龙眼果肉多糖对巨噬细胞活化作用的研究.pdf 6页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn#龙眼果肉多糖对巨噬细胞活化作用的研究12111**温亚州，蓝海波，戎瑜，聂鹏远，李武（1.海南大学食品学院，海口570228；52.华南农业大学食品学院，广州510642）摘要：研究了龙眼果肉多糖(LP3)对巨噬细胞活化的作用。结果显示，LP3在一定浓度范围内具有促进巨噬细胞增殖和增强其吞噬能力的作用，在400μg/mL时，巨噬细胞的增殖分数和吞噬分数分别为135.90%和192.03%；LP3具有剂量依赖性的增加巨噬细胞NO、TNF-α10和IL-6分泌的作用，在200μg/mL时，细胞NO的分泌值为对照组的5.4倍；在400μg/mL时，细胞TNF-α和IL-6的分泌量为296.20pg/mL和73.69pg/mL，分别为对照组的17.67倍和18.42倍。综合以上结果表明，LP3具有激活巨噬细，调节其功能的作用。关键词：龙眼多糖；巨噬细胞；免疫调节中图分类号：R28515EffectofthePolysaccharidefromLonganPulponActivationofMacrophages12111WENYazhou,LANHaibo,RONGYu,NIEPengyuan,LIWu(1.CollegeofFoodScienceandTechnology,HainanUniversity,Haikou570228;202.CollegeofFoodScienceandTechnology,HuananAgricultureUniversity510642)Abstract:Inthispapereffectofthepolysaccharide(LP3)purifiedfromlonganpulponmacrophageswereinvestigated.TheresultsshowedthatLP3couldfacilitatedtheproliferationandenhancethephagocytosisofmacrophageinacertainconcentrationrange.Theproliferationandphagocytosisofmacrophagesexposedto400μg/mLLP3were135.90%and192.03%,repectively.LP3couldimprove25thesecretionofNO,TNF-αandIL-6inadosedependentmanner.TheNOsecretionsecretedbymacrophagesstimulatedby200μg/mLLP3was5.4timesthanthatofthecontrolgroup.TheTNF-αandIL-6productionofmacrophagesexposedto400μg/mLLP3were296.20pg/mLand73.69pg/mL,whichwere17.67timesand18.42timesthanthatoftheblankgroup,respectively.AlltheseresultsdemonstratedthatLP3couldactivatedthemacrophagesandregulateitsfunctions.30Keywords:longanpolysaccharides;macrophages;immunomodulation0引言多糖是由10个以上的单糖通过糖苷键连接成的大分子聚合物。作为构成生命的基本物[1]质，多糖广泛地参与多种生理活动，调节细胞增殖、分化和机体的生长发育。研究显示，[2][3][4][5]35天然来源的多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化和抗糖尿病等多种生物活性，由于[6]其广泛的来源和较低的副作用，天然多糖的结构与活性研究近年来倍受研究者关注。龙眼（DimocarpuslonganLour.）是我国南方特色水果，干制的龙眼（桂圆）果肉是我[7]国药典收录的一味传统中药，具有治疗失眠健忘、心悸和缓解疲劳等功效。现代研究表明，[8][9][10]龙眼多糖作为龙眼的一种主要生物活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等生物40活性。研究发现，龙眼多糖能够刺激脾淋巴细胞增殖和增强巨噬细胞吞噬功能，促进细胞[11-13]TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ的分泌。对龙眼果肉中主要活性多糖的研究，有助于全面基金项目：国家自然科学基金（31360380）作者简介：温亚州（1986-），硕士研究生，主要研究方向：热带特色生物资源开发利用通信联系人：李武，男，副教授，主要研究方向：食品生物技术.E-mail:Leewuu@163.com-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn了解龙眼多糖的生物活性作用。前期我们从龙眼果肉中纯化获得了一种龙眼多糖（LP3），并对其结构进行了表征，但是，LP3的免疫调节活性还不明确。本文分析了LP3对巨噬细胞的活性作用，为龙眼多糖的开发应用提供理论基础。451材料与方法1.1材料1.1.1材料与试剂新鲜龙眼（品种：储良，产地：广州，产期：2014年）去皮，去核，80℃热水浸提2h，80%乙醇沉淀，8000rpm离心10min，取沉淀复溶于蒸馏水，采用D301-R大孔树脂进行脱50色素和除蛋白。