一种免标记检测聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1活性的新方法.pdf 11页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn一种免标记检测聚腺苷二磷酸核糖聚合酶#-1活性的新方法**罗超，李代琦，黄燕5（湖南大学化学化工学院,长沙,410082）摘要：聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）在基因修复、DNA复制和转录调控等方面起到非常关键的作用。开发准确、灵敏检测PARP活性及筛选潜在抑制剂的方法在生化研究和药物开发中是至关重要的。本文中，发展了一个基于超电荷绿色荧光蛋白（ScGFP）/氧化石墨烯传感平台的免标记检测PARP-1活性的新方法。ScGFP与GO之间的静电作用及疏水作用10导致ScGFP的荧光被高效猝灭。PARP-1催化的聚腺苷二磷酸核糖化后的产物聚腺苷二磷酸核糖（PAR）带大量负电荷，能与ScGFP形成ScGFP/PAR纳米复合物，从而有效保护ScGFP荧光不被GO淬灭。研究结果表明，该方法能够灵敏、选择地检测PARP-1，该方法的线性范围为0.2-7U/mL，检测限为0.06U/mL。此外，该方法也能用于PRAP-1抑制剂筛选，并以苯甲酰胺和AG-14361为研究对象。15关键词：分析化学；聚腺苷二磷酸核糖聚合酶；超电荷荧光蛋白；氧化石墨烯；抑制剂中图分类号：O657Alabel-freeassayforthedetectionofpoly(ADP-ribose)polymerase-1activity20LUOChao,LIDaiqi,HUANGYan(CollegeofChemistryandChemicalEngineering,HunanUniversity,Changsha,410082)Abstract:Poly(ADP-ribosyl)ation,catalyzedbypoly(ADP-ribose)polymerase(PARP),playskeyrolesingenomerepair,DNAreplication,andtheregulationoftranscription.DevelopmentofaccurateandsensitiveapproachesforPARPactivityassayandpotentialinhibitorsscreeningiscriticalfor25biochemicalinvestigationanddrugdiscovery.Inthiswork,alabel-freefluorescenceassaystrategyforthedetectionofPARP-1activitywasproposedbasedonthesuperchargedgreenfluorescentprotein(ScGFP)/grapheneoxide(GO)sensingplatform.ElectrostaticinteractionandhydrophobicinteractionbetweenScGFPandGOleadtoeffectivequenchingofthefluorescenceofScGFP.Negativelychargedpoly(ADP-ribose)polymer(PAR)generatedfromthepoly(ADP-ribosyl)ationcatalyzedbyPARP-1,30canbindScGFPthroughelectrostaticinteractionandformtheScGFP/PARnanocomplex,whichprotectScGFPfrombeingquenchedbyGO,therebyresultinginaswitch-ondetectionofPARP-1activity.Undertheoptimizedconditions,theproposedassayiscapableofsensitivelyandselectivelymeasuringPARP-1intherangeof0.2-7U/mLwithadetectionlimitof0.06U/mL.Furthermore,thefeasibilityofthismethodforPRAP-1inhibitorsscreeningwasalsodemonstratedbyusingbenzamide35andAG-14361asmodels.Keywords:Analyticalchemistry;poly(ADP-ribose)polymerase-1;Superchargedgreenfluorescentprotein;Grapheneoxide;Inhibitor400引言聚腺苷二磷酸核糖化（PARylation）是由PARP催化引起的一种重要的蛋白质翻译后修[1,2]饰过程，在细胞生理学及基因毒性应激方面扮演重要角色。