光谱法研究不同粒径NAC-CdTe QDs对溶菌酶的毒性作用机制.pdf 11页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn光谱法研究不同粒径NAC-CdTeQDs对溶#菌酶的毒性作用机制1231**吴倩倩，潘洁，李曼，刘汝涛5（1.山东大学环境科学与工程学院，济南250100；2.山东科技大学化学与环境工程学院，济南250100；3.山东省核辐射与安全监测中心，济南250017）摘要：量子点是生物和生物医学领域最有发展前景的纳米材料，然而量子点对人体健康的潜10在毒性影响了它们的应用。而且以往的研究很少集中在量子点的粒径大小对蛋白质毒性的影响。因此，我们利用等温滴定微量热法(ITC)，酶活性测定以及多种光谱法（荧光光谱、紫外可见光谱和圆二色谱）等实验方法，探究了不同粒径的N-乙酰-L-半胱氨酸包被的碲化镉量子点（NAC-CdTeQDs）对溶菌酶的毒性作用。多光谱实验表明三种粒径的NAC-CdTeQDs均能引起了溶菌酶的荧光猝灭，同时改变了蛋白的二级结构和溶菌酶中的色氨酸残基的微环15境。ITC和酶活性实验显示NAC-CdTeQDs通过疏水作用力与溶菌酶发生了自发的结合，这种NAC-CdTeQDs-溶菌酶复合物的形成导致酶活性降低。通过实验证明了NAC-CdTeQDs的毒性效应与其粒径大小之间存在相互关系，即NAC-CdTeQDs粒径越大，对溶菌酶结构和功能的改变越大。关键词：环境科学；碲化镉量子点；溶菌酶；光谱法；等温滴定微量热；构象改变20中图分类号：[Q89]SpectroscopicinvestigationsontheconformationalchangesoflysozymeeffectedbydifferentsizesofN-Acetyl-L-cysteine-CappedCdTequantumdots123125WUQianqian,PANJie,LIMan,LIURuitao(1.SchoolofEnvironmentalScienceandEngineering,ShandongUniversity,Jinan250100;2.Schoolofchemistryandenvironmentalengineering,ShandongUniversityofScienceandTechnology,Jinan250100;3.NuclearandradiationsafetymonitoringcenterofShandongprovince,Jinan250017)30Abstract:Quantumdots(QDs)arethemostpromisingnanomaterialsinbiologicalandbiomedicalfields.However,thepotentialtoxicityofQDstohumanhealthhaveeffectedtheirdepthapplication.PreviousstudiesarerarelyfocusingonthesizeseffectonthetoxicityofQDs.Herein,theeffectofNAC-CdTequantumdots(QDs)withdifferentsizesonlysozymewereinvestigatedbyisothermaltitrationcalorimetry,enzymeactivityassays,andmultispectroscopicmethodsincludingfluorescence,35synchronousfluorescence,three-dimensionalfluorescence,UV–visabsorptionandcirculardichroismtechniques.ThreesizesofCdTeQDswithmaximumemissionof545nm(QDs-30min,2.7nm),575nm(QDs-60min,3.2nm)and600SpectroscopicinvestigationsontheconformationalchangesoflysozymeeffectedbydifferentsizesofN-Acetyl-L-cysteine-CappedCdTequantumdotsnm(QDs-90min,3.4Spectroscopicinvestigationsontheconformationalchangesoflysozymeeffectedby40differentsizesofN-Acetyl-L-cysteine-CappedCdTequantumdotsnm)weretested.ITCresultsprovedthatNAC-CdTeQDscanspontaneouslybindwithlysozymeandhydrophobicforceplaysamajorroleinstabilizingQDs-lysozymecomplex.Inaddition,thebindingconstantsandbindingsitesoflysozyme-QDs-90minwerehigherthanlysozyme-QDs-