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'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn#亲水支架细胞培养的染色方法**皮彦斌，孟庆阳，敖英芳（北京大学第三医院运动医学研究所，北京，1000191）5摘要：目的：发现一种检测亲水支架上细胞培养状态的方法。方法：将待检测细胞接种到亲水支架上进行培养，至待检测细胞在亲水支架上的生长融合率为90%-95%时，获得支架-细胞复合体系。采用吖啶橙染色液对支架-细胞复合体系进行荧光染色，并采用磷酸缓冲盐溶液对染色后的支架-细胞复合体系进行洗涤。将洗涤后的支架-细胞复合体系置于激光扫描共聚焦显微镜下，并利用绿色荧光通道和橙色荧光通道进行观10察，从而检测得到亲水支架上细胞的培养状态。结果：通过这种方法，激光共聚焦显微镜下的细胞分布情况显示十分清晰，不存在亲水支架对荧光染色液的吸附所造成的干扰，使得细胞的分布及生长状态的分析更加直观及准确。结论：本研究提供的方法能够清晰、准确地检测亲水支架上细胞的分布情况及生长状态，可以对亲水支架上的细胞进行无损、实时、动态地检测。且操作简便，便于规模化推广应用。关键词：吖啶橙染色，激光共聚焦显微镜，亲水支架15中图分类号：Q813.1+1AmethodtodetectcellularculturestateonthehydrophilicscaffoldPIYanbin,MENGQingyang,AOYingfang20(InstituteofSportsMedicine,PekingUniversityThirdHospital,Beijing,1000191)Abstract:Purpose:inpresentstudy,amethodwasintroducedfordetectingthestateofcellsculturedonthehydrophilicscaffold.Methods:stemcellswereculturedonahydrophilicscaffoldtobuildacell-scaffoldcomplexwithaconfluenceof90-95%.Thefluorescencestainingofcell-scaffoldcomplexwasproducedbyacridineorangestaining,andrinsedbyphosphatebuffersolution(PBS)toerasethe25overdoesacridineorangefluorescencedyes.Afterfluorescentstaining,thecell-scaffoldcomplexwasobservedundergreenandorangechannelsofconfocalfluorescencemicroscope.Result:thestateofculturedcellscouldbedisplayedclearlyandpreciselywithouttheinterferenceofunintendedstainingonhydrophilicscaffold..Conclusion:bythismethod,Thedistributionandgrowthstateofcellonthescaffoldcanbemeasuredeasily.30Keywords:Acridineorangefluorescencedyes;Confocalfluorescencemicroscope;Hydrophilicscaffold0引言35组织工程支架是一种用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物，它可以为细胞的生长输送营养及排泄代谢产物，并为细胞的增殖和分化提供结构支撑和空间。为了获知组织工程支架的作用效果，在利用组织工程支架进行细胞培养时，需要对组织工程支架上所培养细胞的分布、生长和增殖等培养状态进行检测。因此，有必要提供一种简单易行、清晰准确的检测组织工程支架上细胞培养状态的方法。目前，现有技术40通常采用荧光染料对细胞中的某些特定成分（如DNA、RNA等）进行标记，通过激光扫描共聚焦显微镜对细胞中荧光标记的特定成分发出的荧光进行观测，从而了解细胞在组织工程支架上分布、生长和增殖情况。但是，现有技术至少存在以下问题：当组织工程支架为亲水性基金项目：教育部新教师基金（20130001120101）作者简介：皮彦斌（1979年-），男，主治医师/助理研究员，运动创伤，软骨组织工程通信联系人：敖英芳（1958年-），男性，教授，博导，关节运动创伤，软骨组织工程.E-mail:aoyingfang@163.com-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn时，其非特异性吸附荧光染料，造成亲水性组织工程支架（以下简称亲水支架）也会发出荧光，这与细胞自身发出的荧光产生重叠，从而对亲水支架上细胞培养的检测造成干扰，使其45检测结果不准确。