作为Rho激酶抑制剂的六氢氮杂卓氧基苯甲酰胺类化合物的合成.pdf 8页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn作为Rho激酶抑制剂的六氢氮杂卓氧基苯#甲酰胺类化合物的合成**陈云芮，隋佳宏，周立宏5（成都理工大学材料与化学化工学院）摘要：我们开发了如式I所示的六氢氮杂卓氧基苯甲酰胺类化合物和/或它们的可药用盐及其制备方法，它具有良好的Rho激酶抑制活性，可作为潜在的Rho激酶的抑制剂。关键词：有机化学；Rho激酶；六氢氮杂卓；苯甲酰胺10SynthesisofHexahydroazepine-oxyBenzamideCompoundsasRhoKinaseInhibitorsChenYunrui,SuiJiahong,ZhouLihong(CollegeofMaterialsandChemistry&ChemicalEngineering,ChengduUniversityofTechnology)15Abstract:AsshowninformulaI,wehavedevelopedaseriesofhexahydroazepine-oxybenzamidecompoundsand/orpharmaceuticallyacceptablesaltsthereofandapreparationmethodthereof,whichhavegoodRhokinaseinhibitoryactivity,andcanbeusedaspotentialinhibitorsofRhokinase.Keywords:organicchemistry;rhokinase;hexahydroazepine;benzamide200引言Uehata等人在Nature(1997,389,990-994)中首次报道了小GTPaseRhoA经激动剂刺激而活化，导致RhoA从无活性的GDP-结合形式转化为活性的GTP-结合形式，随后结合并活化[1]Rho激酶。已知两种同工型Rho激酶1和Rho激酶2。Rho激酶2在血管平滑肌细胞和内25皮细胞中表达。Rho激酶2经活性GTP-结合的RhoA活化，导致平滑肌细胞通过磷酸化介[2]导的肌球蛋白轻链磷酸酶活性的抑制以及由此上调肌球蛋白调节轻链的活性而钙敏感化。已知Rho-激酶牵涉于血管收缩，包括肌性紧张和平滑肌过度收缩的发生、支气管平滑肌收缩、哮喘和慢性阻塞性肺病、高血压、肺动脉高压和眼高压和眼内压调、内皮功能障碍、[3]心绞痛、肾病，包括高血压诱导的、非高血压诱导的和糖尿病性肾病、肾衰竭和周围动脉30闭塞疾病(PAOD)，心肌梗死、心脏肥大和衰竭、冠心病、动脉粥样硬化、再狭窄、骨质疏[4]松、内分泌功能障碍，例如醛固酮增多症、中枢神经系统障碍如神经元变性和脊髓损伤、脑缺血、脑血管痉挛、疼痛，例如神经性疼痛、癌症发生和进展，其中Rho激酶抑制已经显示抑制肿瘤细胞生长和转移的瘤形成、血管生成、血管平滑肌细胞增殖和运动、内皮细胞增殖、内皮细胞收缩和运动、SynthesisofHexahydroazepine-oxyBenzamideCompoundsasRho35KinaseInhibitors应力纤维形成、血栓形成性病症和白细胞聚集和骨吸收。Na/H交换转运系统活化、阿尔茨海默病、内吸蛋白活化以及SREB(甾醇应答结合元件)信号传导及其对脂质[5]代谢的作用。因此，对Rho-激酶和/或Rho-激酶介导的肌球蛋白轻链磷酸酶磷酸化具有抑制效果的化合物可用于治疗和/或预防涉及Rho-激酶作为主要或次级病因的心血管和非心血基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（20135122120002）作者简介：陈云芮（1996年-），女，2015级化学专业本科生通信联系人：周立宏（1979-），女，副教授，主要研究方向：有机合成化学和药物化学.E-mail:zhoulihong2012@cdut.cn-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn管疾病。