30minandlysozyme-QDs-60min,whichindicatedthattheaffinitybetweenlysozymeandtheQDstendedtoincreasewiththeincreasingsizeoftheQDs.45Multi-spectroscopicmeasurementsrevealedthatallofthethreesizedQDscausedstrongquenchingofthelysozyme’sfluorescenceinasized-dependentquenchingmanner.Moreover,thechangesof基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（20130131110016）；国家自然科学基金（20875055，21277081，21477067）；高等学校重大项目培育项目（708058）；山东省科技计划项目（2014GSF117027）作者简介：吴倩倩(1990-)，女，环境毒理学通信联系人：刘汝涛(1972-)，教授、博导，主要研究方向：环境污染与健康.E-mail:rutaoliu@sdu.edu.cn-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnsecondarystructureandmicroenvironmentofthetryptophanresiduesinlysozymecausedbytheQDswashigherwithbiggersize.TheresultsofenzymeactivityassaysshowedthattheinteractionbetweenlysozymeandQDsinhibitedtheactivityoflysozymeandtheinhibitingeffectwasinasize-dependent50manner.Basedontheseresults,weconcludethatNAC–CdTeQDswithlargerparticlesizehavealargerimpactonthestructureandfuctionoflysozyme.Keywords:environmentalscience;CdTequantumdots;lysozyme;spectroscopicmethods;isothermaltitrationcalorimetry;conformationalchange550引言[1]近年来，纳米材料被广泛用于生物标记、细胞成像和肿瘤治疗等重要的生物医学领域。作为一种重要的纳米材料，量子点（Quantumdots，QDs）具有很多独特的光学和电子学性[2]质，包括较高的荧光量子产率、窄而对称的发射光谱、宽的激发光谱和强的抗光性能。正60是由于其优异的光物理性质，量子点在生物医学领域有着广泛的应用前景。量子点是粒径在[3]2nm到100nm之间的半导体纳米晶体，这种纳米粒径很容易进入人体的组织和细胞中。随着量子点的不断发展和广泛应用，纳米粒子对人体健康的潜在危害也引起了人们的关注[4]。溶菌酶又称溶解酶，是由129个氨基酸残基组成的单体蛋白，它的分子质量为14.4KDa，[5]65等电点为10.8左右，分子内有4个二硫键交联，化学性质非常稳定。溶菌酶能够破坏细菌的细胞壁，使之失去对细胞的保护，导致细菌溶解死亡，也可以直接破坏革兰氏阳性菌的细[6][7]胞壁，而达到杀菌的作用。它还具有抗氧化、抗病毒、消炎等作用。溶菌酶是机体先天免疫系统中重要的效应分子，参与机体多种免疫反应。量子点可以通过呼吸系统或消化系统进入人体，进而与溶菌酶发生相互作用，引起机体[8]70损伤。量子点的毒性受到其物理化学性质和环境等因素的影响，因此不同粒径的量子点可能存在不同程度的生物毒性，所以研究量子点粒径大小与溶菌酶的毒性作用机理对深入了解量子点的潜在安全风险具有重要意义。然而目前研究量子点毒性的文章大都关注于量子点对于体内功能性酶的毒性作用机理，针对其物理化学性质对量子点毒性大小的影响研究还比较少。75本文通过等温滴定微量热法，酶活性测定以及多种光谱法等技术手段，研究了不同粒径的NAC-CdTeQDs对溶菌酶结构和功能的影响，旨在阐明NAC-CdTeQDs对溶菌酶的毒害作用以及损伤程度，为更全面地认识和评估镉系量子点毒性提供了基础数据。通过研究和分析量子点粒径大小与量子点毒性的相关性，为合理利用并最大限度地降低量子点的负面效应提供了技术支持和科学的理论参考。801材料与方法1.1试剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）、CdCl2·2.5H2O，NaBH4以及Na2TeO3、异丙醇以及NaOH用于合成不同粒径的NAC-CdTeQDs-4溶菌酶（lysozyme）：配制成1.0×10mol/L的储备液，放置在0-4℃的冰箱中避光保存，85现用现配。PB缓冲溶液（pH=7.4）：NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4·12H2O均购于天津科密欧化学试-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn剂有限公司。