双链RNA结合蛋白TRBP、PRKRA在miRNA成熟过程中的调控作用.pdf 6页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn双链RNA结合蛋白TRBP、PRKRA在miRNA成#熟过程中的调控作用12**苏位君，李帅5（1.南开大学医学院；2.天津医科大学肿瘤医院乳腺病理研究室，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市“肿瘤防治”重点实验室，天津市恶性肿瘤临床医学研究中心）摘要：miRNA是一类具有重要调控功能的小分子非编码RNA，广泛参与发育、细胞增殖、10凋亡、周期等多种重要生物学过程的调节。Dicer是miRNA加工成熟过程中重要的节点蛋白。双链RNA结合蛋白TRBP、PRKRA可与Dicer发生蛋白-蛋白相互作用。这种相互作用可以调节Dicer活性及其对pre-miRNA切割位点选择，从而对miRNA的表达及序列产生影响。本文对TRBP、PRKRA通过Dicer调控miRNA表达的机制作一综述。关键词：生物大分子的结构和功能；TRBP；PRKRA；Dicer；miRNA15中图分类号：Q71RoleofdoublestrandedRNAbindingproteinTRBPandPRKRAinmiRNAbiogenesis12WeijunSu,ShuaiLi20(1.SchoolofMedicine,NankaiUniversity;2.DepartmentofBreastCancerPathologyandResearchLaboratory,TianjinMedicalUniversityCancerInstituteandHospital,NationalClinicalResearchCenterforCancer.KeyLaboratoryofCancerPreventionandTherapy,Tianjin.Tianjin"sClinicalResearchCenterforCancer.)Abstract:miRNAisakindofsmallnon-codingRNAwhichplaysakeyroleinmultiplebioprocess25includingdevelopment,cellproliferation,apoptosisandcellcycle.DicerisacrucialenzymeinvoledintomiRNAbiogenesis.DoublestrandedRNAbindingproteinTRBPandPRKRAcouldinteractwithDicertherebyhaveanimpactonmiRNAexpressionandthecuttingsiteselectiononpre-miRNA.HerewereviewthecurrentknowledgeoftheimpactofTRBPandPRKRAonmiRNAbiogenesis.Keywords:biomacromolecule;TRBP;PRKRA;Dicer;miRNA300引言miRNA是一类长度约为22个碱基并具有重要调控功能的小分子非编码RNA（non-codingRNA）。1993年，Ambros等在研究秀丽隐杆线虫（C.elegans）幼虫发育过程中发现lin-4[1]基因可产生长约22个碱基的小分子RNA。此外，他们还发现这个小分子RNA能够通过[1,2]35结合lin-14基因mRNA的3′非翻译区（3’untranslatedregion,3’UTR）抑制其翻译。截至目前已经从包括人类在内的各种真核生物中克隆到了大量miRNA。miRNA加工产生是一个多步骤的反应过程，有多种蛋白参与到其中。生物基因组中编码miRNA的基因在RNA聚合酶Ⅱ或RNA聚合酶Ⅲ（RNApolymeraseIIorIII）的作用下基金项目：高等学校博士点专项科研基金——新教师类（20131202120002）；天津市应用基础与前沿技术研究计划——青年项目（15JCQNJC11700）作者简介：苏位君（1987年），女，讲师，肿瘤学通信联系人：李帅（1982年），男，副研究员，小RNA、肿瘤转移.E-mail:shuai.li2001@gmail.com-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn转录生成初级转录产物（primarymiRNA,pri-miRNA），pri-miRNA在Drosha复合物的作用40下被加工成具有茎环结构的miRNA前体（precursormiRNA,pre-miRNA），pre-miRNA由转运蛋白5（Exportin-5）转运出核，在细胞质中由Dicer复合物进一步切割产生双链miRNA，[3]随后miRNA双链解链生成成熟的miRNA。