叶酸偶联的荧光聚合物纳米探针的制备及细胞成像.pdf 6页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn叶酸偶联的荧光聚合物纳米探针的制备及#细胞成像*熊丽琴，操凤文5（上海交通大学生物医学工程学院）摘要：研究目的研究叶酸偶联的PFBT荧光聚合物纳米探针对U87细胞、H1299细胞及SKOV3细胞的细胞靶向效果。方法采用纳米共沉淀法制备PFBT聚合物纳米探针，采用EDC偶联试剂制备叶酸修饰的聚合物纳米探针，用共聚焦显微镜观察纳米探针在U87细10胞、H1299细胞及SKOV3细胞中的成像效果。结果PFBT聚合物纳米探针与U87细胞、H1299细胞及SKOV3细胞共孵育12h后，在细胞内仅检测到微弱的探针的荧光；而偶联叶酸后在相同条件下使细胞内的探针的荧光强度增加。结论叶酸偶联的PFBT聚合物纳米探针对U87细胞、H1299细胞及SKOV3细胞具有一定的靶向效果。关键词：纳米探针；荧光共轭聚合物；叶酸偶联；细胞成像15中图分类号：Preparationandcellimagingoffolate-conjugatedfluorescentpolymerdotsXIONGLiqin,CAOFengwen20(SchoolofBiomedicalEngineering,ShanghaiJiaoTongUniversity)Abstract:Inthispaper,PFBTpolymerdotswassynthesizedbynanoprecipitationmethod,andfolatewasfurtherconjugatedonthesurfaceofpolymerdotsbyEDCcouplingreaction.Todemonstratethatfolate-conjugatedPFBTpolymerdotscanactasatargetligandforthefolatereceptor,thebindingandsubcellularlocalizationofpolymerdotswereexaminedinthreecelllines,U87MG,H1299andSKOV3,25respectively.ConfocalmicroscopeimagesshowedthatFA-PFBTpolymerdotsexhibitedenhancedfluorescenceinthecells,andthesignalsweredistributedmainlyinthecellmembraneandcytoplasm.Incomparison,PFBTpolymerdotswithoutfolicacidmodificationshowedmuchlessfluorescenceinthecells,indicatingthetargeted-imagingoftheFA-PFBTpolymerdotsforthefolatereceptor.Keywords:nanoprboe;fluorescentconjugartedpolymer;folateconjugation;cellimaging300引言近年来，荧光成像技术由于具有高的灵敏性、经济性及易操作性而被广泛地应用于生物研究中，如疾病诊断和治疗。到目前为止，不同的荧光材料，如荧光蛋白、小分子有机染料35及半导体量子点等已经被广泛地涉及到了细胞成像和标记领域中。然而，由于荧光蛋白和有机染料具有比较低的光淬灭阈值，因此极大地限制了它们在长期成像中的应用。尽管硅或高分子涂层技术已经改善了量子点的胶体稳定性，但是量子点固有的重金属毒性会对生物体系造成极大的伤害。荧光共轭聚合物纳米探针是近年来发展的另一类新型荧光纳米探针[1-4]。这类水相制备的共轭聚合物纳米探针结合了传统共轭聚合物的优异光电性能和聚电解质水基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（20130073120098）作者简介：熊丽琴（1982年出生），女，特别研究员，博导，主要研究方向：智能纳米探针与肿瘤分子影像学.E-mail:xiongliqin@sjtu.edu.cn-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn40溶性的特点，为生物成像提供了新的发展领域。