溶菌酶试剂盒用于测定溶菌酶的活性。整个实验用水为电阻在18.25MΩ以上的超纯水。901.2NAC-CdTeQDs的合成与表征用“一锅法”合成了NAC包被的CdTeQDs，在150mL的三口烧瓶内依次加入0.1664g−1NAC，6mLCdCl2•2.5H2O（浓度为0.1molL）以及90mL超纯水。在磁力搅拌下，加入约−12.1mLNaOH溶液（浓度为1molL）调节溶液的pH到10。然后在上述混合溶液中迅速加入0.15gNaBH4和6mlNa2TeO3溶液。搅拌5分钟后将三口烧瓶转入100°C的油浴锅中，不95同反应时间取样即可制得不同粒径的NAC-CdTeQDs。冷却后将合成的NAC-CdTeQDs与等体积的异丙醇混合离心。去除上层清液，在真空干燥器内真空干燥4小时，放置过夜后用于表征或者用超纯水分散备用。利用F-4600荧光光谱仪、UV-2450紫外-可见光分光光度计分别对NAC-CdTeQDs的水溶液进行表征。1001.3荧光光谱法将样品依次加入1.0cm荧光池中用F-4600荧光分光光度计（HITACHI，日本）进行测定。条件设置如下：激发波长设为280nm，扫描范围为290-450nm，激发与发射狭缝均为5nm，PMT（光电倍增管）的电压设为450V，扫描速度1200nm/min。1.4紫外-可见吸收光谱法105在UV-2450紫外可见分光光度计（SHIMADZU，日本）测定样品的紫外光谱图，用不加溶菌酶且相同浓度的NAC–CdTeQDs溶液作为参比溶液，混合均匀后于反应30min。条件设置如下：狭缝宽度2nm，190-320nm范围内高速扫描。1.5圆二色谱法用J-810圆二色光谱仪(Jasco,Japan)测定样品色谱图。条件设置如下：扫描范围110200-260nm；扫描速度为200nm/min；带宽设为1nm，扫描次数3次，取平均值。先测试PB缓冲溶液信号，作为背景值扣除。通过CDpro二级结构计算软件(http://lamar.colostate.edu/~sreeram/CDPro/)，计算蛋白的二级结构含量。1.6等温滴定量热实验NAC–CdTeQDs溶液与溶菌酶均用PB（0.02M，pH=7.4）溶解配制，测定前所有溶液115需过0.22μm滤膜。实验在MicrocalITC200等温滴定微量热仪上进行。条件设置如下：T=298K，将40µLNAC–CdTeQDs滴定到200µL溶菌酶溶液中，搅拌速度1000rpm/min，每滴之间的平衡时间设为120s。滴定过程中，第一滴设为0.4µL，后19滴设为2.0µL。1.7酶活性测定实验溶菌酶活性的测定采用常规浊度法，按照溶菌酶活性试剂盒的操作步骤配制样品，于[9]120530nm处以双蒸水调透光度100%，比色并记录。溶菌酶活性计算公式如下所示：-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnUT−UT20A=×2.5×80lysST−ST20(1)其中，UT2和UT0分别代表样品在5s和125s的透射率；ST2和ST0分别代表标准溶菌酶在5s和125s的透射率。2结果与讨论1252.1NAC-CdTeQDs的表征(A)Reflux:30min,60min,90min(B)0.241.00.200.80.16Refluxtime0.630min,60min,90min0.120.40.08Absorbance(a.u.)0.20.04Fluorescenceintensity(a.u.)0.000.0450500550600650700400450500550600650Wavelength(nm)Wavelength(nm)图1（A）不同回流时间条件下NAC-CdTeQDs的荧光光谱（B）不同回流时间条件下NAC-CdTeQDs的紫外可见光谱Fig.1(A)NormalizedfluorescencespectraofNAC-CdTeQDsrefluxedfordifferenttimesof30min,60min,90130min.(B)CorrespondingUV–visspectraofNAC-CdTeQDs.图1显示了合成的NAC-CdTeQDs的荧光光谱（Fig.1A）和紫外-可见吸收光谱（Fig.1B），从图中可以看出，随着回流时间的增加，NAC-CdTeQDs的荧光发射峰和紫外光谱135峰均有很明显的红移，而且NAC-CdTeQDs的荧光发射峰具有良好的对称性和较小的半峰[10]宽，这表明制备的量子点粒径是单分散且均匀的。根据Fig.1B的紫外可见光谱，结合Peng等人提出的粒径计算公式计算NAC-CdTe量子点的粒径：D=(9.8127×10-7)λ3−(1.7147×10-3)λ2+(1.0064)λ−194.84其中D（nm）表示量子点的粒径；λ（nm）是吸收峰所对应的波长值。计算出来的140NAC-CdTeQDs的粒径分别为2.7nm（QDs-30min），3.2nm（QDs-60min）和3.4nm（QDs-90min）。2.2荧光发射光谱为了研究不同粒径的NAC-CdTeQDs与溶菌酶的相互作用，在模拟生理条件下测定了两者相互作用的荧光发射光谱。