PARP-1是PARP家族的重要基金项目：国家自然科学基金（21475037)作者简介：罗超（1990-），男，硕士研究生，分析化学通信联系人：黄燕（1979-），女，硕导，生命科学中的新分析方法.E-mail:huangyan.hnu@gmail.com-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn+成员，可以被损伤DNA所激活并从供体烟酰腺嘌呤二核苷酸（NAD）中催化转移共价连[3]接高达200多个ADP-ribose单位至目标受体蛋白（组蛋白、拓扑异构酶或自身等）。PARP-145参与绝大多数的PARylation过程，包括DNA修复、转录、翻译、细胞信号传导、细胞死亡[4-6]等各种的细胞过程。过度激活PARP-1已被证明与多种疾病有关联，包括关炎性疾病、[7-9]中风、心肌梗死、神经退行性疾病、糖尿病和癌症。与此同时，PARP-1抑制剂已被用来[10,11]作为治疗这些严重疾病的药物。因此，发展快速、灵敏、选择性检测PARP-1活性的方法及发展潜在抑制剂筛选方法在医疗检测和诊断领域就显得非常迫切。+50常规检测PARP-1活性的方法主要基于标记的NAD，如放射性标记、生物素标记和炔+[12-15]烃标记的NAD类似物。这些方法可以实现PARP-1的敏感检测，但存在危险的放射性材料、化学衍生物、复杂的多步骤程序等缺点。基于抗体的酶联免疫吸附法可以筛选大量的[16]PARP抑制剂，但是也存在费时费力的缺点。此外基于劈裂荧光素酶的检测方法也可以用[17]来监测聚（ADP-ribose）的聚合过程，但需要引入复杂的基因工程操作过程。因此，建立55一种简便、低成本而且高效的PARP-1活性测定及其抑制剂筛选的方法仍然是一个巨大的挑战。近年来，石墨烯和类石墨烯材料因其不寻常的光电性质被广泛关注。其中，氧化石墨烯（GO）具有良好的亲水性、生物相容性和易于生物功能化等优点，从而使其在生物传感领[18,19]域有着许多潜在的应用。例如，基于GO/寡核苷酸的传感平台就已经应用于DNA和RNA[20,21]60的分析检测。此外，基于GO/多肽的分析方法也被开发为包括蛋白质、蛋白酶、激酶和[22-24]细菌等各类检测对象的分析。然而，DNA和多肽在可见光光谱区域内不会自发荧光，导致基于GO的生物传感体系很大程度上依靠标记在生物分子上的外源荧光基团的荧信号，需要耗费高昂成本来进行实验前的标记过程。相比之下，荧光蛋白（fluorescentprotein,FP）等自发荧光生物大可避免上述缺点。65近些年，一种通过基因重组所获得的表面高电荷的新型FP，即超电荷绿色荧光蛋白（ScGFP），具有良好溶解性和稳定性，在生物技术、医学和生物分析等领域展示出的广阔的应用前景[25-27]。最近，我们发现ScGFP通过静电和疏水相互作用结合GO之后，会有明显的荧光猝灭现象。同时，由ScGFP通过静电相互作用与带负电荷聚合物（例如DNA）所形成的纳米[28]复合物，可以保护ScGFP荧光不被GO猝灭。此外，基于ScGFP/GO的免标记传感平台[28,29]70已被证实可用于碱基切除修复酶、甲基化转移酶活性检测及其抑制剂的筛选。本文中，我们基于ScGFP/GO传感平台发展了一个用于PARP-1活性检测及其抑制剂筛选的免标记荧光分析方法。该方法实现对PARP-1快速、低成本、灵敏的检测，在药物开发和医疗诊断方面展示出潜在的应用前景。1实验部分751.1实验试剂与仪器氧化石墨烯（GO）购买于南京先丰纳米材料科技有限公司（中国，南京），PARP-1-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn和activatedDNA购买于Trevigen公司（美国）。DNaseI购买于NewEnglandBiolabs（北京），PARP-1抑制剂AG-14361购买于Selleck（中国），苯甲酰胺购买于Sigma-Aldrich公司（美国），Caspase-3购买于R&DSystems公司（美国），其他试剂为国产分析纯。5×PARP-180反应缓冲液：250mMTris,500mMNaCl,50mMMgCl2,5mMDTT,pH8.0。ScGFP由本实[25]验室表达和纯化，参照以往文献报告。以上所有实验用水均为超纯水（18.25MΩ·cm,MilliporeMilli-QSystem，美国）。TM使用PTIQuantaMaster荧光仪（Birmingham,美国）进行荧光检测，所有样品的激发波长为480nm，激发狭缝为5nm，发射狭缝为10nm，光谱扫描范围为500-600nm，以荧85光最大发射波长处（507nm）的荧光值作为荧光强度值。使用高分辨光谱型共聚焦显微镜（Nikon,日本）进行共聚焦成像实验。1.2PARP-1活性及其抑制剂的检测PARylation实验在10µL反应体系中操作（50mMTris,100mMNaCl,10mMMgCl2,1+mMDTT,pH8.0），首先将加有20ngactivatedDNA，0.5mMNAD和不同浓度PARP-190酶（0,0.002,0.005,0.01,0.02,0.03,0.05,0.07,0.1,0.3,0.5and1U/μL）的溶液放置室温孵育10min。然后向上述溶液加入2µL1U/µLDNaseI和12µLH2O，37℃反应1小时。反应完成后，向上述溶液中加入25µLTris-HCl缓冲液（50mMTris，pH8.0，25℃）、40µLH2O、50µLScGFP（50nM），37℃避光孵育10分钟，再加入1µL0.5mg/mLGO，混匀后，在荧光检测仪上测量荧光值。