采用DEAE-FF离子柱对获得的多糖粗提物进行分离，收集3mmol/L氯化钠洗脱下的糖峰。然后采用TSKgel-G4000PW和TSKgel-G3000PW串联柱对获得的粗多糖进一步纯化。分离条件为：流动相为水，柱温60℃，流速为1.0mL/min。收集出峰时间为19.45min的糖峰，浓缩、真空冷冻干燥获得LP3。RAW264.7细胞由中山大学中山医学院鉴定并馈赠。MTT和中性红购自于Sigma-Aldrich55公司。胎牛血清和DMEM培养基购自于Thermo公司（Gibco）。MouseIL-6、MouseTNF-α检测试剂盒购自于R&D公司。DAF-FMDA（NO检测荧光探针）购于上海碧云天生物技术有限公司。1.1.2仪器与设备SpectraMax190全波长酶标仪，MolecularDevices公司；D-35578倒置显微镜，Leica公60司；3K15低温离心机，Sigma公司；SW-CJ-IF超净工作台，苏州净化设备有限公司。1.2方法1.2.1LP3对细胞增殖能力的影响5将RAW264.7细胞密度调整至2×10个/mL，以每孔100µL接种到96孔板内，37℃，5%CO2培养2.0h后，除去未贴壁细胞。继续培养24h后，每孔加入200µL不同浓度的LP365多糖样品，以等量的培养基作为对照组。培养24.0h后，添加20µLMTT（终浓度5.0mg/mL），继续培养4.0h。弃上清液，添加150µLDMSO，震荡10.0min，于490nm检测OD值。细胞增殖结果用如下公式表示：细胞增殖分数（%）=（样品组A490值/空白对照组A490值）×100%1.2.2LP3对细胞吞噬能力的影响70不同浓度的LP3作用细胞24.0h后，吸去培养基，用预温的PBS洗一遍，每孔加入100µL的1.0mg/mL的中性红溶液，继续培养20.0min，吸去培养基，用PBS洗3次，然后加入200µL的细胞裂解液[冰醋酸:无水乙醇=1:1（v:v）]，540nm测定各孔的吸光值。细胞吞噬作用以如下公式表示：细胞吞噬分数（%）=（样品组A540/空白对照组A540）×100%。-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn1.2.3LP3对细胞NO分泌的影响75不同浓度的LP3作用细胞24.0h后，吸去培养基，加入50µL的DAF-FMDA，继续培养30.0min，PBS洗涤细胞3次。在激发波长495nm，发射波长515nm，读取样品荧光强度。NO的分泌值用如下公式表示：细胞NO的分泌值（%）=（样品组荧光强度/空白对照组荧光强度）×100%。1.2.4LP3对细胞TNF-α、IL-6分泌的影响80不同浓度的LP3作用细胞24.0h后，4℃5000转/min离心5.0min，取上清，按照TNF-α和IL-6相应ELISA试剂盒说明书测定细胞TNF-α和IL-6分泌量。1.3数据分析所有实验结果均表示成平均数±标准差。采用数据处理软件SPSS22对结果进行统计分析，各组数据采用方差分析（One-wayANOVA），以p＜0.05记为数据组间存在显著差异。852结果与分析2.1LP3对巨噬细胞增殖能力的影响LP3对巨噬细胞增殖能力的影响如图1所示。结果显示，在12～400μg/mL浓度范围内，LP3能够显著刺激巨噬细胞增殖。在LP3的浓度为400μg/mL时，细胞的增殖分数达到135.90%。以上结果表明，LP3具有促进巨噬细胞增殖的作用。150LP3abb125ccd100(%)7550细胞增殖分数250Control12μg/mL50μg/mL100μg/mL200μg/mL400μg/mL90图1LP3对巨噬细胞增殖的影响Control12μg/mL50μg/mL100μg/mL200μg/mL400μg/mLFigure1EffectofLP3onmacrophageproliferation2.2LP3对巨噬细胞吞噬能力的影响LP3对巨噬细胞吞噬中性红的作用如图2所示。结果显示，在25～400μg/mL范围内，95LP3能显著提高巨噬细胞的吞噬分数，并呈现一定的剂量依赖关系。在LP3的浓度为25μg/mL、50μg/mL、200μg/mL和400μg/mL时，细胞的吞噬分数分别为168.45%、181.17%、186.72%和192.03%。结果表明，LP3具有显著提高巨噬细胞吞噬能力的作用。-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnLP3ab200cbcd(%)e100细胞吞噬分数0ControlLPS25μg/mL50μg/mL200μg/mL400μg/mLControl图2LP3LPS对巨噬细胞吞噬功能的影响25μg/ml50μg/ml200μg/ml400μg/ml100Figure2EffectofLP3onmacrophagephagocytosis2.3LP3对巨噬细胞NO分泌的影响LP3对巨噬细胞NO分泌的影响如图3所示。结果显示，在25～200μg/mL范围内，LP3能够显著刺激细胞NO的分泌。在LP3的浓度为25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL时，巨噬细胞NO的分泌值分别为对照组的2.4、4.0、4.2和5.4倍。结果表明，LP3能够显105著增加巨噬细胞NO的分泌，活化巨噬细胞。700LP3a600500bb(%)400分泌值cc300NO细胞200d1000ControlLPS25μg/mL50μg/mL100μg/mL200g/mL图3LP3对巨噬细胞NO分泌的影响ControlLPS25μg/mL50μg/mL100μg/mL200μg/mLFigure3EffectofLP3onNOproductioninmacrophages2.4LP3对巨噬细胞TNF-α、IL-6分泌的影响110LP3对巨噬细胞TNF-α和IL-6的分泌如图4所示。