叶酸代谢在脂肪形成过程中的作用研究.pdf 9页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn#叶酸代谢在脂肪形成过程中的作用研究**刘媛，王鸿超，陈海琴，顾震南，陈永泉（江南大学食品学院，无锡214122）5摘要：本文首先选用肥胖动物模型和脂肪细胞模型，通过荧光定量PCR分析叶酸代谢途径中产NADPH的亚甲基四氢叶酸脱氢酶基因（MethylenetetrahydrofolateDehydrogenase,MTHFD）的转录水平变化；其次，通过基因沉默，结合油红O染色定量、细胞脂肪酸含量、及NADPH水平分析，探讨叶酸代谢与脂肪形成的关系。结果显示，MTHFD3种同工酶中，MTHFD2基因转录水平在不同肥胖模型中普遍上调；在小鼠骨髓基质细胞中沉默MTHFD210基因后，脂肪细胞的诱导分化受到抑制，细胞脂肪酸含量明显降低，NADPH含量水平显著下降。因此，叶酸代谢途径在脂肪形成过程中起重要作用，MTHFD2很可能是脂肪形成所需还原力的重要来源。关键词：叶酸代谢；脂肪形成；NADPH；亚甲基四氢叶酸脱氢酶中图分类号：TS201.415StudyontheeffectofFolicAcidMetabolismonFatformationLIUYuan,WANGHongchao,CHENHaiqin,GUZhennan,CHENYongquan(Schooloffoodscienceandtechnology,JiangnanUniversity,Wuxi214122)Abstract:Folicacidmetabolismisrelatedtotumorandcancerdevelopment,buttherelationshipwith20theformationoffatisrarelyreported.ThemRNAlevelsofMTHFD（NADP+-dependent）genesinbothobeseanimalstissuesandadipocytesampleswereexploredbyReal-timePCR.MTHFD2mRNAexpressionissignificantlyhigherinepididymisfatpadofobesetissuesandadipocyte.GenesilencingwasappliedtoMTHFD2,geneup-regulatedremarkablyinbothsamples.Totalfattyacid(TFA)contentandOilredOstainingresultsshowedTFAcontentwassignificantlyreduced,andtherelative25differentiationlevelwasdecreasedeither.ItshowedMTHFD2mRNAwasrelatedtolipidsynthesis.TheresultsofNADPHcontentalsoreducedcomparedwithcontrolgroup.AllresultsmayexplainMTHFD2mayassociatedwithfatformation.Keywords:FolicAcidmetabolism;lipidsynthesis;NADPH;MTHFD0引言[1]30肥胖是一种流行性疾病，能够引发一系列慢性疾病如心血管疾病、2型糖尿病，及多[2,3]种癌症等。肥胖形成的病因比较复杂，但根本上是人体摄入的能量超过消耗的热量，剩[1,4]余的能量在人体内以脂肪的形式储存在脂肪组织。研究脂肪如何形成，对理解肥胖的形成以及病理变化都具有重要意义。研究肥胖的动物模型分为基因型和膳食诱导型。其中基因型ob/ob小鼠是瘦素基因(ob)纯合突变的小鼠，常作为肥胖的代谢生理学研究及肥胖的干预35治疗研究的模型，db/db小鼠是瘦素受体的自发突变小鼠，常作为糖尿病型肥胖的模型。小鼠骨髓基质细胞(op9)常作为研究肥胖的脂肪细胞模型。乙酰辅酶A和NADPH是脂肪合成的关键因素。乙酰辅酶A是脂肪酸合成的重要底物基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目(31400038)作者简介：刘媛（1990-），女，硕士，食品与健康通信联系人：王鸿超(1985-)，男，副教授，食品生物科技.E-mail:hcwang@jiangnan.edu.cn-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn[5][6]和前体，NADPH是脂肪酸合成的还原力来源。传统认为脂质合成所需还原力的来源包[7,8][1]括磷酸戊糖途径，苹果酸酶和异柠檬酸脱氢酶(IDH)。近期科学家发现，叶酸代谢也可[9]40以为脂肪合成提供所需的NADPH。