+95对于PARP-1抑制剂检测实验，除了在PARP-1、activatedDNA和NAD中添加不同浓度的苯甲酰胺或AG-14361之外，其他实验步骤与PARP-1活性检测实验相同。1.3选择性实验本实验操作步骤除将其它酶：肌红蛋白（Myo）、溶菌酶（Lys）、木瓜蛋白酶（Pap）、胰蛋白酶（Tyr）、凝血酶（Tb）、过氧化物酶（HRP）和蛋白激酶A（PKA），与PARP-1100替换以外；其他步骤同上面PARP-1活性检测实验。1.4生物样品中检测PARP-1将取自健康志愿者的血清样品和尿样经过分子筛3000的超滤离心装置处理，并50倍稀释在Tris-HCl缓冲液中，最后用于进行PARP-1的标准添加实验。实验检测方法同上述PARP-1活性检测实验。整个生物样品检测实验，严格按照湖南大学相关机构及化学化工学105院学术委员会的相关规定进行。2结果与讨论2.1PARP-1检测原理我们以前的工作发现ScGFP与GO之间因为静电和疏水相互作用而结合在一起，并导致ScGFP荧光猝灭。同时，由ScGFP与带负电荷DNA所形成ScGFP/DNA纳米复合物，[28]110可以保护ScGFP荧光不被GO猝灭。在上述研究的基础上，一个基于ScGFP/GO传感平台用于PARP-1活性检测及其抑制剂筛查的免标记荧光分析方法被开发出来。如图1所示，由PARP-1催化引发PARylation反应生成的带负电荷PAR，能够结合ScGFP并形成-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnScGFP/PAR纳米复合物，保护ScGFP荧光不被GO猝灭。115图1基于ScGFP/GO传感用于PARP-1活性检测的示意图Fig.1SchematicoftheScGFP/GO-basedsensorforthedetectionofPARP-1activity.+首先研究了PAR和ScGFP之间的相互作用。在底物激活DNA（activatedDNA）和NAD存在时，PARP-1催化引发PARylation过程。为了消除激活DNA的干扰，在PARylation过程后添加DNaseI可以完全降解激活DNA。加入ScGFP后，通过激光共聚焦显微镜可观察120到ScGFP/PAR复合物（图2）。此外，PARylation过程可以引起ScGFP/GO的荧光强度显著增强(14倍，图3)，在紫外灯下也可以看到有明亮的绿光（图3插图）。因此，PARP-1催化引起PARylation过程可以引起ScGFP的荧光强度改变，为PARP-1活性检测提供一个荧光检测法。125图2ScGFP(A),PARP-1/ScGFP(B)andPAR/ScGFP(C)的激光共聚焦成像聚。Fig.2FluorescencemicroscopyimagesofScGFP(A),PARP-1/ScGFP(B)andPAR/ScGFP(C).图3ScGFP(曲线a)、ScGFP/GO(曲线b)和PARP-1/ScGFP/GO(曲线c)的荧光光谱。-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn130Fig.3FluorescencespectraofScGFP(curvea),ScGFP/GO(curveb),andPARP-1/ScGFP/GO(curvec).Insert:thephotographofthesamplesuponexcitationunderUVlamp(λ=365nm,5W).2.2实验条件的优化为了获得更好的检测效果，我们对所提出的实验方案进行细致的条件优化实验。首先，针对实验所用到的GO浓度进行优化。如图4A所示，ScGFP（50nM）的荧光强度随着GO135浓度增加而急剧减少；当GO的浓度是在3μg/mL以上时，荧光强度基本不再变化(减少93%)；并且实验过程也并不受PARP-1的影响(图4B)。考虑到PAR和GO间存在潜在的非特异性吸附，在后面的实验中GO的浓度设置为5μg/mL。接着对ScGFP和GO之间的反应时间进行优化。结果表明，ScGFP与GO结合十分迅速（＜1min，图5A）。因此，后续实验中采+用5mg/mLGO和1min的作用时间。最后，对NAD浓度，PARP-1催化引发PARylation+140过程的时间，及DNaseI的消化时间三者进行条件优化。如图5B所示，NAD的实验最佳浓[16]度是50μM。而PARP-1催化已发的PARylation过程也十分快速，即在PARylation过程中ScGFP/PAR/GO体系的荧光强度在少于3min时就达到了最大值（图5C）。为了获得更好的检测灵敏度，PARylation反应时间设置为10min。此外，可以最大化消除ScGFP和DNA之间的干扰，DNaseI消化时间确定为1h（图6D）。145图4（A）不同浓度GO下的ScGFP（50nM）的荧光强度；（B）实验体系在有或无PARP-1条件中的不同GO浓度下的ScGFP荧光强度变化。Fig.4(A)ThefluorescenceintensityofScGFP(50nM)withdifferentconcentrationsofGO.