140我们课题组研发了一种六氢氮杂卓氧基苯甲酰胺类化合物（通式如式I所示，式中R为2芳基乙炔基，或卤素取代或无取代的芳基甲基；R为(C1-C3)烷基-N[(C1-C2)烷基]2、(C1-C3)烷基-O-(C1-C3)烷基或氢、或(C1-C3)烷基-(C3-C6)氮杂环烷基）及其生理上可接受的盐，经初步筛选，获得了较好的生物活性，有望在治疗和/或预防涉及Rho-激酶作为主要或次级病因的心血管和非心血管疾病如高血压、肺动脉高压、高眼压症、视网膜病和青光眼、外周循45环障碍、周围动脉闭塞疾病(PAOD)、冠心病、心绞痛等疾病中发挥作用。R1ONR2ONHO1实验部分501.1药品、仪器和设备邻苯二甲酰亚胺钾、4-溴-1-丁烯、N,N-二甲基甲酰胺、碘化钾、甲基叔丁基醚、无水碳酸钾、水合肼、乙醇、浓盐酸、氢氧化钾、三乙胺、四氢呋喃、2-氯乙酰氯、石油醚、乙酸乙酯、食盐、无水硫酸钠、、丙酮、二氯甲烷、三氟化硼一水合物、三乙基硼烷、甲醇、碳酸钾、咪唑、N,N-二甲基吡啶-4-胺、叔丁基二甲基氯硅烷、钠氢、四丁基氟化铵、甲磺酸55酐、N-(3-(二乙基氨基)丙基)-4-羟基苯甲酰胺；活性的人重组ROCKII、荧光素-AKRRRLSSLRA-COOH；腺苷-5′-三磷酸酯(ATP)、牛血清白蛋白(BSA)、二甲亚砜(DMSO)、4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-乙磺酸(Hepes)、Brij-35、二硫苏糖醇(DTT)三(羟基甲基)-氨基甲烷(Tris)、氯化镁、NaOH、1MHCl、EDTA。主要仪器和设备分别列入表1中。60表1主要仪器和设备Tab.1Primaryinstrumentandapparatus仪器生产厂家型号磁力搅拌器巩义市予华仪器有限责任公司85-II强力机械搅拌器上海天由仪器科技有限公司QHJ756B旋转蒸发仪10L上海精密仪器仪表有限公司BC-R1001低温冷却循环泵郑州长城科工贸有限公司DLSB-50/40郑州英峪领科仪器设备有限公油浴锅ZKSY-2L司真空干燥箱常州市日宏干燥设备有限公司YZG-600德国葛莱娜第一生化有限公司微量滴定板384GreinerBio-One恒温恒湿箱上海建恒仪器有限公司SDH01-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn微量移液器上海佳安分析仪器厂WKYIII-0.1微量移液器上海佳安分析仪器厂WKYIII-0.11.1实验方法1.2.1产品的制备第一步：N-(3-丁烯基)邻苯二甲酰亚胺ONKOOBrN65O将邻苯二甲酰亚胺钾（407.0g，2.2mol）加入4-溴-1-丁烯（270.0g，2.0mol）的N,N-二甲基甲酰胺（1200mL）溶液中，再加入碘化钾(3.32g，20.0mmol)。油浴加热到130℃，反应大约3小时，TLC监控（石油醚：乙酸乙酯=1:1）直至反应完全。加入3000g冰水混合物淬灭反应，甲基叔丁基醚萃取（1000mL*3），合并有机相，水洗（1000mL*3）。有机70相经无水碳酸钾干燥，过滤，减压蒸除溶剂。第二步：3-丁烯-1-胺ONH2NH2·H2ONNH2O将水合肼（20.0g，0.40mol）加入上步产物（40.2g，0.20mol）的乙醇（200mL）溶液中。反应液加热至回流反应约1.5小时，冷却，滴加40mL浓盐酸，搅拌10min之后过75滤。滤液用5M氢氧化钾水溶液调pH值至7-8，过滤，滤液用甲基叔丁基醚萃取（100mL*4），合并有机相，无水碳酸钾干燥，过滤，减压蒸除溶剂。第三步：N-(3-丁烯-1-基)-2-氯乙酰胺OClOClClNH2NH将三乙胺（30.4g，0.30mol）加入上步产物（10.7g，0.15mol）的四氢呋喃（100mL）80溶液中。冰水浴降温，滴加2-氯乙酰氯（20.3g，0.18mol）。滴完后，撤去冰水浴，室温下反应约3小时，TLC监控（石油醚：乙酸乙酯=1:1）直至反应完全。加入200mL乙酸乙酯，再用饱和食盐水洗涤（100mL*3）。有机相经无水硫酸钠干燥后，过滤，减压蒸除溶剂，剩余混合物经硅胶柱层析纯化（洗脱液为石油醚:乙酸乙酯=20:1）。第四步：N-(3-丁烯-1-基)-2-碘乙酰胺OOKIClINN85HH将碘化钾（49.8g，0.30mol）加入上步产物（14.8g，0.10mol）的丙酮（200mL）溶-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn液中。