与无机纳米探针相比，共轭聚合物纳米探针不含有任何有毒的重金属组分，其毒性较低。此外，该类探针具有结构多样性、功能可设计性、生物相容性好等显著优势，在生物成像方面逐渐成为热点研究领域。本研究以荧光共轭聚合物PFBT为核心，通过纳米共沉淀法及EDC偶联制备叶酸修饰的共轭聚合物纳米探针，并通过共聚焦显微镜探究了纳米探针在U87细胞、H1299细胞及45SKOV3细胞内的成像效果。1实验1.1共沉淀法合成PFBT聚合物纳米探针取250uLPFBT（1mg/mL）加入到1.5mLTHF中，再加入250uLPS-PEG-COOH（1mg/mL），超声3min，充分混合均匀（上述所用溶液均用THF配制）。在超声条件下，50将上述混合液快速倒入10mL水中，超声5min，再在30℃下，通入N2约60min除尽溶液中的THF即可。将上述纳米探针溶液用50K的超虑管以4000rpm/min离心浓缩，配制成特定浓度的纳米探针溶液。1.2EDC偶联合成叶酸修饰的聚合物（FA-PFBT）纳米探针称取2mgFA-NH2，加入1mL乙醇，超声5min，使其完全溶解，得到2mg/mL的55FA-NH2溶液。首先在玻璃瓶中加入3mL已制备的PFBT聚合物荧光纳米探针（50µg/mL）溶液，后称取5mgEDC固体，加入1mLPFBT聚合物荧光纳米探针溶液，使EDC溶解，后将其快速加入到上述3mLPFBT聚合物荧光纳米探针溶液中，再加入50µL2mg/mL的FA-NH2溶液，慢速（150rpm/min）搅拌30min。搅拌结束后，将上述偶联了FA-NH2的PFBT聚合物荧光纳米探针溶液加入到100K的超虑管中，以4500rpm/min离心2-3分钟，后收60集滤液，量取滤液体积，测量滤液的紫外吸收波长；再在超滤管中加超纯水，以同样转速离心2-3分钟，收集滤液，如此反复几次，直至最后一次滤液中没有检测到FA-NH2，说明材料已纯化完全。1.3FA-NH2偶联效率的计算将2mg/mL的FA-NH2溶液分别加水稀释配制成0，2.5，5，12.5，20以及25µg/mL的65溶液，测量溶液的紫外吸收光谱，记录样品在280nm处对应的紫外吸收强度A，以样品的浓度为横坐标，对应的A值为纵坐标，作图，得到FA-NH2溶液的标准曲线。对于FA-NH2偶联的PFBT聚合物荧光纳米探针溶液，测量每一次纯化后滤液的体积以及滤液在280nm处的紫外吸收强度，通过标准曲线，可计算出滤液的浓度，从而计算出滤液中所含FA-NH2的量，由此可计算出偶联的量。偶联效率的计算公式为：（FA-NH2的总量-滤液中FA-NH270的量）/FA-NH2的总量。1.4荧光量子产率的计算由于罗丹明6G的激发和发射波长与PFBT比较接近，故选取罗丹明6G作为标准物，配制罗丹明6G的乙醇溶液，测量其在190-800nm范围内的紫外吸收光谱，调整溶液的浓度，使其在488nm处的紫外吸收强度值小于0.05，后用488nm激发该溶液，测量它在500-700nm75波段内的荧光发射光谱。将裸露在水中的无PS-PEG-COOH包裹的PFBT溶液，PS-PEG-COOH包裹形成的PFBT-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn聚合物荧光纳米探针溶液以及叶酸功能化的PFBT聚合物荧光纳米探针溶液分别稀释，使其在488nm处的紫外吸收强度值小于0.05，测量样品的紫外吸收光谱以及488nm激发下的500-700nm波段内的荧光发射光谱，所用样品均无NIR775掺杂。已知罗丹明6G的乙醇溶2280液在488nm激发下的荧光量子产率为0.94，根据公式QYS=QYR.ISARnS/(IRASnR)来计算样品的荧光量子产率，式中下标S和R分别代表待测样品和标准物质，A为激发波长488nm处的紫外吸收强度，I代表500-700nm波段内的荧光积分强度（面积），n为溶液的折射率。已知水的折射率为1.33，乙醇的折射率为1.36。