噬菌体展示筛选与狂犬病毒P互作的宿主蛋白.pdf 9页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn噬菌体展示筛选与狂犬病毒P互作的宿主蛋#白1,21,21,21,2**董婉玉，李有文，傅振芳，彭贵青5（1.华中农业大学动物医学院，武汉430070；2.华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，湖北武汉，430070）摘要：狂犬病是一种人或其他温血动物的病毒性脑脊髓炎，在家畜和野生动物之间可以自然感染与传播，感染后一旦出现临床症状，致死率几乎100%。其病原体是弹状病毒科狂犬病10毒属的狂犬病毒（Rabiesvirus,RABV）。狂犬病毒有五种结构蛋白，其中磷酸化蛋白P是一种多功能的非催化活性蛋白，在病毒的转录和复制过程中发挥重要作用，而狂犬病毒的致病机制仍未完全阐明。本研究首先表达纯化了狂犬病毒P蛋白，以纯化的P蛋白为靶蛋白，通过T7噬菌体展示的方法筛选相互作用蛋白。通过5轮的淘选，筛选得到多个阳性克隆，其中核糖体大亚基蛋白L9（RPL9）与P蛋白特异性相互作用，并通过ELISA、GSTpull-down15得到验证，为进一步阐明狂犬病毒的复制和致病机理奠定基础。关键词：狂犬病毒；P蛋白；噬菌体展示技术；相互作用中图分类号：S855ScreeningtheHostProteinsInteractionwithRabiesVirusP20byPhageDisplaySystem1,21,21,21,2Dongwanyu,Liyouwen,Fuzhenfang,Pengguiqing(1.CollegeofVeterinaryMedicine,HuazhongAgricultureUniversity,Wuhan430070;2.StateKeyLaboratoryofAgriculturalMicrobiology,HuazhongAgriculturalUniversity,HubeiWuhan,430070)25Abstract:Rabiesisakindofviralencephalomyelitisforpeopleorotherwarm-bloodedanimals.onceappearclinicalsymptoms,thefatalityrateisalmost100%.ThepathogenisRabiesvirus,whichbelongtotheLyssavirusgenusoftheRhabdoviridaefamily.Rabiesvirusiscomposedoffivestructuralproteins.Thephosphorylatedprotein(P),whichisanuncatalyticactivityprotein,playsanimportantroleinthevirusreplication,transcriptionandinterferonantagonism.Moreover,thepathogenesisof30rabiesvirusisstillfarfromunderstanding.Toidentifyacellularprotein(s)thatinteractswithRABVPprotein,weperformedaphagedisplay-basedproteininteractionscreen.Throughfiveroundsofelutriation,weobtainedseveralpositiveclones.AndtheresultsshowthatRPL9isthetargetofPprotein.BindingbetweenRPL9andPwasalsodemonstratedbyELISA,GSTpull-down.Ourstudylaidthefoundationtofurtherclarifythemechanismofrabiesvirusreplicationandpathogenesis.35Keywords:Rabiesvirus;P;Phagedisplaytechnology;Interaction0引言狂犬病又称恐水症，是由狂犬病毒所致的自然疫源性人畜共患神经系统急性[1]40传染病，可以感染人和所有的温血动物，每年导致约6,0000人的死亡。狂犬病[2-3]的分布呈全球性，几乎所有国家和地区都有狂犬病疫情，除南极洲外的其它基金项目：高校博士点基金（项目编号：20130146120004）作者简介：董婉玉（1989-），女，预防兽医学博士研究生，主要从事RABV与宿主蛋白的互作研究通信联系人：彭贵青（1979-），男，教授，博导，从事兽医传染病防控理论和技术研究.E-mail:penggq@mail.hzau.edu.cn-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn[4-6]地方都有狂犬病例报告，其中绝大多数病例集中于亚、非、拉。