室温下反应过夜，TLC监控（石油醚：乙酸乙酯=1:1）直至反应完全。减压蒸除溶剂，剩余混合物中加300mL水，用二氯甲烷萃取（500mL*3）。合并有机相，经无水硫酸钠干燥后，过滤，减压蒸除溶剂，剩余混合物经硅胶柱层析纯化（洗脱液为石油醚:乙酸乙酯=5:1）。90第五步：5-羟基氮杂卓-2-酮1)BF3·H2O,BEt3O2)1MHClHNI3)K2CO3ONHOH在上步产物（23.9g，0.10mol）的二氯甲烷（80mL）溶液中，先后加入三氟化硼一水合物（38.6g，0.45mol）和三乙基硼烷（6.9g，0.07mol）。室温下反应过夜。吸除上层透明液体，余下部分减压蒸除溶剂。向剩余混合物中滴加60mL1M的盐酸水溶液，滴毕，油95浴加热至100℃后继续反应4小时。减压蒸除有机溶剂后，向剩余混合物中加入100mL甲醇，然后分批加入碳酸钾（55.3g，0.40mol），室温下搅拌反应10小时。过滤，减压蒸除溶剂，剩余混合物经硅胶柱层析纯化（洗脱液为二氯甲烷:甲醇=4:1）。第六步：5-((叔丁基二甲基硅基)氧基)氮杂卓-2-酮HNHNTBSClOOOHOTBS100在上步产物（12.9g，0.10mol）的N,N-二甲基甲酰胺（100mL）溶液中，先后加入咪唑（10.2g，0.15mol）、N,N-二甲基吡啶-4-胺（2.5g，0.02mol）和叔丁基二甲基氯硅烷（18.1g，0.12mol）。室温下反应过夜，TLC监控（石油醚：乙酸乙酯=1:1）直至反应完全。加入300g冰水混合物，用二氯甲烷萃取（500mL*3）。合并有机相，经无水硫酸钠干燥后，过滤，减压蒸除溶剂，剩余混合物经硅胶柱层析纯化（洗脱液为石油醚:乙酸乙酯=1:1）。105第七步：5-(叔丁基二甲基硅基)氧基-1-(2-苯基乙炔基)氮杂卓-2-酮BrHNONOTBSOOTBS冰水浴下，将钠氢（60%矿物油粉末，14.4g，0.36mol）分批加入上步产物（29.2g，0.12mol）的四氢呋喃（200mL）溶液中。搅拌反应5分钟后，撤去冰水浴，室温下继续反应30分钟，加入苯乙炔基溴（23.5g，0.13mol）。室温下反应过夜，TLC监控（石油醚：110乙酸乙酯=1:1）直至反应完全。减压蒸除溶剂，加入100mL饱和食盐水，用乙酸乙酯萃取（200mL*3）。合并有机相，经无水硫酸钠干燥后，过滤，减压蒸除溶剂。第八步：5-羟基-1-(2-苯基乙炔基)氮杂卓-2-酮TBAFNNOOOTBSOH-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn将四丁基氟化铵（英文缩写为TBAF，86.3g，0.33mol）加入上步产物（HPLC70.4%，11540.0g，0.082mol）的无水四氢呋喃（500mL）溶液中。室温下反应10小时，TLC监控（石油醚：乙酸乙酯=1:1）直至反应完全。减压蒸除溶剂，加入500mL乙酸乙酯，用饱和食盐水洗涤（200mL*3）。合并有机相，经无水硫酸钠干燥后，过滤，减压蒸除溶剂。第九步：7-氧代-1-(2-苯基乙炔基)氮杂卓-4-基甲磺酸酯Ms2ONNOOOHOMs120在上步产物（HPLC40.0%，30.0g，0.052mol）的二氯甲烷（200mL）溶液中，加入三乙胺（15.2g，0.15mol）。冰水浴降温，滴加甲磺酸酐（17.4g，0.10mol）。滴毕，撤去冰水浴，室温下反应过夜，TLC监控（石油醚：乙酸乙酯=1:1）直至反应完全。用水洗涤（100mL*2）。有机相经无水硫酸钠干燥后，过滤，减压蒸除溶剂，剩余混合物经硅胶柱层析纯化（洗脱液为石油醚:乙酸乙酯=2:1）。125第十步：N-(3-(二乙基氨基)丙基)-4-(7-氧代-1-(2-苯基乙炔基)氮杂卓-4-基氧基)苯甲酰胺ONNHHOONNOONNHOMsO在上步产物（15.4g，0.05mol）的N,N-二甲基甲酰胺（100mL）溶液中，依次加入N-(3-(二乙基氨基)丙基)-4-羟基苯甲酰胺（12.5g，0.05mol）和无水碳酸钾（20.7g，0.15mol）。油浴加热至90℃反应过夜，TLC监控（石油醚：乙酸乙酯=1:1）直至反应完全。加入300mL130水，用乙酸乙酯萃取（300mL*3），有机相再用饱和食盐水洗涤（200mL*3）。