成熟的miRNA会进入RNA诱导的沉默复合[4]物（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC），从而引起靶mRNA的降解或翻译抑制。双链RNA结合蛋白（doublestrandedRNAbindingprotein,DRBP）是一类含有双链RNA45结合结构域（dsRNAbindingdomain,dsRBD）的蛋白，可以结合短至11碱基的双链RNA，[5]目前认为DRBP没有序列特异性。人类中已发现20多种DRBP，这些DRBP具有不同的[5]功能。双链RNA结合蛋白Drosha、Dicer对miRNA的加工产生具有基础性作用，Drosha[6]负责切割pri-RNA产生pre-miRNA，Dicer负责切割pre-miRNA产生成熟miRNA。此外，双链RNA结合蛋白DGCR8、TRBP、PRKRA通过与Drosha、Dicer的结合调控miRNA的[6]50加工生成。本综述将总结并讨论双链RNA结合蛋白TRBP、PRKRA对miRNA成熟的调控作用。1双链RNA结合蛋白TRBP、PRKRA的发现及功能1.1TRBP的发现及功能1991年，通过筛选humanimmunodeficiencyvirustype1（HIV-1）病毒TARRNA结构[7]55结合蛋白，Gatignol等在HeLa细胞cDNA库中克隆得到TRBP基因。1995年，Kozak等[8]通过序列分析确定了人和小鼠中的TRBP基因序列。TRBP（TARRNA-Bindingprotein2）定位于人类12号染色体13.13区域，含有345个氨基酸及3个双链RNA结合结构域（dsRBD）。第一个dsRBD定位在31-96氨基酸序列，第二个dsRBD定位在160-226氨基酸序列，第三[9]个dsRBD定位在298-366氨基酸序列。第三个dsRBD又称C4结构域，该结构域不结合[10]60RNA，可介导TRBP与其它蛋白的相互作用。[11,12]TRBP蛋白可与另一个DRBPPKR蛋白发生蛋白-蛋白相互作用。PKR在天然免疫（innateimmunity）过程中具有核心的作用，可通过结合低浓度dsRNA激活其丝氨酸/酪氨[13]酸激酶活性，进而通过磷酸化eIF2a调节蛋白翻译的起始。TRBP通过与PKR的直接结[11,12]合抑制其激酶活性从而调控天然免疫过程。大量证据表明TRBP有促进肿瘤细胞增殖的[14]65作用。过表达TRBP可使细胞发生转化，将细胞注入裸鼠中可导致肿瘤的形成。TRBP过[15]表达导致的成瘤性与其对PKR的抑制有关，PKR失活突变也可以导致类似的成瘤性。1.2PRKRA的发现及功能[16]1998年，Patel等克隆到了与PKR相互作用的PRKRA基因。1999年，Ito等克隆到[17]小鼠中PRKRA的同源基因RAX，两者的同源性达到了98%。PRKRA（Proteinkinase,70interferon-inducibledouble-strandedRNA-dependentactivator）又名PACT，定位在人类2号染色体的31.2位点，有313个氨基酸，3个dsRBD。与TRBP相反，PRKRA可与PKR结合从而激活PKR的活性，且这种激活作用不依赖[16]dsRNA。Ito等发现小鼠细胞在应激状态下可磷酸化PRKRA，磷酸化的PRKRA可与PKR[17]发生相互作用，从而激活PKR。Kok等发现PRKRA可与细胞内病毒感应器（virussensor）-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn[18]75RIGI的碳端（Cterminal）发生相互作用进而促进RIGI诱导产生干扰素。PRKRA对于RIGI基因介导的抗病毒反应的起始与维持至关重要。来自巴西和波兰的两个独立遗传学研究发现，PRKRA的P222L氨基酸突变与早发型肌张力[19,20]障碍（early-onsetdystonia-16,DYT16）相关。此外，在329例成年发作型肌张力障碍患者中发现了3个新突变（T34S,N102S,andc.-14A-G）。801.3TRBP与PRKRA的相似与不同人类TRBP和PRKRA蛋白的结构很类似，且都有三个双链RNA结合结构域，氨基酸序列相似度为42％。