为解决上述问题，我们提供了一种检测亲水支架上细胞培养状态的方法，利用吖啶橙染色液特异性结合DNA时可发出绿色荧光，特异性结合RNA时可发出橙色荧光，可对亲水支架上细胞培养状态进行细胞无损地、实时以及动态地检测。由于吖啶橙染色液与不含有DNA和RNA的亲水支架无法进行特异性结合，且本发明提供的方法通过磷酸缓冲盐溶液对染色后的支架-细胞复合体系进行洗涤，可除去物理性吸附在亲水支架上的吖啶橙染色50液，从而利用激光扫描共聚焦显微镜，并在绿色荧光通道和橙色荧光通道下对支架-细胞复合体系进行观察时，只能观察到亲水支架上细胞的分布与生长状态，从而使检测结果更加准确可靠，能够清晰、准确地检测亲水支架上细胞的分布情况及生长状态，且操作简便，便于规模化推广应用。1.材料与方法551.1.试剂α-DMEM培养基购自美国GIBCO公司，小牛血清购自美国Hyclone公司，魔芋葡甘聚糖微球支架购自中国科学院过程研究所，Hoechst染料购自中国北京方博有限公司，罗丹明标记鬼笔环肽染料（Rhodaminephalloidin）购自美国Denver公司，其余实验试剂均购自美国sigma-Aldrich公司。601.2魔芋葡甘聚糖微球干细胞培养大鼠骨髓间充质干细胞培养：雄性SD大鼠(体重100g)（购自北京大学医学部动物实验室），20%(g/ml)乌拉坦过量麻醉致死。在无菌操作台上分离大鼠长骨干，去除其周围肌肉组织以及双侧关节干骺端，用10ml的注射器抽取PBS缓冲液（PhosphateBufferedSaline，磷酸缓冲盐溶液）冲洗SD大鼠长干骨的骨髓腔，将骨髓冲入10cm的培养皿中，得到大鼠骨65髓细胞溶液。根据相关文献报道，对干细胞进行贴壁培养[1]。用吸管对大鼠骨髓细胞溶液进行轻柔吹打，得到骨髓单细胞悬液，在1000rpm的转速下离心5min，去除上层清液，PBS溶液重悬骨髓细胞溶液，上述步骤重复3次。然后，用含有10%小牛血清和1%双抗（青霉素6+链霉素）的α-DMEM培养基重悬大鼠骨髓细胞溶液，并稀释浓度至5×10个细胞/毫升。接种于6cm无菌培养皿上，在37℃，5%CO2浓度的细胞培养箱中进行培养。培养3小时后，70更换培养基，去除非贴壁细胞。以后每2天更换一次培养基，在12-14天时，细胞生长融合率达到90%以上，得到原代骨髓间充质干细胞。进行传代培养，弃去培养皿上层清液，用PBS溶液洗涤细胞，重复3次，加入0.25%胰蛋白酶1ml（胰蛋白酶用1mmol/L的EDTA-Na2配制），消化5min。消化时轻柔拍打培养皿底部，并其倒置于显微镜下观察，当SD大鼠骨髓间充质干细胞开始皱缩时（即细胞开始变圆），加入含10%小牛血清的α-DMEM培养基终止胰蛋白75酶的作用。最后，用吸管反复吹打干细胞，并将干细胞收集于15ml的离心管中，在1500r/min的条件下离心5min，弃去上层清液，用α-DMEM培养基重悬，制成SD大鼠骨髓间充质干细胞重悬液，储存备用。骨髓间充质干细胞在魔芋葡甘聚糖微球支架上进行培养：魔芋葡甘聚糖微球支架（购自中科院过程研究所）[2,3]用去离子水反复清洗，清洗后进行抽滤，至5min内没有水滴下。80在室温下，魔芋葡甘聚糖微球支架与PBS缓冲液按1/2的体积比混悬浸泡过夜。测定并用盐-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn酸或氢氧化钠溶液调整微球溶液PH值至中性（6.8~7.1之间），备用。接种前一天，在超净台中弃去微球溶液上清，用含10%小牛血清和1%双抗的α-DMEM培养基悬浮微球（体积比5为2:1），37℃下，孵育4小时[3,4]。在六孔板中，每孔加入2.0×10个细胞/毫升的骨髓间充质干细胞悬液1ml，微球载体悬液2ml，进行悬浮培养。每2天更换一次培养液，孵育8510-12天，用显微镜下观察干细胞在微球载体上的生长状态。当干细胞在微球载体上的融合率达到90-95%后，得到魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓间充质干细胞复合体系。1.3微球支架-干细胞复合体荧光染色配制吖啶橙染色液：用质量浓度为95%的无水乙醇配制成1mg/ml的吖啶橙乙醇溶液，经0.22μm滤网过滤后，得到吖啶橙染色液，储存备用。90用1ml微量移液器将魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓间充质干细胞复合体系移入激光扫描共聚焦显微镜专用培养皿内，弃去上层清液，PBS溶液反复清洗3次，然后用1mlPBS溶液重新悬浮魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓间充质干细胞复合体系。每1ml上述悬浮液中加入1ul配制好的吖啶橙染色液，孵育10分钟，弃去上层清液，PBS溶液反复清洗三次后，用1ml无血清a-DMEM培养基重新悬浮魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓间充质干95细胞复合体系。