结果显示，在25～400μg/mL浓度范围内，LP3能够剂量依赖关系的促进巨噬细胞TNF-α和IL-6的分泌。当LP3的浓度为400μg/mL时，巨噬细胞TNF-α和IL-6的分泌量为296.20pg/mL和73.69pg/mL，分别为对照组的17.67倍和18.42倍。以上结果表明，LP3能够增加巨噬细胞TNF-α和IL-6的分泌。综合2.1～2.3的结果显示，LP3具有激活巨噬细胞的作用。115-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnLP3LP3a640400a630620610(pg/mL)600350120a400b100320IL-6(pg/mL)bTNF-240160c50cd80edfee00BlankLPS25µg/mL100µg/mL200µg/mL400µg/mLBlankLPS25µg/mL100µg/mL200µg/mL400µg/mL125图4LP3对巨噬细胞TNF-α和IL-6分泌的影响BlankLPS25礸/mL100礸/mL200礸/mL400礸/mLFigure4EffectofLP3onTNF-αandIL-6secretioninmacrophagesBlankLPS25礸/mL100礸/mL200礸/mL400礸/mL3讨论巨噬细胞吞噬作用对于机体免疫稳态维持具有重要的作用，是特异性免疫反应的基础[14]。巨噬细胞被激活后，通过吞噬外源异物分子和分泌NO等细胞因子，调节机体免疫。130NO作为细胞重要的信号分子和效应分子，参与调节细胞多种生理功能，在细胞免疫系统中[15-16][17]发挥着重要作用。IL-6具有促进B细胞分化和激活T细胞的作用。TNF-α能促进单[18]核细胞活化，提高其外源杀伤，并且TNF-α可以自分泌的方式激活巨噬细胞，调节巨噬[19]细胞功能，诱导炎症反应和其他免疫调节因子的表达。本文的结果显示，LP3可以刺激细胞增殖、增强其吞噬功能、提高细胞NO、TNF-α和IL-6的分泌。这些结果表明，LP3具有135激活巨噬细胞，调节巨噬细胞的活性作用。[20]Yi等的研究发现，几种龙眼多糖（LPI-IV）能够不同程度的增强小鼠腹腔巨噬细胞[13]的吞噬功能。Meng等报道，一种主结构为→4)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-GalpA-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-β-D-Glcp-(1→的龙眼多糖（LP1）在体外能够显著增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力，在25μg/mL～100μg/mL范围内，LP1具有增加细胞NO和TNF-α、IL-6、IL-1β分泌140的作用。虽然上述报道的龙眼多糖与本文LP3的结构和活性作用浓度之间存在差异，但是其对巨噬细胞的活化作用与本文的报道相一致。综合其他龙眼多糖的报道显示，不同结构的龙眼多糖，其免疫调节活性存在较大差异，这些活性差异可能与多糖的结构及多糖与细胞的作用方式有关。不同结构龙眼多糖的免疫调节活性差异还有待进一步研究。4结论145龙眼多糖LP3能够促进巨噬细胞增殖，提高其吞噬能力，增加细胞NO、TNF-α和IL-6分泌，活化巨噬细胞。-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn150[参考文献](References)[1]XIAJH,JINML,MORRISGA,etal.Advancesonbioactivepolysaccharidesfrommedicalplants[J].CriticalReviewinFoodScienceandNutrition,2016,56(sup1):s60-s80.[2]LIQM,WANGJF,ZHAXQ,etal.Structuralcharacterizationandimmunomodulatoryactivityofanewpolysaccharidefromjellyfish[J].CarbohydratePolymers,2017,159:188-194.155[3]MIAOS,MAOX,PEIR,etal.AntitumoractivityofpolysaccharidesfromLepistasordidaagainstlaryngocarcinomainvitroandinvivo[J].InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,2013,60:235-240.[4]PUX,MAX,LIUL,etal.Structurecharacterizationandantioxidantactivityinvitroofpolysaccharidesfromangelicaandastragalus[J].CarbohydratePolymers,2016,137:156-164.[5]WANGPC,ZHAOS,YANGBY,etal.Antidiabeticpolysaccharidesfromnaturalsources:areview[J].160CarbohydratePolymers,2016,148:86-97.[6]YANGH,WUY,GANC,etal.CharacterizationandantioxidantactivityofanovelpolysaccharidefromPholidotaLindl[J].CarbohydratePolymers,2016,138:327-334.