有机相经无水硫酸钠干燥后，过滤，减压蒸除溶剂，剩余混合物经硅胶柱层析纯化（洗脱液为二氯甲烷:甲醇=10:1）。其他化合物也按照同样的方法制备。1.2.2活性测定135为测定所开发的六氢氮杂卓氧基苯甲酰胺类化合物的Rho激酶抑制活性，我们参照其他Rho激酶抑制剂的活性测定方法，测定了IC50值。测定用试剂：活性的人重组ROCKII(N-末端His6-标记的重组人ROCK-II残基11-552)、荧光素-AKRRRLSSLRA-COOH（作为肽底物），购自JPTPeptideTechnologies（德国）；腺苷-5′-三磷酸酯(ATP)、牛血清白蛋白(BSA)、二甲亚砜(DMSO)、4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-乙磺140酸(Hepes)、Brij-35、二硫苏糖醇(DTT)三(羟基甲基)-氨基甲烷(Tris)、氯化镁、NaOH、1MHCl以及EDTA购自Sigma-Aldrich（中国北京分公司）。测定过程：用1号缓冲液(25mMTris-HCl，pH7.4，5mMMgCl2，2mMDTT，0.02％(w/v)BSA和3％DMSO)将待测六氢氮杂卓氧基苯甲酰胺化合物稀释至适当的浓度。用2号缓冲液-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn(25mMTris-HCl，pH7.4，5mMMgCl2，2mMDTT和0.02％(w/v)BSA)将ROCKII酶稀释145至100ng/ml的浓度。将肽底物和ATP用2号缓冲液分别稀释至5μM和120μM的浓度。将4μl的待测化合物溶液和4μl稀释的酶于384孔微量滴定板(Greiner，Bio-One，Frickenhausen，德国)中混合，加入4μl含有肽底物和ATP的溶液启动激酶反应。在32℃恒温箱中培育一小时后，加入40μl含100mMHepes-NaOH，pH7.4，0.015％(v/v)Brij-35，45mMEDTA和0.227％芯片涂层剂1(CaliperLifescienceInc，Hopkinton，MA)的溶液来终止反应。随后按照150Pommereau等人所述（参见J.Biomol.Screening9(5)，409-416，2004)在Caliper3000仪器上检测底物肽的磷酸化。分离条件为：压力-1.3psi，上游电压-1562V，下游电压-500V，取样时间200ms。阳性对照试验(代替化合物的1号缓冲液)与阴性对照试验(代替化合物的1号缓冲液以及代替ROCKII的2号缓冲液)在各自的板上平行进行。2结果与讨论1552.1产品制备过程的实验数据(表2)表2实验数据Tab.2Experimentaldata第一步：N-(3-丁烯基)邻苯二甲酰亚胺得400.0g白色固体，即为N-(3-丁烯基)邻苯二甲酰亚胺，HPLC纯度98.4%（254nm），+质谱202.1(M+H)。第二步：3-丁烯-1-胺得11.5g白色固体，即为3-丁烯-1-胺，收+率81%。质谱72.1(M+H)。第三步：N-(3-丁烯-1-基)-2-氯乙酰胺得14.4g橙色油状物，即为N-(3-丁烯-1-基)-2-氯乙酰胺，收率65%。质谱148.0+(M+H)。第四步：N-(3-丁烯-1-基)-2-碘乙酰胺得22.7g淡黄色油状物，即为N-(3-丁烯-1-基)-2-碘乙酰胺，收率95%。质谱240.0+(M+H)。第五步：5-羟基氮杂卓-2-酮得7.7g褐色油状物，即为5-羟基氮杂卓-2-+酮，收率60%。质谱130.1(M+H)。第六步：5-((叔丁基二甲基硅基)氧基)氮杂卓-2-得13.4g白色固体，即为5-((叔丁基二甲基酮硅基)氧基)氮杂卓-2-酮，收率55%。质谱+244.2(M+H)。第七步：5-(叔丁基二甲基硅基)氧基-1-(2-苯基乙得48.0g褐色油状物，即为5-(叔丁基炔基)氮杂卓-2-酮二甲基硅基)氧基-1-(2-苯基乙炔基)氮杂卓-2-酮粗品，HPLC纯度70.4%（254nm）。第八步：5-羟基-1-(2-苯基乙炔基)氮杂卓-2-酮得39.0g淡棕色油状物，即为5-羟基-1-(2-苯基乙炔基)氮杂卓-2-酮粗品，HPLC纯度40.0%（254nm）。