(B)TheresponseofthefluorescenceintensityofthesystemwithandwithoutPARP-1todifferentconcentrationsofGO(3,4,5150µg/mL).-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn+图5（A）ScGFP(50nM)/GO(5µg/mL)在不同孵育时间下的荧光强度；（B）不同NAD浓度下的体系的荧光强度；（C）不同PARylation时间下的体系荧光强度；（D）不同DNaseI(2U)作用时间下的ScGFP/155activatedDNA/GO体系荧光强度。Fig.5(A)ThefluorescenceintensityofScGFP(50nM)/GO(5µg/mL)withdifferentincubationtime.(B)The+responseofthefluorescenceintensityofthesystemtodifferentconcentrationsofNAD.(C)FluorescenceintensityofthesystemwithdifferentPARylationtime.(D)NormalizedfluorescenceintensityofScGFP/activatedDNA/GOasafunctionofdifferentdigestiontimeofDNaseI(2U).1602.3PARP-1活性的检测在优化后的实验条件下，根据记录不同浓度的PARP-1作用下，ScGFP的荧光强度变化-1情况。当PARP-1浓度从0增加到100UmL时，ScGFP荧光逐渐升高（图6A）。当PARP-1-1的浓度在0.2至7UmL范围内，I/I0与PARP-1的浓度是线性相关的（图7插图），PARP-1-1165的检测限（LOD，3S/N）是0.06UmL，其中S是空白溶液三个各自的测量值的标准偏差，N是在线性范围内校准曲线的斜率。该方法获取的PARP-1的LOD优于许多以前文献报道[13,17,30]的结果。-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图6（A）ScGFP/GO中加入不同浓度的PARP-1（0,0.2,0.5,1,2,3,5,7,10,30,50,100U/mL）时的荧光170光谱。（B）不同浓度PARP-1下的I/I0的校准曲线图(I/I0)。I和I0分别是存在和缺少PARP-1下的荧光强度值，插图显示了线性响应范围。Fig6(A)FluorescencespectraofScGFP/GOuponadditionofvariousconcentrationsofPARP-1(0,0.2,0.5,1,2,3,5,7,10,30,50,100U/mL).(B)Calibrationcurveofthefluorescenceresponse(I/I0)versustheconcentrationofPARP-1.IandI0arefluorescenceintensitiesofthesysteminthepresenceandabsenceofPARP-1,respectively.175Insetshowsthelinearresponserange.为了考察该方法的选择性，我们对不同的酶或蛋白进行检测，其中包括肌红蛋白（Myo）、溶菌酶（Lys）、木瓜蛋白酶（Pap）、胰蛋白酶（Tyr）、凝血酶（Tb）、过氧化物酶（HRP）和蛋白激酶A（PKA），所以实验条件与在上述检测PARP-1的条件一致。如图8所示，除了PARP-1，其他物质都没有显著的响应。实验结果表明，我们所提出的分析检测方法可以180对目标检测物PARP-1的具有良好的选择性。图7基于ScGFP/GO传感平台的PARP-1活性检测的选择性实验；PARP-1，10U/mL(约4nM)；其他蛋白质或酶的浓度是40nM。Fig7SelectivityoftheScGFP/GO-basedPARP-1sensingsystem.PARP-1,10U/mL(~4nM);the185concentrationsofotherproteinsorenzymesare40nM.-7- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn2.4PARP抑制剂的筛选为了进一步证明该方法在抑制剂筛选方面具有潜在应用前景，实验选取了几种PARP-1现有的抑制剂的进行实验分析。PARP-1的抑制剂可以阻止DNA修复途径，并且有一部分抑制剂已被用作潜在的治疗药物。大多数PARP-1抑制剂通过占据PARP-1的烟酰胺结合位+[6,31]190点，防止NAD绑定在PARP-1的催化位点处，从而抑制PARP-1的活性。在本实验中，我们选择了一个传统的PARP的抑制剂苯甲酰胺和一个有效的抑制剂AG-14361。我们先考察了所选择的抑制剂对ScGFP荧光强度的影响及抑制剂对GO猝灭能力的影响，结果如图8所示。在AG-14361在10µM时和苯甲酰胺在1mM时对它们都没有明显的影响。然后根据记录的荧光强度的变化来研究苯甲酰胺和AG-14361对PARP-1活性的影响。