145溶菌酶具有内源荧光是因为它的芳香族氨基酸残基中的色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）、[11]苯丙氨酸（Phe）能够发射荧光。其中Trp的荧光强度最高，Tyr次之，Phe最弱。如图2所示，随着NAC-CdTeQDs浓度的增加，溶菌酶位于338nm处的荧光峰强度逐渐降低。这[12]表明NAC-CdTeQDs可以绑定溶菌酶并改变其结构。此外，具有较大的粒径的量子点(QDs-90min)比小粒径量子点(QDs-30min，QDs-60min)对溶菌酶的荧光发射光谱的猝灭更明-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn150显，表明溶菌酶荧光强度的大小与NAC-CdTeQDs的粒径大小存在依赖关系。100001000030min60minA80008000A60006000GG40004000Fluorescenceintensity2000Fluorescenceintensity200000280300320340360380400420440460280300320340360380400420440460Wavelength(nm)Wavelength(nm)1000090minA80006000G4000Fluorescenceintensity20000280300320340360380400420440460Wavelength(nm)图2不同粒径的NAC-CdTeQDs对溶菌酶荧光发射光谱的影响Fig.2FluorescencespectraoflysozymeintheabsenceandpresenceofdifferentsizedNAC–CdTeQDs.-5-7155Conditions:c(lysozyme)=1.0×10mol/L;c(NAC–CdTeQDs)/(1.0×10mol/L):(A)0,(B)0.5,(C)1,(D)1.5,(E)2,(F)2.5,(G)3;pH=7.4;T=298K.2.3溶菌酶构象变化的研究2.3.1紫外-可见吸收光谱160紫外—可见吸收光谱可以用来研究蛋白质大分子与污染物小分子形成的复合物以及蛋白质分子的结构变化。溶菌酶有两个吸收峰，在212nm左右出现的强吸收峰是肽键的强吸[5]收峰，274nm处的弱吸收峰为酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸三个芳香族氨基酸的特征吸收峰。为了考察NAC–CdTeQDs对溶菌酶结构的影响，测定不同浓度NAC–CdTeQDs存在下溶菌酶的吸收光谱（图3）。从图中可以看出，随着NAC–CdTeQDs浓度的增加，溶菌酶165位于212nm处的骨骼吸收峰发生减色红移，位于274nm处的芳香族氨基酸吸收峰出现增色效应。实验结果表明NAC–CdTeQDs与溶菌酶的结合使蛋白质骨架变松散，二级结构展开，[13]引起色氨酸等芳香环氨基酸残基微环境的亲水性增加。-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn2.530min60minA2.5A2.02.01.5GG1.5AA1.01.0AbsorbanceAbsorbance0.50.5GG0.00.0200250300350400450200250300350400450Wavelength(nm)Wavelength(nm)90min2.5A2.0G1.5A1.0Absorbance0.5G0.0200250300350400450Wavelength(nm)170图3不同粒径的NAC-CdTeQDs对溶菌酶的紫外可见光谱的影响Fig.3UV-visabsorptionspectraoflysozymeintheabsenceandpresenceofNAC–CdTeQDs.-5-7Conditions:c(lysozyme)=1.0×10mol/L;c(NAC–CdTeQDs)/(1.0×10mol/L):(A)0,(B)0.5,(C)1,(D)1.5,(E)2,(F)2.5,(G)3;pH=7.4;T=298K.1752.3.2圆二色谱为了进一步探讨NAC–CdTeQDs的粒径大小对溶菌酶构象变化的影响，应用CD色谱对溶菌酶进行了测定。溶菌酶在208nm和222nm处的两个负峰是二级结构中α-螺旋的特[14]征峰。随着NAC–CdTeQDs浓度的不断增大，溶菌酶中的这两个负峰均出现了上升，表明溶180菌酶的二级结构发生了改变。利用CDpro软件计算了溶菌酶中α-螺旋、β-折叠、β-转角和无[15]规卷曲等二级结构所占的比例，计算结果如表1所示。逐渐将NAC–CdTeQDs加到蛋白液中导致溶菌酶的α-螺旋下降，其中，QDs-30min，QDs-60min，QDs-90min的α-螺旋分别下降2.1%，3.1%和5.8%。这种现象说明NAC–CdTeQDs与溶菌酶的相互作用导致了溶菌酶骨架松散，同时改变了氨基酸残基的微环境，这与紫外光谱实验得到的结论相吻合。185溶菌酶构象实验结果表明，溶菌酶构象以及微环境的改变程度与NAC–CdTeQDs的粒径大小存在明显的相关关系。