在叶酸代谢途径的研究中，亚甲基四氢叶酸脱氢酶(NADP+依赖，MTHFD)可将5,10-亚甲基四氢叶酸氧化为5,10-甲炔基四氢叶酸，此过程伴随着NADPH的生成。作者前期研究发现，叶酸代谢抑制剂可以下调亚甲基四氢叶酸脱氢酶[10]和二氢叶酸还原酶的基因转录水平，进而影响脂肪细胞的诱导分化。但是，叶酸代谢在脂肪形成中的作用尚未研究透彻。[1,11]45本文采用ob/ob、db/db和高脂诱导(DIO)小鼠为肥胖动物模型，小鼠骨髓基质细胞(op9)作为脂肪细胞模型，利用荧光定量PCR(qPCR)方法检测MTHFD基因的转录水平变化；采用基因沉默，对沉默后诱导分化的脂肪细胞进行总脂肪酸和NADPH含量的分析，从而探讨叶酸代谢与脂肪形成的关系。1材料与方法501.1材料与设备1.1.1实验材料与试剂SPF(Specificpathogenfree，无特定病原体)级雄性C57BL/6J实验小鼠ob/ob（敲除瘦素）、db/db（敲除瘦素受体）以及野生型C57BL/6J各3只，均由上海斯莱克实验动物有限公司提供；普通饲料由苏州苏斯生物科技有限公司提供；op9购自于中科院上海细胞库；液体55MEM-α培养基、胰蛋白酶、胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)购于美国hyclone公司；Rosiglitazone（罗格列酮）、青链霉素、二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)购于美国sigma®公司；油红O干粉，苏州英杰有限公司；TRIZolReagent(Invitrogen公司)；反转录试剂盒RR036A(TAKARA)；NADP/NADPHQuantificationColorimetricKit(BioVision)；Western及®IP细胞裂解液购于生工（生物工程）上海有限公司；jetPRIMEDNA&siRNAtransfection60reagent购于polyplus公司；MTHFD2抗体购于无锡莱弗斯生物实验器材有限公司；载体质粒pLVX-shRNA2-zsGreen-PGK-Puro（辉骏生物提供）；质粒抽提试剂盒购于天根生化科技有限公司；蛋白marker(26619，ThermoScientific,美国)；二抗（南京金斯瑞生物科技有限公司，中国）；β-actin一抗(SantaCruz，美国)；蛋白显影液(PerkinElmer，美国)其他试剂由江南大学物资库提供，购于国药集团化学试剂有限公司。651.1.2实验设备与仪器倒置荧光显微镜(T1-SAM)(尼康，日本)；荧光定量PCR（伯乐，美国）；凝胶成像仪（伯乐，美国）；1510MultiscanGO全波长酶标仪（热电，美国）；细胞培养箱(热电，美国)；台式离心机（热电，美国）；FluorChemFC3化学发光凝胶成像系统(美国Proteinsimple)；TS-8摇床(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；QGC-36T氮吹仪（上海泉岛公司）；70GCMS-QP2010Ultra气相色谱质谱联用仪（日本SHIMADZU）；TS-8摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）。1.2实验方法1.2.1细胞培养op9于含20%FBS(胎牛血清)的MEM-α完全培养基中培养，添加100μg/mL青霉素、-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn75100μg/mL链霉素，在37℃、5%CO2条件下培养，取对数生长期的细胞用于实验。1.2.2op9的诱导分化方法及验证[12]由于传统成脂cocktail诱导op9存在分化时间长，培养过程中分化能力减弱等问题，[13]且PPARγ是激活成脂分化的关键因素，而罗格列酮是PPARγ的激动剂。因此本文拟采用5罗格列酮对op9诱导分化并进行验证。op9培养至密度80%左右，按照2.5×10个/mL接种80于6孔板内。细胞贴壁后，每孔加入2μL1mM罗格列酮，对照组加入2μL溶剂DMSO，诱导3天。诱导分化后的op9显微镜观察并油红染色。[13]细胞内脂滴的多少一般是判定脂肪细胞分化程度的重要指标。目前关于脂肪细胞内脂滴的染色有两种方法，即油红染色和尼罗红荧光染色法。前者是应用比较广泛的，能够特异性染脂滴。首先配制油红O储存液：称取油红O干粉0.5g，置于棕色瓶中，溶于100mL85异丙醇中，于4℃保存备用。对诱导后的细胞，弃掉6孔板中培养基，每孔中加入1mLPBS洗3遍。然后每孔加入1mL10%甲醛溶液室温固定30min。PBS洗3次，每孔加入1mL油红O工作液(油红O储存液：蒸馏水=3:2)，在50℃恒温水浴锅中浸染40min。