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'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnOBBR对D-GaIN/LPS诱导的急性肝损伤的保护作用及其机制#向红梅1，柴芳妮1，王越1，韩玉龙1，李学刚2，叶小利1**5（1.西南大学生命科学学院，重庆400715；2.西南大学药学院，重庆400715）摘要：急性肝损伤是伴随着高死亡率的一种临床综合征。本文旨在探究8-辛基小檗碱(OBBR)对D-氨基半乳糖/脂多糖(D-GalN/LPS)诱导的急性肝损伤的保护作用及其分子机制。老鼠连续灌胃OBBR七天(15和30mg/kg.day),末次给药后1h，腹腔注射D-GalN/LPS诱导急性肝10损伤。四小时后处死老鼠，收集血清和肝脏备用。结果表明,OBBR降低了血清中丙氨酸转移酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)活性以及肿瘤坏死因子a(TNF-a)、白介6(IL-6)和c反应蛋白水平(CRP)的水平；OBBR促进了肝脏中谷胱甘肽-S转移酶(GSH)的表达并降低了丙二醛（MDA）的产生；OBBR降低了肝脏中TNF-a和IL-6在mRNA和蛋白质水平的表达。此外，OBBR抑制了TLR4、ERK、p38、JNK和NF-kB蛋白在肝脏中的表达。结果表明OBBR15可通过抑制TLR4信号通路来缓解D-GalN/LPS诱导的急性肝损伤。关键词：OBBR；抗炎；抗氧化；急性肝损伤；TLR4中图分类号：Q7ProtectiveeffectofOBBRagainstD-GaIN/LPS-induced20ALFanditsmechanismsXianghongmei1,Chaifangni1,Wangyue1,Hanyulong1,Lixuegang2,Yexiaoli1(1.SchoolofLifeScience,Southwestuniversity,Chongqing400715;2.SchoolofPharmaceuticalSciences,southwestuniversity，Chongqing400715)Abstract:Acuteliverfailure(ALF)isadramaticclinicalsyndromeaccompanyinghighmortality25clinically.Inpresentstudyweaimedtoinvestigatetheprotectiveeffectsandmolecularmechanismsof8-ococtylberberine(OBBR)onALFinducedbyD-galactosamine/Lipopolysaccharide(D-GalN/LPS).MiceweregivenanoraladministrationofOBBR(15and30mg/kgday)for7consecutivedays.AfterthelastadministrationofOBBR,ALFofmicewasinducedbyintraperitoneallyinjectingD-GalN(400mg/kg)/LPS(500μg/kg).Andmiceweresacrificed4hafterreceivingD-GalN/LPS.Theresults30indicatedthatOBBRsignificantlydecreasedtheactivityofalaninetransferase(ALT)andaspartatetransaminase(AST)inserun,attenuatedthelevelsofcytokines(TNF-a,IL-6andCRP)inserum,markedlyattenuatedlivertheelevationinMDAcontentandimprovedthereductionofglutathione(GSH)intheliverofD-GalN/LPS-inducedALFmice.Besides,OBBRdecreasedthemRNAandproteinexpressionofcytokines(TNF-aandIL-6)andinhibitedproteinexpressionlevelsofphosphorylatedp38,35JNK,ERKandnuclearfactorkB(NF-kB)intheliver.Keywords:OBBR;Anti-inflammatory;Antioxidant;acuteliverfailure(ALF);Toll-likereceptor40引言肝脏是是人体内最大的新陈代谢器官。酒精中毒、药物中毒和病毒感染等各种原因会引40起急性肝损伤[1]。目前，除了肝移植没有有效的治疗急性肝损伤的方法，因此,寻找有效的治疗方法尤为重要。LPS又被称为内毒素，LPS与TLR4结合后激活TLR4信号途径，随后激活NF-kB和基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（20130182110023）作者简介：向红梅（1992），女，生物化学与分子生物学通信联系人：叶小利(1971),女，教授、硕导，生物化学与分子生物学.E-mail:yexiaoli@swu.edu.cn-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnMAPKs信号途径从而促使TNF-α、IL-6等炎症因子的释放，最后导致急性肝损伤[2-6]。