粒度较大的QDs-90min对溶菌酶构象的改变比较小粒径的QDs-30min和QDs-60min颗粒更明显，这与之前的研究结果相一致。-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn1903330min60min00-3-3CC-6-6CD(mdeg)CD(mdeg)-9-9AA-12-12-15-15200210220230240250200210220230240250Wavelength(nm)Wavelength(nm)390min0-3C-6CD(mdeg)-9A-12-15200210220230240250Wavelength(nm)图4不同粒径的NAC-CdTeQDs对溶菌酶圆二色谱的影响Fig.4CDspectraofthelysozyme-NAC–CdTeQDs..-5-7195Conditions:c(lysozyme)=1.0×10mol/L;c(NAC–CdTeQDs)/(1.0×10mol/L):(A)0,(B)1.5,(C)3;pH=7.4;T=298K.表1不同浓度NAC-CdTeQDs暴露下溶菌酶结构中四种类型所占的比例Table1thepercentagesofsecondarystructureinlysozymeinfluencedbyNAC-CdTeQDs溶菌酶的二级结构(%)NAC-CdTeQDs-7浓度(1×10mol/L)α-Helixβ-Sheetβ-TurnRandomcoil027.820.121.629.330min1.526.219.821.529.7325.722.820.628.8027.519.421.927.660min1.525.920.921.429.0324.423.521.526.7027.819.221.828.090min1.525.620.921.429.1322.023.723.530.9200-7- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn2.4NAC-CdTeQDs与溶菌酶的等温量热滴定研究等温滴定量热法（ITC）可用于研究溶菌酶与NAC–CdTeQDs相互作用的完整热力学参数，包括结合常数（Ka）、结合位点数（n）、摩尔结合焓（ΔH）、摩尔结合熵（ΔS）和[16]205吉布斯自由能（ΔG）。其中自由能变（ΔG）可以通过下列热力学方程得到：ΔG=ΔH－TΔS（T为绝对温度），实验所得结果如下表2。蛋白质大分子与污染物小分子之间的相互作用通常遵循四种作用力，即氢键、范德华力、静电引力和疏水作用力。当实验结果ΔH>0且ΔS>0，说明作用过程中的主导作用力是疏水作用力。ΔH<0且ΔS>0，说明作用过程中的主导作用力是静电作用力。ΔH<0且ΔS<0，210说明作用过程中的主导作用力氢键和范德华力。由图5及表2可以看出，ΔG<0说明溶菌酶与NAC-CdTeQDs之间的相互作用可能是一个自发过程。ΔH>0且ΔS>0表明溶菌酶和[17]78NAC-CdTeQDs主要是通过疏水作用结合的。当Ka值在10到10之间时，表明污染物34小分子与蛋白之间的相互作用很强。在本实验中Ka值的数量级在10-10之间，说明NAC-CdTeQDs与溶菌酶之间的结合力相对中等。从代谢动力学的角度来说，中等的结合力215说明在体系中污染物小分子到达目标位点的扩散速率较快。此外，我们观察到QDs-90min的亲和力常数（Ka）和结合位点数（n）均大于QDs-30min和QDs-60min，这表明较大粒径QDs-90min与溶菌酶具有更强的相互作用。Time(min)30min60minTime(min)0102030400102030401.501.501.201.200.900.900.600.60µal/sec0.30µal/sec0.300.000.0040.0060.0050.0030.0040.0020.0030.0020.0010.0010.00KCal/MoleofInjectant0.00KCal/MoleofInjectant0.000.00.51.01.52.02.53.03.54.04.50.00.51.01.52.02.53.03.54.04.5MolarRatioMolarRatio-8- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnTime(min)90min0102030401.501.200.900.60µal/sec0.300.0040.0030.0020.0010.00KCal/MoleofInjectant0.000.00.51.01.52.02.53.03.54.04.5MolarRatio220图5溶菌酶与NAC–CdTeQDs的相互作用的等温量热滴定图Fig.5Isothermaltitrationcalorimetryofthelysozyme-NAC–CdTeQDs.-5-4Conditions:c(lysozyme)=1.0×10mol/L;c(NAC–CdTeQDs)=2.0×10mol/L;pH=7.4;T=298K.