弃掉油红O，PBS洗3次，细胞中加入1mLPBS后于显微镜下观察并拍照。弃掉孔板中PBS，每孔加入1mL异丙醇，溶解油红O，并取200μL于96孔板中，测定510nm处的吸光值。90为了验证分化效果，收集诱导分化后的op9细胞样品，用GC-MS测定总脂肪酸含量。具体步骤：(1)收集细胞后称重并计算细胞重量；(2)向上述粗脂中分别加入20μL2.03mg/ml内标C17:0；(3)加入2mL无水乙醇，200μL50%KOH(保存于氮气氛围)，震荡；(4)75℃固浴1h；(5)加入2mL水，6mL正己烷震荡；(6)2000rpm离心10min，去除上层；(7)加入600μL6mol/LHCL震荡，测pH(<3)；(8)加入6mL正己烷，震荡；(9)2000rpm95离心10min,取上层至新管中，测定pH并氮气吹干；(10)2mL0.5mol/LNaOH-甲醇溶液，100℃固浴5min，冷却；(11)加入2mLBF3，100℃固浴5min，冷却；(12)加入4mL正己烷，2mL饱和NaCl震荡，2000rpm离心5min，取上层至新瓶中，氮气吹干；(13)加入1mL正己烷，转移至气相瓶中，得到脂肪酸溶液。GC-MS设置的参数为：色谱柱为DB-Waxet(30m×0.32mm，0.22μm)。氢火焰离子检100测器检测，气化室和检测器温度分别为240℃和260℃，分流方式进样1μL，分流比10:1，载气为氮气。程序升温：初始温度120℃保持3min，以5℃/min升到190℃，再以4℃/min上升到220℃，保持20min。通过与加入内标C17:0的质量比较，定性、定量分析样品中脂肪酸组分。其中总脂肪酸含量用单位细胞中总脂肪酸的质量表示。1.2.3实验动物准备105购入ob/ob鼠、db/db鼠，在江南大学实验动物中心适应一周后，取肥胖小鼠附睾脂肪垫，并以同周龄的野生型C57BL/6J小鼠作为对照。样本摘取后立即加入TRIzol放入液氮，随后全部转移到-80℃冰箱保存。购进8周龄野生型C57BL/6J小鼠，每只鼠单独笼子饲养，自由摄取水和高脂饲料（脂肪占能量的比为45%），饲喂3个月后待DIO组的体重达到40g左右，OGTT(oralglucose[14]110tolerancetest，即口服葡萄糖耐量试验)显示存在明显糖耐量受损则造模成功。取肥胖鼠的附睾脂肪垫，并以同周龄的野生型C57BL/6J小鼠作为对照。-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn1.2.4MTHFD基因转录水平测定通过KEGG并结合相关文献查找MTHFD的基因为MTHFD1、MTHFD2以及MTHFD2L。同时查找脂肪形成过程中的关键转录因子PPARγ、C/EBPα、SREBP-1。由NCBI上查找相115应基因的cDNA序列，利用PrimerPremier5设计符合要求的RT-qPCR的引物，序列如表1。表1引物序列Tab.1Primersequence基因引物序列MTHFD1-FAGAGAACACGGGGCTTTTGAMTHFD1-RCTGTGCTTCCGGGGAGCAATTMTHFD2-FACTCCCGTCCCTGGTGGTMTHFD2-RCTCTTGGCCTGCTTAGCCTMTHFD2L-FCGCACAGATACACCCCCAMTHFD2L-RGGTCTTTCCCGTCACAGGPPARγ-FTGGAATTAGATGACAGCCACTTGGPPARγ-RCTGGAGCAGCTTGGCAAAACAC/EBPα-FGGACACGGGGACCATTAGC/EBPα-RCTGGGAGGCAGACGAAAASREBP-1-FAAACTGCCCATCCACCGACSREBP-1-RGCCTCCTCCACTGCCACAβ-actin-FCCCAGGCATTGCTGACAGGβ-actin-RTGGAAGGTGGACAGTGAGGC收取诱导分化后的op9细胞样品，置于冰上操作，弃掉孔板中培养基，向每孔中加入1mLTRIzol试剂，用细胞刮刀小心将孔板中的细胞刮取下来，转移到1.5mLEP管中；对于120脂肪组织，将样本从-80℃取出室温下解冻，向每管中加入3-4颗小钢珠，放入组织破碎仪中。50Hz，40s，间隔3次，至组织完全破碎。按照TRIzol试剂说明书提取细胞和组织的总RNA。取0.5-1μg总RNA为模板，根据PrimeScriptRTreagentkit(TaKaRa,Otsu,Shiga,Japan)试剂盒说明进行操作。按照SYBRGreenPCRMasterMix(AppliedBiosystems,CA)的说明进125行RT-qPCR反应。所涉引物如表1。反应体系为20μL，其中含PowerSYBR®GreenPCRMasterMix10μL，引物各1μL，cDNA2μL，纯水7μL。