TRBP和PRKRA都可以与PKR发生蛋白相互作用，但两者对PKR的激酶活性有截然相反的调控活性——TRBP抑制PKR活性而PRKRA激活PKR活性。此外，TRBP[21,22]与PRKRA之间也可以发生相互作用。TRBP和PRKRA在与PKR相互作用过程中也存85在相互竞争，研究表明利用小干扰RNA抑制TRBP或TRBP敲除的情况下，PRKRA对PKR[23]的激活作用才能发生。在应激情况下，PRKRA的287位氨基酸可被磷酸化从而抑制了其与TRBP形成二聚体（dimer），从而使PRKRA可与PKR结合进而激活其激酶活性。由此可知，TRBP与PRKRA还可以通过相互作用调控彼此功能。2TRBP与miRNA的加工成熟902.1TRBP与Dicer的相互作用Dicer是催化miRNA加工成熟的最后一步——pre-miRNA产生成熟miRNA的核心酶，敲除Dicer可导致miRNA缺失。作为双链RNA结合蛋白，Dicer可与其它双链RNA结合蛋白结合，且这种结合具有物种保守性。DRBP蛋白Loqs-PA、Loqs-PB可与果蝇Dicer同源基因[24]Dcr-1结合，是miRNA加工成熟的必要蛋白。与TRBP、PRKRA类似，Loqs-PA、Loqs-PB95都含有三个dsRBD。2005年，Chendrimada等利用含Flag标签的Dicer进行蛋白亲和纯化后经SDS-PAGE电泳[25]及银染显色发现Dicer相互作用蛋白，后经质谱鉴定为TRBP蛋白。为了进一步验证TRBP-Dicer之间的相互作用，作者利用Flag-TRBP融合蛋白亲和纯化其相互作用蛋白，Westernblot检测发现了Dicer蛋白。由此证明TRBP与Dicer存在蛋白相互作用，并共同存[25]100在于500-kDa复合物中。同年，Haase等也利用蛋白免疫共沉淀实验[26]（co-immunoprecipitation）证实了Dicer与TRBP之间的相互作用。利用电子显微镜（electronmicroscopy）及蛋白晶体结构解析（crystalstructure）方法，TRBP与Dicer相互作[27,28]用的细节得以揭示。Dicer的PBD结构域（269-401氨基酸）与TRBP的第三个dsRBD（258-366氨基酸）存在直接相互作用。1052.2TRBP与miRNA的生成Chendrimada等利用纯化得到的Dicer和TRBP蛋白消化同位素标记的miRNA前体[25]miR-(23a-27a-24-2)发现Dicer-TRBP可产生成熟的miRNA。利用小干扰RNA抑制Dicer或TRBP后都可显著降低HeLa细胞内源性miRNA（miR-16、miR-23、miR-20、let-7a-1）的表达。而抑制TRBP表达没有影响Dicer蛋白的表达，这说明TRBP对miRNA表达的影110响并不是通过调控Dicer蛋白的稳定性。同时，报告基因实验发现抑制TRBP后miRNA的-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn[25]基因调控活性降低。Haase等也发现RNA干扰抑制TRBP后可降低细胞内miRNA的表[26]达。Lee等的研究结论与以上发现有矛盾，他们发现利用RNA干扰抑制TRBP后内源[29]miRNA的表达没有受到明显抑制。他们认为这与细胞内源性miRNA具有很高的稳定性[30]有关。在RNA干扰有效时效内（一般48-72小时），干扰TRBP后可能还不会影响到内115源miRNA。Kim等利用TALEN技术彻底删除HeLa细胞内TRBP后（TRBPknockout）发[31]现内源miRNA还是没有改变。综上，TRBP在miRNA加工生成过程中的作用还有待进一步的研究。3PRKRA与miRNA的加工成熟3.1PRKRA与Dicer的相互作用1202005年，Lee等发现PRKRA存在于一个含有Dicer、Ago2、TRBP约500-kDa的复合物中，Flag标签PRKRA可与V5标签Dicer免疫共沉淀。研究者进一步构建了PRKRA（mDR1、mDR2、mDR3）与Dicer（△DEAD、△HelicC、△DUF、△PAZ）的系列截断体，利用蛋白质免疫共沉淀实验，证实PRKRA通过其第三个dsRBD与DicerN端helicase基序存在相[30]互作用。由此可见，与PKR相似，TRBP与PRKRA与Dicer具有相似的相互作用模式。[30]125此外，Lee等还发现PRKRA还与RISC复合物的重要成分Ago2存在相互作用。