MD-2通常与TLR一起位于细胞膜上，LPS通过其脂质A与MD-2结合从而激活TLR4信号途径45[7]。脂多糖/半乳糖氨（LPS/D-GalN）诱导的小鼠急性肝损伤是目前经典的用于研究急性肝损伤及其机制的动物模型[8-9]。在这个模型中，注射LPS/D-GalN后，产生大量炎症细胞因子[10]。此模型与临床上的急性肝损伤很相似。小檗碱是一种重要的生物碱,存在于药用植物中。先前研究表明,小檗碱及其衍生物有治50疗癌症、肥胖、糖尿病、炎症、动脉粥样硬化、阿尔茨海默病、类风湿性关节炎和心血管疾病等的作用[11]。数据表明,小檗碱具有抗炎作用[12],抗菌活性[13,14]和抗氧化作用[15]。OBBR是OBBR的衍生物,所以它可能有类似的作用。1材料和方法1.1材料55OBBR（纯度＞97%）由实验室方法合成，OBBR的化学结构如图1所示。雄性昆明小鼠（20±2g）购买于重庆医科大学实验动物中心，小鼠饲养在温度为25±1°C、湿度为55±5%，各12h明暗周期的饲养室。D-氨基半乳糖（D-GalN）、脂多糖(LPS)、丙氨酸转移酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽-S转移酶(GSH)试剂检验盒购买于南京建成生物工程研究所。白介素(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-a)试剂盒购Biosource公司。各种60一抗和二抗购买于武汉三鹰公司。图1OBBR结构Fig.1ChemicalstructureofOBBR.OBBRindicated8-ococtylberberine.651.2功能注释生物信息学信息分析利用ChemDrawUltra8.0绘制结构，利用PharmMapper数据库寻找药物蛋白靶标，利用DAVID数据库和KEGGPATHWAY数据库可分别预测OBBR相关的疾病和信号通路。TLR4/MD-2蛋白受体(PDBID:5IJD)通过PDB数据库下载得到。将配体和受体导入到70DiscoveryStudioClient2.5中，通过配体受体相互作用分析可知配体与受体之间的结合程度。1.3动物实验过程小鼠20只，随机分为四组（5只/组）：对照组（Control）、模型组LPS/D-GalN、药物组（15mg/Kg.day和30mg/Kg.day）。小鼠连续给药7天，末次给药后1h，模型组和药物组腹腔注射LPS（500ug/Kg/D-GalN(400mg/Kg)诱导小鼠急性肝损伤，对照组腹腔注射同等75体积的生理盐水。4小时后处死小鼠，收集血清和肝脏备用。-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn1.4组织学分析取四组小鼠相同部位的肝脏组织放入4%甲醛中固定石蜡包埋，HE染色，做病理组织学检查。观察每组切片的组织受损程度。1.5肝损伤评估80ALT，AST在早期判断肝损伤上具有较高的灵敏性。MDA及GSH水平是反映氧化程度的两个指标。血清AST和ALT及肝脏组织MDA和GSH水平通过相应试剂盒检测。1.6蛋白质免疫印迹用中等强度的裂解液裂解组织中的蛋白质，再用SDS-PAGE分离蛋白，转膜并孵育一抗和二抗，最后显色。851.7mRNA提取及RT-PCR检测采用Trizol法提取组织总RNA并反转录为cDNA.TNF-a上游引物为5"-TAGCCAGGAGGGAGAACAGA-3"，下游引物为5"-TTTTCTGGAGGGAGATGTGG-3"；IL-6上游引物为5"-TCCAGTTGCCTTCTTGGGAC-3"下游引物为5"-GTGTAATTAAGCCTCCGACTTG-3"。PCR反应条件如下：95°C3min,95°C10s,62°C3s，9072°C30s，40个循环。1.8数据分析使用SPSS分析软件(16.0版本，美国)进行统计学分析，多组间的比较采用单因素方差分析处理，数据均以X±SE表示。分析所得值P<0.05被认为是具有显著性差异，P<0.01则表示具有极显著差异。952结果2.1功能注释生物信息学信息分析PharmMapper数据库筛选最终得到68个潜在靶蛋白。通过DAVID分析发现OBBR有治疗多种肝脏疾病的潜力,如图2。同时,通过KEGG分析发现OBBR与PI3K-AKT,MAPK及NF-kB信号通路相关。-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn100图2“药物-基因-疾病”网络图Fig.2The“Drug-Target-Disease”Network2.2OBBR减轻D-GalN/LPS诱导的急性肝损伤105如图3所示,对照组存活率为100%,D-GalN/LPS组小鼠在6小时开始死亡且在12小时时存活率为0,而OBBR剂量依赖性地提高了小鼠存活率。组织切片结果（图3）表明对照组有正常的肝小叶结构和细胞结构，其结构清晰，排列整齐，没有炎性细胞的浸润。D-GalN/LPS组肝细胞广泛坏死，肝细胞结构被破坏，有大量的炎性粒细胞被浸润。药物组减弱了小鼠急性肝损伤。110图3（A）OBBR提高小鼠存活率，每组10只小鼠。（B）组织学分析结果。所有结果均以平均值±SE表示；**表示与对照组有显著性差异；#表示与模型组有极显著性差异。Fig.3(A)OBBRreducedmicemortalityinducedbyD-GalN(400mg/kg)/LPS(500ug/kg).Allgroupsconsistedof10mice.