表2溶菌酶与NAC–CdTeQDs的结合常数225Table2ThermodynamicparametersforinteractionofNAC-CdTeQDsandlysozyme4-14-1-1-1QDsNKa(10M)ΔH(10calΔS(calmolK)ΔG(calmol)-1mol)30min0.2069.0327.46944-671260min0.26211.823.58814-677290min0.55812.58.547310-69102.5NAC-CdTeQDs与溶菌酶活性的影响溶菌酶活性的降低将会影响蛋白质的正常功能，导致代谢紊乱。本实验测定了不同浓度的NAC–CdTeQDs对溶菌酶活性的影响，结果如图6所示。从图中可以看出，溶菌酶的含−6−1230量随NAC–CdTeQDs浓度的增大而降低，当NAC–CdTeQDs的浓度达到6×10molL时，溶菌酶的活性分别降低为未染毒活性的87.4%(QDs-30min),82.4%(QDs-60min),81.5%(QDs-90min)。这些结果表明，NAC–CdTeQDs能够与溶菌酶发生反应，抑制其酶活性，导致溶菌酶–NAC–CdTeQDs复杂物的形成。此外，QDs-90min对溶菌酶活性的影响更加明显，表明NAC–CdTeQDs对溶菌酶的毒性是随着粒径的增大而增大的。235-9- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn60min30min100100808060604040Relativeactivity(%)Relativeactivity(%)20200001234560123456-6-6[Q]10mol/L[Q]10mol/L90min100806040Relativeactivity(%)2000123456-6[Q]10mol/L图6不同粒径NAC-CdTeQDs对溶菌酶活性的影响Fig.6lysozymeactivitychangesindifferentNAC-CdTeQDsconcentration.-5-6240Conditions:c(lysozyme)=1.0×10mol/L;c(NAC–CdTeQDs)/(1.0×10mol/L):(A)0,(B)1,(C)2,(D)3,(E)4,(F)5,(G)6;pH=7.4;T=298K.3结论在本文中，我们选取溶菌酶为靶分子，通过紫外-可见吸收光谱、荧光光谱、圆二色谱、ITC、酶活性测定等实验方法和手段，在分子水平上探究NAC–CdTeQDs对溶菌酶的毒性作245用机理。研究发现NAC–CdTeQDs可以自发地通过疏水作用结合溶菌酶形成溶菌酶-NAC–CdTeQDs复合物。此外，溶菌酶-QDs-90min的结合常数和结合位点数比溶菌酶-QDs-30min和溶菌酶-QDs-60min高，说明溶菌酶与NAC–CdTeQDs的结合随着粒径的增加而增大。三种粒径的NAC–CdTeQDs均能引起的溶菌酶的荧光淬灭。此外，QDs-90min导致的溶菌酶骨架结构的展开以及暴露色氨酸残基到亲水环境的构象变化更加显著。说明溶菌250酶的构象变化是随着NAC–CdTeQDs粒径的增大而增大的。根据酶活性测定结果，溶菌酶与NAC–CdTeQDs的相互作用抑制了溶菌酶的活性，这种抑制作用受到粒径大小影响。因此可以得出这样的结论：较大的粒径的NAC–CdTeQDs对溶菌酶结构和功能的影响更大。[参考文献](References)-10- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn[1]Y.Su,M.Hu,C.Fan,Y.He,Q.Li,W.Li,L.-h.Wang,P.Shen,Q.Huang,ThecytotoxicityofCdTequantum255dotsandtherelativecontributionsfromreleasedcadmiumionsandnanoparticleproperties,Biomaterials31(2010)4829-4834.[2]H.Sun,X.Yang,M.Li,S.Han,Y.Liu,X.Tan,C.Liu,R.Liu,InsightsintotheeffectofN-acetyl-L-cysteine-cappedCdTequantumdotsonthestructureandactivityofhumanserumalbuminbyspectroscopictechniques,JournalofLuminescence167(2015)1-7.260[3]B.Yang,R.Liu,X.Hao,Y.Wu,J.Du,Theinteractionsofglutathione-cappedCdTequantumdotswithtrypsin,Biologicaltraceelementresearch146(2012)396-401.