3.2PRKRA与miRNA的生成通过miRNA体外加工实验，Lee等发现PRKRA不是miRNA加工生成所必须的组分。利用siRNA抑制PRKRA后，内源性miRNA表达没有发生改变。利用miR-30a诱导性表达的HeLa细胞（miR-30ainducibleHeLacellline），研究者发现siRNA抑制PRKRA后新产生的miR-30a[30]130表达下调。Kim等利用TALEN技术彻底敲除HeLa细胞内PRKRA后经小RNA深度测[31]。序（smallRNAdeepsequencing）后发现内源性miRNA的表达没有发生改变Li等发现肝脏特异性miR-122可抑制PRKRA的表达。利用siRNA抑制PRKRA后可促进新miRNA（CMV[32]启动子调控下的miRNA）的生成，这与Lee等结论相矛盾。在人类细胞中干扰或者敲除PRKRA对细胞内源性miRNA表达无影响，这个结论已由不同的实验所证实。而抑制PRKRA135后对新生成miRNA的表达影响目前还存在争议，有待进一步研究。4TRBP、PRKRA对miRNA的isomiR的影响isomiR指成熟miRNA序列与miRBase数据库中参考序列（referencesequence）相比存在的[33]序列变化。miRNA主要通过种子序列（miRNA的第2~8个碱基）与其靶基因3’UTR互[34]补结合以发挥调控功能。miRNA5’端的变化可以改变其对靶基因调控的特异性。由此，140miRNA5’端的精确加工面临着巨大的选择压力。人类细胞内Drosha和Dicer分别负责切割产生来自miRNA前体5’arm和3’arm的miRNA5’端。为了决定切割位点，Drosha和Dicer分别识别特定的RNA结构并在一定距离之外切割RNA序列。Drosha-DGCR8复合物中的[35]DGCR8结合stem-ssRNA交界部位并由Drosha在11bp之外进行切割。而Dicer则识别双[36]链RNA末端的3’悬突并在约22bp之外进行切割。在细胞内，pre-miRNA的3’端可被末[37]145端核酸转移酶或者核酸内切酶修饰造成了相对不稳定的3’悬突。Dicer这种相对不稳定的参考位点导致其产生miRNA的5’端相对浮动较大。Dicer与TRBP、PRKRA的结合会对-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnmiRNA的isomiR产生何种影响？Lee等利用miRNA体外加工实验证实TRBP与Dicer协同[38]作用下，会产生较经典miRNA序列（canonicalsequence）长一个碱基的isomiR。Koscianska等利用NorthernBlot比较了Dicer蛋白体外加工miRNA与细胞内源miRNA，发现Dicer需[39]150要TRBP、PRKRA等蛋白来保证miRNA的有效、正确加工。近年来随着小RNA高通量测序技术的发展，不但能检测小RNA的表达还可以对miRNA的isomiR进行注解。Fukunaga等研究了果蝇中TRBP、PRKRA同源蛋白Loqs-PA、Loqs-PB、[40]Loqs-PD对isomiR的影响。研究结果显示Loqs-PD可促进Dicer-2对内源、外源siRNA的加工，Loqs-PB可调节Dicer-1的切割活性导致产生更长的miR-307a的产生。Loqs-PB在155人类中的同源蛋白TRBP也可以影响Dicer对miR-132前体的切割选择，但PRKRA却没有[40]这种影响。Wilson等在Dicer敲除的小鼠细胞内表达野生型Dicer（WtDicer）以及突变型Dicer（MutDicer），突变型Dicer可阻止其与TRBP、PRKRA的相互作用从而消除两者对miRNA加工的影响。深度测序分析发现let7f-2、miR-10b、miR-99a、miR-99b、miR-100、miR-125a表达发生了改变，以miR-30e为代表的14个miRNA出现了5P、3PmiRNA的表[28]160达转变，即5P/3P比例发生了变化。5展望miRNA是细胞不可缺少的重要调控分子，而其前体pre-miRNA作为一个具有茎环结构RNA出现在细胞质中可能会被误认为是病毒来源的dsRNA从而激活PKR途径导致细胞的死亡，这是细胞需要避免的一种情况。TRBP和PRKRA能够同时调控PKR途径和miRNA加工过165程，两者通过与Dicer和PKR的相互作用，在保证miRNA正常加工生成的同时抑制PKR的激活，其具体的分子机制以及PKR和miRNA通路之间的平衡模式还有待进一步的研究。