[7]WANGH,ZHANGX,LIY,etal.AntitumoractivityofapolysaccharidefromlonganseedonlungcancercelllineA549invitroandinvivo[J].TumorBiology,2014,35(7):7259-7266.165[8]JIANGG,WENL,CHENF,etal.Structuralcharacteristicsandantioxidantactivitiesofpolysaccharidesfromlonganseed[J].CarbohydratePolymers,2013,92(1):758-764.[9]ZHUQ,JIANGY,LINS,etal.Structrualidentificationof(1→6)-α-D-glucan,akeyresposibleforthehealthbenefitsoflonganandevaluationofanticanceractivity[J].Biomacromolecules,2013,146(6):1999-2003.[10]ZHONGK,WANGQ,HEY,etal.Evaluationofradicalsscavenging,immunitymodulatoryandantitumor170activitiesoflonganpolysaccharideswithultrasoniconinS180tumormicemodels[J].InternationalJouranlofBologicalMacromolecules,2010,47(3):356-360.[11]JIANGJ,MENGFY,HEZ,etal.Sulfatedmodificationoflonganpolysaccharideanditsimmunomodulatoryandantitumoractivityinvitro[J].InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,2014,67:323-329.[12]CHENJ,CHENX,QIN,J.EffectsofpolysaccharidesoftheEuphoriaLongan(Lour)steudonfocalcerebral175ischemia/reperfusioninjuryanditsunderlyingmechanism[J].BrainInjury,2011,25(3):292-299.[13]MENGFY,NINGYL,QIJ,etal.StructureandantitumorandimmunomodulatoryactivitiesofawatersolublepolysaccharidefromDimocarpuslonganpulp[J].InternationalJournalofMolecularScience,2014,15(3):5140-5142.[14]SUNW,HUW,MENGK,etal.Activationofmacrophagesbytheophiopogonpolysacchariesliposome180fromtheroottuberofOphiopogonjaponicus[J].InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,2016,91:918-925.[15]WANGW,ZOUY,LIQ,etal.ImmunomodulatoryeffectsofapolysaccharidesfromLepidiummeyeniiWap.onmacrophages[J].ProcessBiochemistry,2016,51(4):542-553.[16]LIUW,WANGH,YUJ,etal.Structure,chainconformation,andimmunomodulatoryactivityofthe185polysaccharidepurifiedfromBacillusCalmetteGuerinformation[J].CarbohydratePolymers,2016,150:149-158.[17]WEIW,XIAOHT,BAOWR,etal.TLR4maymediatesignalingpathwayofAstragaluspolysaccharideRAPinducedcytokineexpressionofRAW264.7cells[J].JournalofEthnopharmacologe,2016,179:243-252.[18]翟钦辉，荣岳光，董晓芳，等.苜草素对巨噬细胞活性和NO、IL-6、TNF-α分泌的影响[J].营养学报，1902012，34（2）：181-185.[19]LIJ,QIANW,XUY,etal.ActivationofRAW264.7cellsbyapolysaccharideisolatedfromAntarticbacteriumPseudoaltermonassp.S-5[J].CarbohydratePolymers,2015,130:97-103.[20]YIY,ZHANGMW,LIAOST,etal.Structuralfeaturesandimmunomodulatoryactivitesofpolysaccharidesoflonganpulp[J].CarbohydratePolymers,2012,636-643.-6-'