-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn第九步：7-氧代-1-(2-苯基乙炔基)氮杂卓-4-基甲得13.9g淡黄色固体，即为7-氧代-1-(2-苯磺酸酯基乙炔基)氮杂卓-4-基甲磺酸酯，收率87%。+质谱308.1(M+H)。第十步：N-(3-(二乙基氨基)丙基)-4-(7-氧代-1-(2-得10.8g淡黄色泡沫状固体，即为N-(3-(二苯基乙炔基)氮杂卓-4-基氧基)苯甲酰胺乙基氨基)丙基)-4-(7-氧代-1-(2-苯基乙炔基)氮杂卓-4-基氧基)苯甲酰胺，收率47%。+质谱462.3(M+H)。2.2活性测定的检测结果：几个有代表性的化合物利用上述方法进行活性测定的检测结果（IC50值）如表3所示。160表3活性检测数据Tab.3Activitydetectiondata化合物编号pIC5010++++27++36+++45+++52+++62++++85+++121++131+++140+++备注：给出的活性表示为IC50的以10为底的负对数(pIC50)，其中+：pIC50＜3.0；++：3.0≤pIC50＜4.0；165+++：4.0≤pIC50＜5.0；++++：5.0≤pIC50＜6.0；+++++：6.0≤pIC50。2.3讨论这一系列六氢氮杂卓氧基苯甲酰胺类化合物制备目前工艺稳定，操作简便，没有苛刻的170反应条件，只是由于步骤较长，部分试剂较贵，合成成本较高。按照标准方法对代表性化合物的IC50值进行检测，从结果看，我们所研发化合物的pIC50值或高或低，都有一定的活性，少数化合物具有较高的Rho激酶的抑制活性，可作为潜在的Rho激酶的抑制剂。当然，所筛选化合物距离成为真正的药物还有一定差距，今后我们课题组还会继续对这类化合物进行结构优化，以期进一步提高其活性，使之成为真正的药物。175致谢感谢高等学校博士学科点专项科研基金（20135122120002）的资助。-7- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn[参考文献](References)[1]UehataM1,IshizakiT,SatohH,OnoT,KawaharaT,MorishitaT,TamakawaH,YamagamiK,InuiJ,180MaekawaM,NarumiyaS.CalciumsensitizationofsmoothmusclemediatedbyaRho-associatedproteinkinaseinhypertension[J].Nature.1997,389:990-994.[2]MatsuiT.,AmanoM.,YamamotoT.,ChiharaK.,NakafukuM.,ItoM.,NakanoT.,OkawaK.,IwamatsuA.,KaibuchiK.Rho-associatedkinase,anovelserine/threoninekinase,asaputativetargetforthesmallGTPbindingproteinRho[J].EmboJournal1996,15(9):2208-2216.185[3]MatsuiT.,AmanoM.,YamamotoT.,ChiharaK.,NakafukuM.,ItoM.,NakanoT.,OkawaK.,IwamatsuA.,KaibuchiK.Rocks:multifunctionalkinasesincellbehaviour[J].NatRevMolCellBiol.2003,4(6):446-56.[4]WibberleyA1,ChenZ,HuE,HiebleJP,WestfallTD.ExpressionandfunctionalroleofRho-kinaseinraturinarybladdersmoothmuscle[J].BrJPharmacol.2003,138(5):757-66.[5]BobakD,MoormanJ,GuanzonA,GilmerL,andHahnC.InactivationofthesmallGTPaseRhodisrupts190cellularattachmentandinducesadhesion-dependentandadhesion-independentapoptosis[J].Oncogene1997,15:2179-2189.-8-'