我国近些年狂犬病疫情严重，平均每年狂犬病报告人数约为3000人左右，仅次于印度居世[7]界第二。45狂犬病病毒是不分节段单股负链RNA病毒，基因组全长约12kb，在其两端分布着先导序列(Le)和尾部序列(Tr)两个非编码区域，基团组编码五种病毒结构蛋白（3’到5’）：核蛋白(N)、磷酸化蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G蛋白)及RNA依赖的RNA聚合酶（或大蛋白，L）。狂犬病病毒P蛋白是多功能蛋白，主要的功能是作为病毒聚合酶L蛋白的辅助因子，在病毒转录与复制中发挥着重50要的作用。P蛋白有两个独立的N蛋白结合区域。其中N端aa69-177区域与新合成的没有结合RNA分子的N蛋白(N0)结合，形成N0-P复合体，对新合成的N蛋白起着伴侣蛋白的作用，使其正确折叠，并使其只能特异性结合病毒的基因组和反[8]基因组RNA；P蛋白的C端aa186-297区域与N-RNA结合，对于P蛋白参与[9]55病毒转录的能力相当重要。目前一般认为P蛋白N端19个aa负责与L蛋白的结合[8]。P蛋白的第二大类功能就是参与免疫防御。P蛋白通过C端区域分别与干扰素通路相关蛋白PML、STAT互作，抑制细胞干扰素的产生，从而抑制细胞[10]的先天性免疫反应。近期还发现P蛋白能够通过PCED区域aa106-131与粘着[11]斑激酶(FAK)互作，而调控RABV的感染。P蛋白的第三类功能是与宿主的其60他蛋白或因子作用，劫持宿主为病毒增殖服务。P蛋白通过其下游无序区域aa144-149与微管运输系统中动力蛋白轻链LC8紧密结合，为病毒高效转录服务，[12]或在神经元细胞轴突逆向运输。有研究指出缺失P蛋白的RABV突变体毒株[13]没有复制能力。因此，分析RABVP蛋白与宿主蛋白相互作用不仅对其致病机制研究至关重要，也可为抗病毒新药设计、新型疫苗等研究提供新思路。651材料与方法1.1材料1.1.1毒株，菌株，细胞，载体狂犬病毒疫苗株（SAD-L16），大肠杆菌DH5、BL21由本实验室保存；T7噬菌体（文库）、5403（噬菌体宿主菌）购自Novagen公司；pET-42bVector，70pGEX-KGVector由本实验室保。1.1.2工具酶及主要试剂-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnTrizol试剂（Invitrogen）；卡那霉素，30％丙烯酰胺，显色剂A/B购自碧云天公司；84消毒液，医用酒精，胰酶，乙醇，三氯甲烷，异丙醇等购自国药试剂公司；2×MIXTaq酶，Primestar，dNTP，T4DNA连接酶，DNA标准分子参75照物，限制性内切酶NdeⅠ，EcoRⅠ等购自大连宝生物有限公司；质粒提取试剂盒购自北京天根生物科技有限公司；琼脂糖，DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Boiful公司；DNA纯化回收试剂盒购自OMEGA公司；Ni柱填料购自美国Novagen公司；低熔点琼脂糖购自Promega公司；其他试剂为国产分析纯。P单克隆抗体由实验室自制；His单抗、羊抗兔二抗、羊抗小鼠二抗购自武80汉博士得公司；T7噬菌体抗体购自美国Novagen公司。1.2方法1.2.1RABVP蛋白原核表达质粒的构建用TRIZOL法提取的狂犬病毒SAD-L16的基因组RNA，反转录后用SAD-L16-P特异性引物PCR扩增RABV的P基因，将P基因和pET-42b载体85用NdeI和EcoRⅠ同时进行双酶切，经T4连接酶连接，构建原核表达质粒pET-42b-P。1.2.2RABVP重组蛋白的诱导表达及纯化从狂犬病毒SAD-L16基因组中扩增P基因，将P基因全长片段克隆到pET42b载体上，测序无突变后，转化质粒到BL21感受态细胞中，使其在大肠90杆菌中表达。利用Ni亲和柱（HisTrapHP）及分子筛（16/600Superdex200）纯化蛋白。1.2.3噬菌体展示筛选1.ELISA板的包被靶蛋白P(1-10µg/ml)加入ELISA板的孔中100µl孔；用封口膜封好，用封95口膜封好，4℃储存备用。2.筛选和扩增噬菌体及序列测定(1)筛选与洗脱将噬菌体文库加入已包被的板中，在室温下放置30min或4℃过夜，用1×TBST（200µl/孔）洗板5次。加入200µlT7洗脱缓冲液，室温放置10－20min;100将洗脱的噬菌体转移到1.5ml灭菌EP管中;取10µl测定滴度；余下用于扩增。(2)扩增-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn取余下的噬菌体洗脱液加入到50m15403感受态细胞中，37℃摇菌，直到细菌裂解(1-3h)；8,000rpm离心10min取上清加入1/6体积的PEG/NaCl(13%),混匀4℃过夜，8,000rpm离心20min弃去上清；500µlTBS溶解沉淀后12000rpm105离心5min，将上清取10µl测定滴度，剩余4℃储存备用；如此反复，结合一洗脱一扩增，通过3-5轮筛选直到洗脱的噬菌体滴度稳定在一定数量级，铺板，挑取单个噬菌斑。