[4]H.Sun,E.Cui,Z.Tan,R.Liu,EffectsofN‐‐AcetylL‐‐CysteineCappedCdTeQuantumDotsonBovineSerumAlbuminandBovineHemoglobin:IsothermalTitrationCalorimetryandSpectroscopicInvestigations,Journalofbiochemicalandmoleculartoxicology28(2014)549-557.265[5]H.Zhang,F.Hao,R.Liu,Interactionsoflead(II)acetatewiththeenzymelysozyme:Aspectroscopicinvestigation,JournalofLuminescence142(2013)144-149.[6]G.Paramaguru,A.Kathiravan,S.Selvaraj,P.Venuvanalingam,R.Renganathan,Interactionofanthraquinonedyeswithlysozyme:evidencesfromspectroscopicanddockingstudies,Journalofhazardousmaterials175(2010)985-991.270[7]Z.Chi,R.Liu,Newinsightsintothecharacterizationofthebindingoftetracyclineanalogueswithlysozyme:Abiophysicalstudy,Chemosphere86(2012)92-97.[8]H.Sun,B.Yang,E.Cui,R.Liu,SpectroscopicinvestigationsontheeffectofN-acetyl-L-cysteine-cappedCdTeQuantumDotsoncatalase,SpectrochimicaActaPartA:MolecularandBiomolecularSpectroscopy132(2014)692-699.275[9]D.Shugar,Themeasurementoflysozymeactivityandtheultra-violetinactivationoflysozyme,Biochimicaetbiophysicaacta8(1952)302-309.[10]W.W.Yu,L.Qu,W.Guo,X.Peng,ExperimentaldeterminationoftheextinctioncoefficientofCdTe,CdSe,andCdSnanocrystals,Science281(1998)2013.[11]M.Jing,W.Song,R.Liu,Bindingofcoppertolysozyme:Spectroscopic,isothermaltitrationcalorimetryand280moleculardockingstudies,SpectrochimicaActaPartA:MolecularandBiomolecularSpectroscopy164(2016)103-109.[12]C.Jash,G.S.Kumar,Bindingofalkaloidsberberine,palmatineandcoralynetolysozyme:acombinedstructuralandthermodynamicstudy,RSCAdvances4(2014)12514-12525.[13]X.Hu,Z.Yu,R.Liu,Spectroscopicinvestigationsontheinteractionsbetweenisopropanolandtrypsinat285molecularlevel,SpectrochimicaActaPartA:MolecularandBiomolecularSpectroscopy108(2013)50-54.[14]N.A.Besley,J.D.Hirst,Theoreticalstudiestowardquantitativeproteincirculardichroismcalculations,JournaloftheAmericanChemicalSociety121(1999)9636-9644.[15]B.Wallace,J.Lees,A.Orry,A.Lobley,R.W.Janes,Analysesofcirculardichroismspectraofmembraneproteins,ProteinScience12(2003)875-884.290[16]N.Karim,S.-i.Kidokoro,Preciseandcontinuousobservationofcellulase-catalyzedhydrolysisofcello-oligosaccharidesusingisothermaltitrationcalorimetry,Thermochimicaacta412(2004)91-96.[17]B.Yang,F.Hao,J.Li,D.Chen,R.Liu,Bindingofchrysoidinetocatalase:spectroscopy,isothermaltitrationcalorimetryandmoleculardockingstudies,JournalofPhotochemistryandPhotobiologyB:Biology128(2013)35-42.295-11-'