PCR程序为95℃，10秒，60℃，-Ct10s进行40个循环。以β-actin作为管家基因。利用2计算基因转录水平倍数变化，其中Ct为Ct(样品)-Ct(参照)。1.2.5基因沉默130通过肥胖动物和脂肪细胞模型，筛选出叶酸代谢途径中表达变化的基因MTHFD2。根据该基因设计三条shRNA引物，送天霖生物科技有限公司合成载体。其中，shRNA序列如表2所示。采用抽提试剂盒提质粒，参照天根生化科技有限公司的质粒抽提试剂盒的说明书进行。5op9以1.0×10个细胞/mL接种到6孔板中，待细胞密度接近60%开始转染，转染前一小时135换液，同时设置空载体对照组。空载体来自本实验室保存的慢病毒载体®pLVX-shRNA2-zsGreen-PGK-Puro。取2μg质粒加入到200μLjetPRIMEbuffer，涡旋混匀；®加入4μLjetPRIME，振荡10s后，充分混匀；向6孔板中加入对应的上述混合液，缓慢加-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn入轻柔摇动孔板，使其均匀分布。转染6h后换液，24h后于倒置荧光显微镜下观察转染效率。由于载体是带有绿色荧光，通过倒置显微镜使蓝光激发看到绿色荧光的多少判断转染效140率。收集转染2天后的细胞样品，加入Western及IP细胞裂解液裂解细胞。按照BCA蛋白[15,16]浓度测定试剂盒说明书，测定细胞裂解后的蛋白浓度，之后参照Jordan等方法进行WesternBlot。表2shRNA引物序列Tab.2shRNAPrimersequence引物名称引物序列MTHFD2-s1-FGATCGCTCATGAAGAACACCATTATTCAAGAGATAATGGTGTTCTTCATGAGCTTTTTMTHFD2-s1-RAATTAAAAAGCTCATGAAGAACACCATTATCTCTTGAATAATGGTGTTCTTCATGAGCMTHFD2-s2-FGATCCGGTCATCGATGTGGGAATAATCAAGAGTTATTCCCACATCGATGACCGTTTTTMTHFD2-s2-RAATTAAAAACGGTCATCGATGTGGGAATAACTCTTGATTATTCCCACATCGATGACCGMTHFD2-s3-FGATCCGAACAGGCATTCCAACCTTATCAAGAGTAAGGTTGGAATGCCTGTTCGTTTTTMTHFD2-s3-RAATTAAAAACGAACAGGCATTCCAACCTTACTCTTGATAAGGTTGGAATGCCTGTTCG1451.2.6基因沉默效果验证[14]转染后的op9，按照1.2.2诱导分化，一组经油红染色镜检拍照，之后测定吸光值。一组诱导分化后收集细胞，分别按照1.2.4分析脂肪形成关键转录因子的转录水平，另一组按照1.2.2测定基因沉默后细胞脂肪酸含量的变化，并检测NADPH含量。NADPH提取采用NADP/NADPH测定试剂盒(Biovision公司)，根据说明书并做细微改6150进。用胰酶消化细胞成4×10个细胞于2mLEP管中，加入800μLNADP/NADPHExtractionbuffer，置于冰上10min，离心(10000×g，10min)；转移上清至超滤管中，过滤除去酶；剩余步骤参考说明书进行；计算出NADPH质量后，结合op9的数量比算出NADPH重量/细6胞量(10个细胞)。1.3统计方法155测定结果采用GrapPadPrism5软件进行分析；平均值±标准偏差(SD)来表示，n=3。2结果与分析2.1op9的诱导分化油红O是一种对油脂呈特异性的染料，op9被诱导分化为脂肪细胞后，产生的油滴能与油红O结合呈现红色。op9诱导3天的油红染色结果如图1所示。诱导前op9内观察不到油160红染色情况，并无脂滴形成（如图1A,C）。诱导后细胞由梭状变为圆形，能观察到明显的油红染色结果，胞内有脂滴出现（如图1B,D）。由图1E可以看出，op9诱导后细胞相对分化率显著升高。图1F表明，诱导成功后的脂肪细胞的总脂肪酸(TFA)含量相比对照组op9提高了2.5倍左右，证明op9诱导分化为脂肪细胞过程中脂滴积累显著增多。图1G结果表-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn明，随着诱导分化，脂肪生成转录因子PPARγ、C/EBPα、SREBP1的表达水平均发生明显165上升。其中C/EBPα的表达上升15倍以上，表明op9在分化过程中激活了脂肪生成的相关转录因子。因此，op9成功诱导分化为脂肪细胞。图1op9的诱导分化。其中，A、B为诱导前后10×油红染色结果；C、D为诱导前后20×油红染色结果；E为油红染色定量结果；F为诱导后op9脂肪酸结果；G为op9诱导后与脂肪合成相关基因转录水平。