(3)滴度测定将被测噬菌体悬液用LB进行10倍稀释；取100µl不同稀释度的噬菌体分别110加入0.25ml5403菌液混匀;再加入溶化的0.6%的低熔点琼脂糖，2.5ml/管；倒入制备好的LB琼脂平板中，静置5min待顶层凝固后于37℃培养箱中倒置3-4h；计数并计算噬菌体滴度：噬菌体滴度是指单位体积噬菌斑形成的个数(pfu)。即平板上噬菌斑的个数乘稀释倍数再乘10(计算1ml铺板的噬菌体)。3.筛选噬菌的测序数据分析115将最后一轮筛选的噬菌斑用T7噬菌体特异引物进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳鉴定，并将PCR产物送金斯瑞生物公司测序。将测出的序列翻译为氨基酸，并与美国国立卫生院(NCBI)的GenBank数据库中序列进行同源比较。并根据比对结果中对应的蛋白的功能特性，筛出的频度，确定研究的备选互作蛋白，并扩增其噬菌体。1201.2.4备选蛋白的ELISA测定将P蛋白包被于ELISA板中，加入扩增的噬菌体上清液100μl/孔，室温孵育1h；去上清，TBST（TBS/0.02%Tween）洗三次；加入噬菌体抗体（用5％MilkTBS1:10,000稀释）100μl/孔，室温孵育1h，TBST（TBS/0.02%Tween）洗三次；加入100μl底物，室温显色10min；加入50μl1M硫酸终止，酶标125仪测定OD630值。1.2.5GST-pulldown鉴定将13种备选蛋白克隆至pGEX-KG载体上，IPTG诱导表达。将细胞收集超声破碎后取上清。加入GSTbeat40μl于4℃转床翻转2h。再加入P-His蛋白40μg，于4℃转床翻转1h，4℃12，000rpm离心3min，弃上清，沉淀中加130入1mlTBST洗脱重悬，并于4℃转床翻转15min，重复3次。最后在沉淀中加入0.1M的谷胱甘肽溶液洗脱，或直接加入SDS-PAGE上样缓冲液煮沸。取处-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn理好的样品10μl，小心点到醋酸纤维膜上（NC膜），尽量不要太大，可以重复点样以提高浓度。室温晾干后，用5%的脱脂奶粉封闭2h或4℃过夜。做免疫印迹试验。1352实验结果2.1RABVP的表达与纯化将P基因片段连接至pET-42b载体，构建原核表达质粒pET-42b-P，转化大肠杆菌BL21，37℃经0.5mMIPTG诱导5h后经低温超高压破碎仪处理，离心后取上清过Ni柱，SDS-PAGE凝胶电泳结果显示：P蛋白经IPTG诱导后有大140量表达(图1A)，用Westernblotting检测确定所表达的蛋白为目的蛋白（图1B）。将目的蛋白浓缩至1ml过分子筛，蛋白有两种聚集形式（1C）。图1P目的蛋白的表达纯化和鉴定Figure1Theexpression,purification,identificationofPprotein.A.TheSDS-PAGEanalysisofsamplescollected145duringNi-NTAaffinitychromatographyoftheSAD-P(Coomassiebrilliantbluestaining);B.Western-blotdetectionofthePProtein;C.Gelfiltrationchromatographyofthefull-lengthSAD-P;2.2RABV-P相互作用蛋白的筛选与鉴定2.2.1T7人脑cDNA文库的筛选8经过五轮的筛选，第4轮-第5轮噬菌体的洗脱量达到10pfu，噬菌体的投150入量、产出量以及投入/产出见表1。从表可以看出随着筛选次数的增加，投入产出的比例先减小，后趋于稳定，表明至第四轮之后噬菌体的富集程度已趋于饱和。大多数噬菌体可以与P蛋白结合。筛选过程中蚀斑见图3-4A。表1不同轮次筛选时噬菌体的投入量和产出量（pfu）Tab.3-1Inputandoutputphagesafterdifferentroundsofscreening筛选轮次投入量产出量投入/产出96315.4×102.7×102.0×10107324.5×104.5×101.0×10107335.6×101.5×103.7×10108242.3×101.3×101.7×10-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn108252.5×102.3×101.1×101552.2.2PCR鉴定、测序与分析挑取第五轮筛选的噬菌斑进行PCR扩增，1%琼脂糖电泳的结果如图2B。共扩增了263个克隆，扩增到的DNA片段大多在200bp-1500bp之间。