抑制效率(IE)195是由以下公式确定：IE(%)=100×(I-Ii)/(I-I0)(1)其中，I表示ScGFP/GO和PARP-1组的荧光强度，Ii表示PARP-1和抑制剂组，I0表示无PARP-1组。图9表明随着苯甲酰胺浓度从0~1mM及AG-14361从0~10µM下，抑制效率逐渐升高，并基于线性关系计算出抑制剂IC50值（50%抑制酶活性的抑制剂浓度），苯[6,31,32]200甲酰胺和AG-14361分别是4.8µM和18.7nM，这与文献报道的数值近似。图8不同浓度的AG-14361和苯甲酰胺的对ScGFP（50nM）的荧光强度影响（A,C）和对ScGFP（50nM）的猝灭效率（B，D)。Fig8TheinfluenceofdifferentconcentrationsofAG-14361andbenzamideonthefluorescenceintensityof-8- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn205ScGFP(50nM)(A,C)andonthequenchingefficiencyofScGFP(50nM)(B,D),respectively.图9对数浓度下的AG-14361(A)和苯甲酰胺(B)的抑制效率Fig.9InhibitionefficiencyversusthelogarithmconcentrationofAG-14361(A)andbenzamide(B).2.5生物样品中PARP-1的测定210在上述实验结果的基础上，我们对PARP-1活性检测在生物样品中的可能性进行分析。实验提出的应用方案是检测在实际样品（血清样品和尿样）中不同浓度的PARP-1活性，每组实验平行做三组，实验结果见表1，实验的回收率在92.5%至107.5%之间，相对标准偏差在1.5%至3.2%。表1实际样品中PARP-1的测定215Tab.1DeterminationofPARP-1inbiologicalsamples.SamplesAdded(U/mL)Found(U/mL)Recovery(%)RSD(%)2.02.1105.02.6Serum4.03.792.52.88.07.897.53.22.01.995.02.2Urine4.04.3107.51.58.08.5106.32.13结论综上所述，本文中我们发展一种基于ScGFP/GO传感平台用于PARP-1活性检测的免标记荧光分析方法。PARP-1催化引发的PARylation过程所产生的PAR带有大量负电荷。同时，带相反电荷的ScGFP与PAR之间由于静电相互作用所形成的ScGFP/PAR纳米复合物，-1220可以保护ScGFP的荧光不被GO猝灭。该方法对PARP-1的最低检测限达到0.06UmL，且可以对PARP-1抑制剂的进行筛选。与文献中已报道的PARP-1检测方法相比，该方法具有免标记、成本低和简单的均相操作等优点。此外，我们发展的荧光分析方法在药物开发和医疗诊断方面展示出潜在的应用前景。-9- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn[参考文献](References)225[1]BürkleA.Physiologyandpathophysiologyofpoly(ADP‐ribosyl)ation[J].Bioessays,2001,23(9):795-806.[2]SchreiberV,DantzerF,AmeJC,etal.Poly(ADP-ribose):novelfunctionsforanoldmolecule[J].NaturereviewsMolecularcellbiology,2006,7(7):517-528.[3]d"AMOURSD,DESNOYERSS,d"SILVAI,etal.Poly(ADP-ribosyl)ationreactionsintheregulationofnuclearfunctions[J].BiochemicalJournal,1999,342(2):249-268.230[4]BaiP.Biologyofpoly(ADP-ribose)polymerases:thefactotumsofcellmaintenance[J].Molecularcell,2015,58(6):947-958.[5]BrochierC,JonesJI,WillisDE,etal.Poly(ADP-ribose)polymerase1isanoveltargettopromoteaxonalregeneration[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2015,112(49):15220-15225.[6]JagtapP,SzabóC.Poly(ADP-ribose)polymeraseandthetherapeuticeffectsofitsinhibitors[J].Nature235reviewsDrugdiscovery,2005,4(5):421-440.[7]InfanteJ,Sánchez-JuanP,MateoI,etal.Poly(ADP-ribose)polymerase-1(PARP-1)geneticvariantsareprotectiveagainstParkinson"sdisease[J].Journaloftheneurologicalsciences,2007,256(1):68-70.