nc170为未分化细胞，R为分化后细胞(*,P<0.05;**,P<0.01;***,P<0.001)Fig.1op9induceddifferentiationresults.A、B:OilredOstainingof10×;C、D:OilredOstainingof20×;E:OliredOstainingquantitativeresultsF:Fattyacidanalysisresults;G:AdipogenicgenesmRNAlevels.(*,P<0.05;**,P<0.01;***,P<0.001)2.2叶酸代谢在脂肪细胞形成过程中的转录水平变化175op9诱导分化后MTHFD基因的转录水平如图2A所示，可以看出MTHFD2转录水平发生显著性上调，相比之下MTHFD1以及MTHFD2L转录水平没有显著性变化。结果表明，在op9脂肪细胞形成过程中发挥重要作用的基因可能为MTHFD2。2.3叶酸代谢在肥胖小鼠脂肪形成中的转录水平变化不同的肥胖小鼠模型脂肪形成中，MTHFD的基因表达情况如图2所示。180-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图2叶酸代谢基因转录水平。其中，A为op9诱导分化模型；B为ob/ob鼠模型；C为db/db鼠模型；D为DIO鼠模型。(*,P<0.05;**,P<0.01;***,P<0.001)Fig.2GenesofFolicacidmetabolismmRNAexpression.A:op9differentiation;B:ob/ob;C:db/db;D:DIO.(*,P<0.05;**,P<0.01;***,P<0.001)185可以看出在ob/ob鼠（图2B）、db/db鼠（图2C）以及DIO鼠（图2D）的附睾脂肪垫中，MTHFD2基因转录水平显著提高；MTHFD1在ob/ob鼠及DIO鼠附睾脂肪垫中转录水平显著下调，而在db/db鼠中无明显变化；MTHFD2L则在三种肥胖模型中表达没有显著型变化。由此可知，在ob/ob鼠、db/db鼠以及DIO模型中，MTHFD2同样可能在脂肪形成过程中起关键作用。1902.4MTHFD2在肥胖形成过程中的作用2.4.1MTHFD2的基因沉默上述肥胖动物和脂肪细胞qPCR结果显示，MTHFD2基因可能与肥胖模型脂肪的形成有关。为验证MTHFD2在脂肪形成中的作用，我们对该基因进行基因沉默。对该关键基因设计三对shRNA靶点，序列如表2所示，送天霖生物科技有限公司构建。构建成功后，将195不同靶点质粒转染进入op9，转染24小时后收集蛋白样品，进行westernblot验证沉默靶点。结果如图3所示，可以看出MTHFD2的s2和s3靶点基因沉默效果比较好。图3MTHFDWesternBlot条带图Fig.3WesternBlotresultsofsiliencingrelatedgene2002.4.2MTHFD2基因沉默对op9诱导分化的影响基因沉默MTHFD2后，脂肪细胞的分化结果如图4A-D，表明s2及s3成功抑制了op9的脂滴形成过程，与对照组相比不仅脂滴数量变少，而且脂滴形态大小变小，相对分化率明显减少。因此，MTHFD2基因沉默抑制了脂肪细胞的诱导分化。205图4MTHFD基因沉默对op9诱导分化的影响。其中，A-D为空载体、s1、s2、s3沉默载体油红染色结果；E为相应沉默载体油红染色定量结果。(*,P<0.05;**,P<0.01;***,P<0.001)Fig.4OilredOstainingandquantitativeresultsofsiliencingrelatedgene.A-D:OilredOstainingresultsofcontrol,s1-s3vector;B:quantitativeresultsofdifferentsilencingvectors.(*,P<0.05;**,P<0.01;***,P<0.001)2.4.3MTHFD2基因沉默对op9脂质积累的影响210选取靶点s2沉默MTHFD基因后，op9脂肪形成过程中细胞总脂肪酸的含量减少29%（图5A），细胞NADPH含量下降27%（图5B），脂肪生成相关转录因子的表达水平明显-7- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn下调（图5C）。因此，叶酸代谢途径在脂肪细胞脂肪形成过程中起重要作用，MTHFD2很可能是脂肪形成所需还原力的重要来源。215图5MTHFD基因沉默对op9脂肪形成的影响。A：op9总脂肪酸含量；B：op9NADPH含量；C：op9脂肪生成基因转录水平。nc为空载体(*,P<0.05;**,P<0.01;***,P<0.001)Fig.5Lipidaccumulationofsilience.A:Totalfattyacidresults;B:NADPHcontent;C:AdipogenicgenesmRNAlevels.