(B)EffectofOBBR(15and30mg/kg)onliverhistologyinmice4hafterchallengedbyD-GalN/LPS.115HistologicalassessmentswereperformedbyH&E.Typicalimageswerechosenfromeachexperimentalgroup(originalmagnification400×).Dataareexpressedasmeans±SE.**representsP<0.01versuscontrolgroup;D-GalN/LPS,D-galactosamine/lipopolysaccharide.2.3OBBR对血浆中ALT和AST及肝脏中GSH和MDA水平的影响120如图4所示，D-GalN/LPS组中AST和ALT的水平极显著增加，药物组降低了血浆中AST和ALT的含量。同时D-GalN/LPS组中GSH水平极显著降低，OBBR剂量依赖性地增加了肝脏中GSH的表达；D-GalN/LPS增加了MDA的产生，OBBR降低了D-GalN/LPS诱-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn导的MDA的增加。由此说明，OBBR有抗氧化及肝保护作用。125图4OBBR对肝功能及氧化水平的影响。（A）血清AST活性。（B）血清ALT活性。（C）肝脏GSH表达水平。（D）肝脏MDA表达水平。所有结果均以平均值±SE表示*表示与对照组有显著性差异；**表示与对照组有显著性差异；@表示与模型组有显著性差异；#表示与模型组有极显著性差异。Fig.4EffectofOBBR(15and30mg/kg)onliverfunctionandantioxidantabilityofliver.(A)plasmaASTactivity.(B)plasmaALTactivity.(C)GSHcontentoftheliver.(D)hepaticMDAcontents.Dataareexpressedasmeans±130SE.*significantlydifferentfromnomalgroupatp<0.05,**representsP<0.01versuscontrolgroup;@indicatesP<0.05versusGalN/LPSgroup;#indicatesP<0.01versusD-GalN/LPSgroup.2.4OBBR对血浆中IL-6、TNF-a和CRP水平的影响表1结果表明，模型组中IL-6、TNF-a和CRP水平都显著增加，OBBR降低了血浆中135IL-6、TNF-a和CRP的表达且具有剂量依赖关系。表明OBBR具有抗炎及肝保护作用。表1OBBR对血清中IL-6,TNF-α和CRP表达的影响Table.1EffectofOBBRonplasmaIL-6,TNF-αandCRPlevelsinmiceafterD-GalN/LPSinjection.GroupsIL-6(pg/ml)TNF-α(pg/ml)CRP(ng/ml)D-GaIN/LPS203.97±5.93a248.±9.15a87.94±3.70aOBBR15+D-GaIN/LPS121.84±4.72c188.±6.57c76.17±2.63bOBBR30+D-GaIN/LPS80.3±3.29c101.±4.21c46.91±3.03c血清IL-6,TNF-α和CRP通过特定试剂盒检测。a表示与对照组有极显著差异；b表示与模型组有显著性差140异；c表示与模型组有极显著性差异。所有结果均以平均值±SE表示。TheplasmaIL-6,TNF-αandCRPlevelsweredeterminedat4hafterD-GalN/LPSinjection.OBBR,8-ococtylberberine;D-GaIN/LPS,D-galactosamine/lipopolysaccharide;IL-6,interleukin6.TNF-a,tumornecrosisfactor-a.CRP,C-reactiveprotein.Dataareexpressedasmeans±SE.aP<0.01comparedwithcontrolgroup.145bP<0.05,comparedwithD-GalN/LPSgroup.cP<0.01,comparedwithD-GalN/LPSgroup.2.5OBBR对肝脏中IL-6及TNF-a表达的影响结果如图5所示，D-GalN/LPS极显著增加了肝脏组织中TNF-a和IL-6在mRNA和蛋150白水平上的表达，OBBR降低了它们的表达，且有剂量依赖关系。-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图5OBBR对肝脏中TNF-a和IL-6表达的影响。蛋白水平表达通过westernblot检测，mRNA水平表达通过QRT-PCR检测。所有结果均以平均值±SE表示。*表示与对照组有显著性差异；**表示与对照组有显著性差异；@表示与模型组有显著性差异；#表示与模型组有极显著性差异。