[8]KohDW,DawsonTM,DawsonVL.Poly(ADP-ribosyl)ationregulationoflifeanddeathinthenervoussystem[J].Cellularandmolecularlifesciences:CMLS,2005,62(7-8):760-768.240[9]KauppinenTM,SwansonRA.Theroleofpoly(ADP-ribose)polymerase-1inCNSdisease[J].Neuroscience,2007,145(4):1267-1272.[10]WangYQ,WangPY,WangYT,etal.Anupdateonpoly(ADP-ribose)polymerase-1(PARP-1)inhibitors:opportunitiesandchallengesincancertherapy[J].JournalofMedicinalChemistry,2016,59(21):9575-9598.[11]FerrarisDV.Evolutionofpoly(ADP-ribose)polymerase-1(PARP-1)inhibitors.Fromconcepttoclinic[J].245Journalofmedicinalchemistry,2010,53(12):4561-4584.[12]MartelloR,MangerichA,SassS,etal.Quantificationofcellularpoly(ADP-ribosyl)ationbystableisotopedilutionmassspectrometryrevealstissue-anddrug-dependentstressresponsedynamics[J].ACSchemicalbiology,2013,8(7):1567.[13]BakondiE,BaiP,SzabóÉ,etal.Detectionofpoly(ADP-ribose)polymeraseactivationinoxidatively250stressedcellsandtissuesusingbiotinylatedNADsubstrate[J].JournalofHistochemistry&Cytochemistry,2002,50(1):91-98.[14]CheungA,ZhangJ.Ascintillationproximityassayforpoly(ADP-ribose)polymerase[J].Analyticalbiochemistry,2000,282(1):24-28.[15]JiangH,KimJH,FrizzellKM,etal.ClickableNADanaloguesforlabelingsubstrateproteinsofpoly255(ADP-ribose)polymerases[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety,2010,132(27):9363.[16]PuttKS,HergenrotherPJ.Anenzymaticassayforpoly(ADP-ribose)polymerase-1(PARP-1)viathechemicalquantitationofNAD+:applicationtothehigh-throughputscreeningofsmallmoleculesaspotentialinhibitors[J].Analyticalbiochemistry,2004,326(1):78-86.[17]FurmanJL,MokPW,ShenS,etal.Aturn-onsplit-luciferasesensorforthedirectdetectionofpoly260(ADP-ribose)asamarkerforDNArepairandcelldeath[J].ChemicalCommunications,2011,47(1):397-399.[18]ZhangY,ZhangJ,HuangX,etal.Assemblyofgrapheneoxide-enzymeconjugatesthroughhydrophobicinteraction[J].Small,2012,8(1):154-159.[19]TianJ,YuanPX,ShanD,etal.Biosensingplatformbasedongrapheneoxideviaself-assemblyinducedbysynergicinteractions[J].Analyticalbiochemistry,2014,460:16-21.265[20]JungJH,CheonDS,LiuF,etal.Agrapheneoxidebasedimmuno‐biosensorforpathogendetection[J].AngewandteChemieInternationalEdition,2010,49(33):5708-5711.