罗丹明标记鬼笔环肽配制：使用前简短离心使样品至管底，加入500µl无水甲醇配制成14um的溶液。推荐将其溶液分装成10×50µl份于-20℃避光保存。100nM工作液的准备，即吸取3.5µl14µM的储存液于500µlPBS，室温避光存储备用。Hoechst33258染色液配制：称取Hoechst33258（或Hoechst33342）1mg，用20ml蒸馏水溶解，过滤，4℃避光存储备用。100用1ml微量移液器将魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓间充质干细胞复合体系移入激光扫描共聚焦显微镜专用培养皿内，弃去上层清液，PBS溶液反复清洗3次。染色方法按既往文献所述[4,5,6]，用1ml4%的多聚甲醛固定魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓间充质干细胞复合体系5分钟，再次用PBS溶液反复清洗3次。加入1ml1%（V/V）Tritonx-100溶液破膜打孔5分钟。再次用PBS反复冲洗3次后，每1ml上述悬浮液中加入罗丹明标记鬼105笔环肽和Hoechst33258荧光染液各200ul，孵育10分钟，弃去上层清液。再次用PBS溶液反复清洗三次后，用1ml无血清a-DMEM培养基重新悬浮魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓间充质干细胞复合体系，得到用罗丹明标记鬼笔环肽和Hoechst33258染色的魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓间充质干细胞复合体系。1.4荧光显微镜观察干细胞染色效果110将染色后的魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓间充质干细胞复合体系置于激光扫描共聚焦显微镜下，利用绿色荧光通道和橙色荧光通道观察吖啶橙染色效果，红色通道和蓝色通道观察罗丹明标记鬼笔环肽细胞骨架染色和Hoechst胞核复染的观察。将吖啶橙染色后的魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓间充质干细胞复合体系置于激光扫描共聚焦显微镜下，选取视野，进行绿色和橙色双荧光通道观察。激光扫描共聚焦显微115镜参数设置：绿色荧光通道激发光的波长为515-545nm，橙色荧光通道激发光的波长590-620nm。将罗丹明标记鬼笔环肽细胞骨架染色和Hoechst胞核复染的魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓间充质干细胞复合体置于激光共聚焦显微镜下，进行红色和蓝色双荧光通道观察。显微镜参数设置：红色激发光波长为507-529nm，蓝色激发光波长为350-460nm。根据SD大鼠骨髓间充质干细胞的大小和微球大小，设定在Z轴方向上，每隔1μm进行一次断层扫120描，断层扫描完成后，在Z轴方向上，按顺序复合叠加各个断层扫描的图像，以获得SD大鼠骨髓间充质干细胞的复合图像，并建立三维坐标系，得到三维成像。-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn2.结果2.1吖啶橙染色效果评估吖啶橙染色组中，魔芋葡甘聚糖微球支架（图1A）、SD大鼠骨髓间充质干细胞的DNA125（图1B）和RNA（图1C）、以及魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓间充质干细胞复合体系（图1D）在特定层面上的激光扫描共聚焦显微镜扫描图像。从上述各图中可以看出，通过如上操作，在特定层面上，能够清晰地获得魔芋葡甘聚糖微球支架，以及魔芋葡甘聚糖微球支架上细胞的DNA和RNA的分布状态。由上图可知，复合后的图像清晰，没有出现魔芋葡甘聚糖微球支架所发荧光与SD大鼠骨髓间充质干细胞的DNA或RNA所发荧光重叠不清的现象。130各个断层扫描图像按顺序复合叠加后，所得到的复合图像的二维平面图，图像清晰准确，便于对魔芋葡甘聚糖微球支架上的细胞分布和生长状态进行检测和分析（图2A，2B，2C，2D）。根据上述所获得的各个断层扫描图像，建立三维坐标系，得到如图3所示三维成像。图3-1、图3-2、图3-3、图3-4分别为魔芋葡甘聚糖微球支架、SD大鼠骨髓间充质干细胞的DNA和SD大鼠骨髓间充质干细胞的RNA、以及魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓间充质干细胞135复合体系的三维成像图。140145150图1吖啶橙荧光染色后，在激光共聚焦显微镜下观察微球支架-干细胞复合体系在特定层面的染色效果。魔芋葡甘聚糖微球支架（图1A）、SD大鼠骨髓间充质干细胞的DNA（图1551B）和RNA（图1C）、以及魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓间充质干细胞复合体系（图1D）。