155Fig.5EffectofOBBR(15and30mg/kg)onmRNAandproteinexpressionofTNF-aandIL-6inthelivertissues4hafterD-GalN/LPSinjection.TheproteinandmRNAexpressionsofTNF-aintheliverweremeasuredbyWesternblottingandQRT-PCR.Thevaluesarerepresentedasmeans±SE*representsP<0.05versuscontrolgroup;**representsP<0.01versuscontrolgroup;;@indicatesP<0.05versusD-GalN/LPSgroup,#indicatesP<0.01versusD-GalN/LPSgroup.1602.6OBBR对TLR4、P38、ERK、JNK和NF-kB蛋白质表达的影响如图6所示，D-GalN/LPS增加了TLR4、NF-kB、P38、ERK和JNK蛋白在肝脏组织中的表达，OBBR剂量依赖性地降低了它们的表达。165图6OBBR对TLR4（A）核NF-kB（B）及MAPKs蛋白磷酸化（C）的影响。蛋白表达通过westernblot检测。所有结果均以平均值±SE表示。*表示与对照组有显著性差异；**表示与对照组有显著性差异；@表示与模型组有显著性差异；#表示与模型组有极显著性差异。Fig.6EffectofOBBR(15and30mg/kg)onTLR4proteinexpression(A)nuclearNF-κBproteinexpression(B)andMAPKphosphorylation(C)intheliver4hafterexposuretoD-GalN/LPS.TLR4,totalandphospho-p38,JNK170andERKandNF-kBlevelsintheliverweredeterminedbyWesternblotting.Allvaluesarerepresentedasmeans±SE.*representsP<0.05versuscontrolgroup;**representsP<0.01versuscontrolgroup;;@indicatesP<0.05versusD-GalN/LPSgroup,#indicatesP<0.01versusD-GalN/LPSgroup.2.7OBBR影响LPS与TLR4/MD-2的结合175结果表明OBBR具有抗炎抗氧化作用。LPS通过疏水作用与TLR4/MD-2结合后激活TLR4信号通路，从而引起急性肝损伤。由于OBBR同LPS一样具有疏水表面，竞争性地-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn与LR4/MD-2的结合从而达到肝保护作用。图7结果表明，BBR和OBBR可与TLR4/MD-2结合且OBBR强于BBR。由此可见，OBBR可作为LPS的拮抗剂与TLR4/MD-2受体结合而抑制了TLR4途径，以达到肝保护作用。180图7受体配体相互作用。（A）BBR与TLR4结合；（B）BBR与MD-2结合；（C）OBBR与TLR4结合；（D）OBBR与MD-2结合。Fig.7Interactionbetweenproteinandligand.(A)TLR4andligandBBR(LibDockscore:69.9185);(B)MD-2and185ligandBBR(LibDockscore:115.325);(C)TLR4andligandOBBR(LibDockscore:104.166);(D)MD-2andligandOBBR(LibDockscore:145.471).3讨论组织学结果表明OBBR具有肝保护作用。另外，OBBR降低了血清AST和ALT活性，表明OBBR具有改善肝功能的作用；同时，OBBR增加了肝脏中190GSH含量并降低了MDA的含量，这表明OBBR具有抗氧化作用。TNF-a是一把双刃剑，TNF-a是肝细胞正常增值所必需的，但过多的TNF-a可能导致肝脏组织损伤和炎症[16,17]。动物实验结果表明，OBBR明显缓解了D-GalN/LPS诱导的肝损伤和肝脏炎症。为了探究OBBR是否是通过抑制TNF-a表达来缓解肝损伤，我们检测了TNF-a在血浆和肝脏组织中的表达情况。结果195表明TNF-a在血浆和肝脏组织中的表达显著增加，OBBR降低TNF-a在血浆和肝脏组织中的表达。这些数据表明，OBBR可以改善由D-GalN/LPS引起的TNF-a增长，使血浆和肝脏组织中的TNF-a的含量减少，从而对肝脏起保护作用。此外，炎症因子IL-6也是急性肝损伤的诱导物。从实验数据中可以看出OBBR也抑制了IL-6蛋白在肝组织和血浆中的表达。TNF-a和IL-6可以调节CRP在肝200脏中的合成，数据显示,OBBR明显抑制血浆中CRP的表达。功能注释生物信息学信息分析结果表明，OBBR有治疗多种肝脏疾病如肝硬化、药物引起的肝损伤、肝肿瘤和乙型肝炎的潜力。同时，KEGG分析结果表明OBBR与PI3K-AKT、MAPK和NF-kB信号途径相关。TLR4在炎症通路中起着至关重要的作用。LPS与TLR4结合可激活TLR4205从而激活MAPK通路，MAPK通路是细胞中引发炎症最广泛的的调节机制[18]。实验结果表明D-GalN/LPS显著增加了TLR4以及下游ERK,p38,JNK这三个蛋-7- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn白的表达，而OBBR降低了这些蛋白质的表达。这些实验结果表明OBBR可能是通过抑制TLR4信号通路来减轻促炎症因子的表达，从而缓解急性肝损伤的。LPS与TLR4结合可以触发IkBα磷酸化从而诱导NF-kB从细胞质转移到细胞核,210从而促进TNF-a的表达。