图2噬菌体展示筛选狂犬病毒P蛋白的互作蛋白160Figure2ScreeningInteractionproteinwithrabiesvirusPproteinbyPhagedisplay；A.Theplaqueintheprocessofscreening；B.AgaroseelectrophoresisfigureofPCRproductswereamplifiedbyspecificprimersofT7phageasatemplateofthefifthroundofscreeningphage;C.TheELISAresultsofapartofscreeningprotein.为了进一步筛选亲和力较强的噬菌体，用P蛋白作为抗原包被ELISA板，选取部分测序后阅读框匹配的筛选蛋白的噬菌体结合，再用噬菌体的抗体去检165测。总共挑选了90个筛选蛋白。ELISA检测结果，部分OD值较高的结果图2C。由图可以看出，PBS、空宿主菌、未经筛选的噬菌体库等阴性对照的OD490值均为0.1以下，其它的筛选蛋白的噬菌体的值均高于0.1，大部分分布于0.5－0.6之间。根据序列分析结果，ELISA测定结果，蛋白可能的生物学功能选择其中部分蛋白作为后备蛋白进行研究。部分后备蛋白的情况如表2。170表2噬菌体展示筛选的与P蛋白互用的部分后备蛋白Table2Phagedisplay-screenedcellularfactorsinteractingwiththePprotein编蛋白频实长获长功能号名称次bpbp60S核糖体组成成分，蛋白翻译中起校正作1RPL94579579用，影响tRNA的P定位参与RNA聚合酶II的作用，对翻译起负调2NEF-E11143435控-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn在神经轴突上游走，与营养运输和信号传导3Coiled-coil122540540有关ABC超家族，与细胞膜内外运输，脂肪酸辅4ATP-binding14746258酶A循环代谢有关，引起肾上腺脑蛋白营养不良，脱鞘病发现人hnRNA核酸结合蛋白，负责RNA的5KH110381038识别Splicing结合单链的3’AG，在外显子内含子催化反611206723factor45应调节使用和拼接7Prnrc23420420富含脯氨酸的核受体激活2.2.3GST-pulldown确定SAD-P的互作蛋白L9根据候选蛋白的功能并结合P在狂犬病毒增殖中发挥的作用，且有研究报道L9在鼠乳腺瘤病毒(MMTV)装配中有重要作用，我们首先通过GST-pulldown的175方法验证P与L9的相互作用。将L9基因克隆至pGEX-KG载体上，IPTG诱导表达，将细胞收集超声破碎后取上清。将细胞破碎上清、P-His蛋白与还原型谷胱甘肽琼脂糖珠共同孵育，结合到琼脂糖珠上的蛋白用含triton-X100的缓冲液充分洗涤，除去没有结合的蛋白，再加入SDS-PAGE上样液煮沸，用His单抗作Western-blot检测。图3结果可以看出GST-L9可以特异的结合P蛋白。180图3GST-pulldown验证RABV-P与L9的相互作用Figure3IdentificationoftheinteractionbetweenPandL9byGST-pulldown.Lane1,P-Hisproteinonly;lane2,P-HisproteinandGST;lane3,P-HisproteinandL9-GST.3讨论185P蛋白进行分子筛纯化时可看到两个峰，经鉴定两个峰都是P蛋白，说明P蛋白在体外的存在形式不是单一的，且两种聚集状态会按一定的比例存在。因为在分子筛的纯化中，将出现的两个峰中的一个峰回收，再进行分子筛时，其又会-7- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn出现两个峰，且峰出现的位置不变。这与资料中显示的二聚体功能蛋白差别较大，这也可能是P蛋白全长的结构一直不能被解析的原因。不过，能够得到大量表达190P蛋白，为进一步研究P蛋白的结构和功能，分析与之相互作用的蛋白或者基因奠定基础。还可探索以P蛋白为抗原，建立敏感、特异的免疫诊断方法，并系统分析其诱导的免疫应答，以更详细的探究RABV的致病机理。我们使用噬菌体展示的方法，用纯化P蛋白作为诱饵识别细胞中的其他目标蛋白。本研究发现13种细胞因子可能与P蛋白作用，并通过GST-pulldown验195证了P蛋白与L9的相互作用，说明我们的筛选方法是可靠的。这些筛选出的候选蛋白为进一步研究P蛋白在狂犬病毒复制过程的功能以及狂犬病毒的致病机制提供参考依据。4结论本实验通过构建重组表达质粒pET-42b-P，利用大肠杆菌原核表达系统成功200表达RABVP蛋白，并以Ni柱和分子筛层析方法纯化后获得该蛋白。经过噬菌体展示筛选出人脑噬菌体文库中可能与P有相互作用的蛋白，共获得了13个候选蛋白，并通过ELISA方法进行了初步的验证。我们通过GST-pulldown确定了候选蛋白之一L9与P蛋白的相互作用。互作蛋白的筛选与验证为进一步研究P蛋白的生物学功能以及阐明狂犬病毒的复制机制和致病机理奠定基础。205[参考文献](References)[1]LMartinez.Globalinfectiousdiseasesurveillance[J].InternationalJournalofInfectiousDiseases,2000,4(4):222-228.