(*,P<0.05;**,P<0.01;***,P<0.001)3结论220本文在细胞水平证明了叶酸代谢途径在肥胖形成过程中的重要作用，表明MTHFD2是脂肪合成所需NADPH的重要来源，这对揭示肥胖的形成具有重要的意义。下一步可通过在动物水平的抑制剂和基因敲除试验进一步探究叶酸代谢途径在脂肪形成中的作用机制。[参考文献](References)225[1]Sangachin,M.G.andL.A.Cavuoto,Obesity-relatedchangesinprolongedrepetitiveliftingperformance.AppliedErgonomics,2016.56:p.19-26.[2]Ambati,S.,etal.,Effectsofleptinonapoptosisandadipogenesisin3T3-L1adipocytes.BiochemicalPharmacology,2007.73(3):p.378-384.[3]Kim,H.K.,etal.,Effectsofleptinandclenbuterolonadipogenesisandapoptosisof3T3-L1adipocytesinvitro.230ObesityResearch,2004.12:p.A115-A116.[4]Levine,A.S.andC.J.Billington,Obesity:Progressthroughgeneticmanipulation.CurrentBiology,1998.8(7):p.R251-+.[5]Shi,L.andB.P.Tu,Acetyl-CoAandtheregulationofmetabolism:mechanismsandconsequences.CurrentOpinioninCellBiology,2015.33:p.125-131.235[6]Maddocks,O.D.K.,C.F.Labuschagne,andK.H.Vousden,LocalizationofNADPHProduction:AWheelwithinaWheel(vol55,pg158,2014).MolecularCell,2014.56(4):p.608-608.[7]Lin,R.T.,etal.,6-PhosphogluconatedehydrogenaselinksoxidativePPP,lipogenesisandtumourgrowthbyinhibitingLKB1-AMPKsignalling.NatureCellBiology,2015.17(11):p.1484-1496.[8]Locasale,J.W.,etal.,Phosphoglyceratedehydrogenasedivertsglycolyticfluxandcontributestooncogenesis.240NatureGenetics,2011.43(9):p.869-U79.[9]Fan,J.,etal.,Quantitativefluxanalysisrevealsfolate-dependentNADPHproduction(vol510,pg298,2014).Nature,2014.513(7519):p.574-574.[10]Harris,R.A.,etal.,GenomicVariantsAssociatedwithResistancetoHighFatDietInducedObesityinaPrimateModel.ScientificReports,2016.6.245[11]王鸿超，刘媛，顾震南，等.叶酸代谢抑制剂对小鼠骨髓基质细胞增殖和分化的影响[J].食品科学，2016.http://www.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20160623.1619.114.html.[12]Wolins,N.E.,etal.,OP9mousestromalcellsrapidlydifferentiateintoadipocytes:characterizationofausefulnewmodelofadipogenesis.JournalofLipidResearch,2006.47(2):p.450-460.[13]Rodeheffer,M.S.,K.Birsoy,andJ.M.Friedman,IdentificationofWhiteAdipocyteProgenitorCellsInVivo.-8- 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