实验结果显示,OBBR降低了NF-kB蛋白在肝脏中的表达。综上所述，LPS激活TLR4信号通路，从而增加下游ERK,p38,JNK，NF-kB的表达，这些蛋白刺激炎症因子IL-6，TNF-a的产生，从而导致炎症。OBBR可以通过抑制TLR4信号通路，下调MAPK通路和NF-κB通路以减少促炎症因子215的产生来缓解急性肝损伤。LPS通过其脂质A与TLR4/MD-2中的MD-2结合而激活TLR4信号途径并随之导致肝损伤。由于OBBR与LPS一样具有疏水表面，所以可能竞争性地与TLR4/MD-2结合，先前研究也表明BBR通过其疏水表面与TLR4/MD-2结合从而达到抗菌作用。为了炎症这一假设，通过DiscoveryStudioClient2.5进行了配220体受体结合分析。结果表明OBBR和BBR可以作为LPS的拮抗剂与TLR4/MD-2受体结合从而达到减轻由D-GalN/LPS诱导的急性肝损伤的作用。4结论OBBR具有抗炎抗氧化作用。OBBR可作为LPS的拮抗剂以抑制TLR4信号通路，从而达到肝保护作用。225[参考文献](References)[1]S.N.Zhang,N.B.Yang,S.L.Ni,W.Y.Li,L.M.Xu,P.H.Dong,M.Q.Lu,Pretreatmentoflipopolysaccharide(LPS)amelioratesD-GalN/LPSinducedacuteliverfailurethroughTLR4signalingpathway,Internationaljournalofclinicalandexperimentalpathology,7(2014)6626-6634.230[2]A.Visintin,E.Latz,B.G.Monks,T.Espevik,D.T.Golenbock,Lysines128and132enablelipopolysaccharidebindingtoMD-2,A.Visintin,E.Latz,B.G.Monks,T.Espevik,D.T.Golenbock,Lysines128and132enablelipopolysaccharidebindingtoMD-2,leadingtoToll-likereceptor-4aggregationandsignaltransduction,TheJournalofbiologicalchemistry,278(2003)48313-48320.[3]G.Sass,S.Heinlein,A.Agli,R.Bang,J.Schumann,G.Tiegs,Cytokineexpressioninthreemousemodelsof235experimentalhepatitis,Cytokine,19(2002)115-120.[4]H.Kudo,T.Takahara,Y.Yata,K.Kawai,W.Zhang,T.Sugiyama,LipopolysaccharidetriggeredTNF-alpha-inducedhepatocyteapoptosisinamurinenon-alcoholicsteatohepatitismodel,Journalofhepatology,51(2009)168-175.[5]T.Nakama,S.Hirono,A.Moriuchi,S.Hasuike,K.Nagata,T.Hori,A.Ido,K.Hayashi,H.Tsubouchi,240EtoposidepreventsapoptosisinmouseliverwithD-galactosamine/lipopolysaccharide-inducedfulminanthepaticfailureresultinginreductionoflethality,Hepatology,33(2001)1441-1450.[6]O.Takeuchi,S.Akira,Patternrecognitionreceptorsandinflammation,Cell,140(2010)805-820.[7]Y.Nagai,S.Akashi,M.Nagafuku,M.Ogata,Y.Iwakura,S.Akira,T.Kitamura,A.Kosugi,M.Kimoto,K.Miyake,EssentialroleofMD-2inLPSresponsivenessandTLR4distribution,Natureimmunology,3(2002)245667-672.[8]I.Hishinuma,J.Nagakawa,K.Hirota,K.Miyamoto,K.Tsukidate,T.Yamanaka,K.Katayama,I.Yamatsu,Involvementoftumornecrosisfactor-alphaindevelopmentofhepaticinjuryingalactosamine-sensitizedmice,Hepatology,12(1990)1187-1191.[9]C.Galanos,M.A.Freudenberg,W.Reutter,Galactosamine-inducedsensitizationtothelethaleffectsof250endotoxin,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,76(1979)-8- 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