此外，目前TRBP、PRKRA对细胞内源性及新生成miRNA的表达调控还不明确，不同研究有不同的、甚至是相互矛盾的结论。这些都有待于研究者进行新的实验以进行验证。[参考文献](References)170[1]LeeRC,FeinbaumRL,AmbrosV.TheC.elegansheterochronicgenelin-4encodessmallRNAswithantisensecomplementaritytolin-14[J].Cell.1993,75(5):843-854.[2]WightmanB,HaI,RuvkunG.Posttranscriptionalregulationoftheheterochronicgenelin-14bylin-4mediatestemporalpatternformationinC.elegans[J].Cell.1993,75(5):855-862.[3]BartelDP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,andfunction[J].Cell.2004，116(2):281-297.175[4]AmbrosV.ThefunctionsofanimalmicroRNAs[J].Nature.2004,431(7006):350-355.[5]SaundersLR,BarberGN.ThedsRNAbindingproteinfamily:criticalroles,diversecellularfunctions[J].FASEBJ.2003,17(9):961-83.[6]HaM,KimVN.RegulationofmicroRNAbiogenesis[J].NatRevMolCellBiol.2014,15(8):509-24.[7]Gatignol,A.,Buckler-White,A.,Berkhout,B.,Jeang,K.T.CharacterizationofahumanTARRNA-binding180proteinthatactivatestheHIV-1LTR[J].Science1991,251:1597-[8]Kozak,C.A.,Gatignol,A.,Graham,K.,Jeang,K.T.,McBride,O.W.GeneticmappinginhumanandmouseofthelocusencodingTRBP,aproteinthatbindstheTARregionofthehumanimmunodeficiencyvirus(HIV-1)[J].Genomics1995，25:66-72.[9]DanielsSM,GatignolA.ThemultiplefunctionsofTRBP,atthehubofcellresponsestoviruses,stress,and185cancer[J].MicrobiolMolBiolRev.2012,76(3):652-66.[10]DanielsSM,Melendez-PeñaCE,ScarboroughRJ,DaherA,ChristensenHS,ElFarM,PurcellDF,LainéS,GatignolA.CharacterizationoftheTRBPdomainrequiredfordicerinteractionandfunctioninRNAinterference.BMCMolBiol.2009,10:38.doi:10.1186/1471-2199-10-38.[11]CosentinoGP,VenkatesanS,SerlucaFC,GreenSR,MathewsMB,SonenbergN.190Double-stranded-RNA-dependentproteinkinaseandTARRNA-bindingproteinformhomo-andheterodimersinvivo.Proc[J].Natl.Acad.Sci.U.S.A.1995,92:9445-9449[12]ParkH,DaviesMV,LanglandJO,ChangHW,NamYS,TartagliaJ,PaolettiE,JacobsBL,KaufmanRJ,VenkatesanS.Interactionsbetweenthedouble-strandedRNA-bindingproteinsTRBPandPACTdefinethe-5- 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