(20):4525-30.-9- 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