[21]LiH,LiW,NieZ,etal.Alabel-freeandtime-resolvedluminescencestrategyforthedetectionofproteinsbasedonDNA-Tb3+luminescencequenchedbygrapheneoxide[J].Analyst,2015,140(18):6386-6391.[22]WangY,LiZ,WangJ,etal.Grapheneandgrapheneoxide:biofunctionalizationandapplicationsin270biotechnology[J].Trendsinbiotechnology,2011,29(5):205-212.[23]ZhangM,YinBC,WangXF,etal.Interactionofpeptideswithgrapheneoxideanditsapplicationforreal-timemonitoringofproteaseactivity[J].ChemicalCommunications,2011,47(8):2399-2401.[24]HanY,LiP,XuY,etal.Fluorescentnanosensorforprobinghistoneacetyltransferaseactivitybasedonacetylationprotectionandmagneticgraphiticnanocapsules[J].small,2015,11(7):877-885.275[25]LawrenceMS,PhillipsKJ,LiuDR.Superchargingproteinscanimpartunusualresilience[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety,2007,129(33):10110.[26]CronicanJJ,ThompsonDB,BeierKT,etal.PotentdeliveryoffunctionalproteinsintoMammaliancellsinvitroandinvivousingasuperchargedprotein[J].ACSchemicalbiology,2010,5(8):747-752.[27]LeiC,HuangY,NieZ,etal.AsuperchargedfluorescentproteinasaversatileprobeforhomogeneousDNA280detectionandmethylationanalysis[J].AngewandteChemieInternationalEdition,2014,53(32):8358-8362.[28]WangZ,LiY,LiL,etal.DNA-mediatedsuperchargedfluorescentprotein/grapheneoxideinteractionforlabel-freefluorescenceassayofbaseexcisionrepairenzymeactivity[J].ChemicalCommunications,2015,51(69):13373-13376.[29]LiD,LuG,LeiC,etal.SensitivedetectionofDNAmethyltransferaseactivitybasedonsupercharged285fluorescentproteinandtemplate-freeDNApolymerization[J].ScienceChinaChemistry,2016,59(7):809-815.[30]TangS,NieZ,LiW,etal.Apoly(ADP-ribose)polymerase-1activityassaybasedontheFRETbetweenacationicconjugatedpolymerandsuperchargedgreenfluorescentprotein[J].ChemicalCommunications,2015,-10- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn51(76):14389-14392.[31]CalabreseCR,AlmassyR,BartonS,etal.Anticancerchemosensitizationandradiosensitizationbythenovel290poly(ADP-ribose)polymerase-1inhibitorAG14361[J].JournaloftheNationalCancerInstitute,2004,96(1):56-67.[32]SmithLM,WillmoreE,AustinCA,etal.Thenovelpoly(ADP-Ribose)polymeraseinhibitor,AG14361,sensitizescellstotopoisomeraseIpoisonsbyincreasingthepersistenceofDNAstrandbreaks[J].ClinicalCancerResearch,2005,11(23):8449-8457.295-11-'