-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图2：吖啶橙荧光染色后，在激光共聚焦显微镜下观察微球支架-干细胞复合体系二维平面图的染色效果。魔芋葡甘聚糖微球支架（图1A）、SD大鼠骨髓间充质干细胞的DNA（图1601B）和RNA（图1C）、以及魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓间充质干细胞复合体系（图1D）。图3：吖啶橙荧光染色后，在激光共聚焦显微镜下观察微球支架-干细胞复合体系三维重建图的染色效果。魔芋葡甘聚糖微球支架（图1A）、SD大鼠骨髓间充质干细胞的DNA（图1651B）和RNA（图1C）、以及魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓间充质干细胞复合体系（图1D）。2.2罗丹明细胞骨架和Hoechst胞核染色效果：罗丹明标记鬼笔环肽细胞骨架染色和Hoechst胞核复染组中（图4），我们发现，无论-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn罗丹明标记鬼笔环肽染料和Hoechst染料均对魔芋葡甘聚糖微球支架具有一定的亲和性，在170反复洗脱之后，在荧光显微镜中，均能观察到罗丹明和Hoechst染料对微球支架的非特异性染色，导致显影图像不清晰，无法有效分辨出干细胞的形态及其在支架上的分布情况，也无法对干细胞的活性和生长状态做出有效地评估。图4：罗丹明标记鬼笔环肽细胞骨架和Hoechst胞核荧光染色后，在激光共聚焦显微镜下观175察微球支架-干细胞系统的染色效果。图4A为微球支架，图4B为Hoechst胞核复染，图4C罗丹明标记鬼笔环肽荧光染色，图4D微球支架-干细胞体系的染色效果。3.结论吖啶橙荧光染色可以清晰的显示SD大鼠骨髓间充质干细胞在微球支架上的分布情况，不存在魔芋葡甘聚糖微球支架对荧光染色液的吸附所造成的干扰，使得对SD大鼠骨髓间充180质干细胞的分布及生长状态的分析更加直观及准确，并能直观形象的显示出干细胞的活性状态。可见，通过本研究提供的方法，可以对魔芋葡甘聚糖微球支架上的SD大鼠骨髓间充质干细胞进行无损、实时、动态地检测。[参考文献](References)185[1]ShaoZ,ZhangX,PiY,AOY,etal.PolycaprolactoneelectrospunmeshconjugatedwithanMSCaffinitypeptideforMSChominginvivo[J].Biomaterials,2012,33(12):3375-87.[2]SunLJ,XiongXZ,ZhouWQ,SuZG,etal.Novelkonjacglucomannanmicrocarriersforanchorage-dependentanimalcellculture[J].BiochemicalEngineeringJournal,2015,96(15):46-54.-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn[3]NieHR,ShenXX,ZhouZH,CharlesC,etal.Electrospinningandcharacterizationofkonjac190glucomanan/chitosannanofibrousscaffoldsfavoringthegrowthofbonemesenchymalstemcells[J].CarbohydratePolymers,2011,85(3):681-686.[4]PiY,ZhangX,ShiJ,AoY,etal.Targeteddeliveryofnon-viralvectorstocartilageinvivousingachondrocyte-homingpeptideidentifiedbyphagedisplay[J].Biomaterials,2011,32(26):6324-32.[5]ShiJ,ZhangX,ZhuJ,AoY,etal.NanoparticleDeliveryoftheBoneMorphogeneticProtein4Geneto195Adipose-DerivedStemCellsPromotesArticularCartilageRepairInVitroandInVivo[J].Arthroscopy,2013,29(12):2001-2011.[6]PiY,ZhangX,ShaoZ,AoY,etal.Intra-articulardeliveryofanti-Hif-2αsiRNAbychondrocyte-homingnanoparticlestopreventcartilagedegenerationinarthriticmice[J].GeneTher,2015,22(6):439-48.-7-'