[2][1]2.TaylorLH,LathamSM,MarkEJ.Riskfactorsforhumandiseaseemergence[J].PhilosophicalTransactionsoftheRoyalSocietyofLondonB:BiologicalSciences,2001,356(1411):983-989.210[3]RupprechtCE,HanlonCA,HemachudhaT.Rabiesre-examined[J].TheLancetinfectiousdiseases,2002,2(6):327-343.[4]MeslinFX,FishbeinDB,MatterHC.Rationaleandprospectsforrabieseliminationindevelopingcountries[J].Currenttopicsinmicrobiologyandimmunology,1994,187:1.[5]BlancouJ.Ecologyandepidemiologyoffoxrabies[J].ReviewofInfectiousDiseases,1988,10(Supplement4):215S606-S609.[6]Kilic,B.,B.Unal,S.Semin,andS.K.Konakci.Animportantpublichealthproblem:rabiessuspectedbitesandpost-exposureprophylaxisinahealthdistrictinTurkey[J].Internationaljournalofinfectiousdiseases:IJID:officialpublicationoftheInternationalSocietyforInfectiousDiseases2006;10:248-254.[7]BourhyH,GoudalM,MaillesA,etal.Isthereaneedforanti-rabiesvaccineandimmunoglobulinsrationingin220Europe?[J].EuroSurveill2009;14:pii:19166.[8]Chenik,M.,M.Schnell,K.K.Conzelmann,andD.Blondel.Mappingtheinteractingdomainsbetweentherabiesviruspolymeraseandphosphoprotein[J].Journalofvirology1998；72:1925-1930.[9]Mavrakis,M.,F.Iseni,C.Mazza,G.Schoehn,C.Ebel,M.Gentzel,T.Franz,andR.W.Ruigrok.IsolationandcharacterisationoftherabiesvirusNdegrees-Pcomplexproducedininsectcells[J].Virology2003;305:406-414.225[10]Vidy,A.,M.Chelbi-Alix,andD.Blondel.RabiesvirusPproteininteractswithSTAT1andinhibitsinterferonsignaltransductionpathways[J].Journalofvirology2005;79:14411-14420.[11]Fouquet,B.,J.Nikolic,F.Larrous,H.Bourhy,C.Wirblich,C.Lagaudriere-Gesbert,andD.Blondel..FocaladhesionkinaseisinvolvedinrabiesvirusinfectionthroughitsinteractionwithviralphosphoproteinP[J].Journalofvirology2015;89:1640-1651.-8- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn230[12]Tan,G.S.,M.A.Preuss,J.C.Williams,andM.J.Schnell.Thedyneinlightchain8bindingmotifofrabiesvirusphosphoproteinpromotesefficientviraltranscription[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica2007;104:7229-7234.[13]Shoji,Y.,S.Inoue,K.Nakamichi,I.Kurane,T.Sakai,andK.Morimoto.GenerationandcharacterizationofPgene-deficientrabiesvirus[J].Virology2004;318:295-305.235-9-'