1.5细胞培养85分别在DMEM高糖型培养基，1640培养基及MyCco"S5A培养基中各加入1%青霉-链霉素和10%胎牛血清（FBS），配制成培养液，混合均匀，分装使用。采用上述配制好的DMEM高糖型培养液培养人的肺癌H1299细胞，人神经胶质瘤U87细胞采用MyCco"S5A培养液培养人卵巢癌SKOV3细胞（转mcherry基因）。将细胞放置在37℃，含5%CO2，具有一定湿度的培养箱中培养，待细胞长满时即可进行实验。901.6细胞成像为了探究纳米探针在不同种类细胞中的细胞成像效果，将处于对数生长期的数量相同4的U87细胞，H1299细胞及SKOV3细胞消化后分别接种到共聚焦玻璃皿中（2×10个/皿），细胞贴壁后，移去旧的培养液，加入1mL无叶酸的1640培养液，再分别加入20µg的PFBT聚合物荧光纳米探针和叶酸功能化的PFBT聚合物荧光纳米探针，共孵育12h后，用PBS95清洗细胞两次，去除未被细胞吞噬的纳米颗粒，再在激光共聚焦显微镜下进行细胞成像。对于所有的细胞成像，激光共聚焦显微镜的设置参数均相同。采用458nm激发PFBT，接收通道在520-560nm；此外，对于SKOV3细胞，则同时增加561nm激发器及605nm~615nm的通道以接收转基因表达的荧光。1002讨论PFBT聚合物荧光纳米探针采用共沉淀方法合成（图1），粒径大小在20-50nm，与之前报道的粒径大小范围一致[1]。叶酸偶联不影响其粒径大小，但改变其电位。纯的PFBT聚合物荧光纳米探针溶液的Zeta电位在-30mV左右，偶联FA-NH2后，由于-NH2与-COOH的反应，其Zeta电位上升到11mV。105FA-NH2溶液的紫外吸收光谱如图2（A）所示，其紫外吸收特征峰在284nm和362nm处。配制0，2.5，5，12.5，20以及25µg/mL的FA-NH2溶液，用紫外分光光度计测量其在280nm左右的紫外吸收峰对应的吸光强度，绘制FA-NH2溶液的标准曲线，如图2（B）所2示，得到标准方程Y=0.0374X，其中R=0.9961。根据所得滤液的体积以及滤液在280nm处对应的紫外吸收峰的强度，可计算出滤液中FA-NH2的量为50.91µg，则偶联到PFBT聚合110物荧光纳米探针上的量则为49.09ug，计算可得FA-NH2的偶联效率为49.09/100*100%=49.09%。为了比较不同方法叶酸功能化后的PFBT聚合物荧光纳米探针的发光性能，我们以罗丹明6G为标准物，计算了不同样品的荧光量子产率。纳米颗粒中高分子链的聚集程度通常决定了共轭荧光聚合物的亮度，当高分子链伸展时，聚合物荧光倾向于更亮；而当高分子链-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn115卷曲或自聚时，荧光强度下降。无PS-PEG-COOH包裹的裸露的PFBT在水中形成纳米颗粒后，其荧光量子产率较低，为0.14，这说明在裸露的PFBT纳米探针中，PFBT链发生密集地聚集或堆叠。而采用PS-PEG-COOH进行封装后，疏水的PS链使得PFBT高分子链更加地伸展，使得荧光量子产率上升到0.20。采用FA-NH2偶联纳米探针使其叶功能化后，其荧光量子产率下降至0.12，这可能是由于偶联反应中加入的EDC以及PH的变化所致。120图3为20µg的PFBT聚合物荧光纳米探针以及FA-NH2偶联的PFBT聚合物荧光纳米探针分别与U87细胞，H1299细胞及转mcherry基因的SKOV3细胞在无血清条件下共孵育12h后的细胞成像图片。由图可知，未偶联FA-NH2的PFBT聚合物荧光纳米探针作用于U87细胞，H1299细胞及SKOV3细胞后，在细胞内可检测到比较弱的荧光，其中SKOV3细胞对应的红色信号为mcherry基因表达的信号；偶联FA-NH2后，细胞内的荧光强度增强，信号125存在于U87细胞，H1299细胞及SKOV3细胞的细胞质，这说明FA-NH2偶联的PFBT聚合物荧光纳米探针能够靶向到U87细胞，H1299细胞及SKOV3细胞的细胞质。随后，为了探究细胞在有血清条件对叶酸功能化的纳米探针的吞噬情况，同时为了避免培养液中自带的叶酸对叶酸受体的阻断作用，我们采用有血清无叶酸的1640培养液对细胞进行培养。对20µg的FA-NH2偶联的PFBT聚合物荧光纳米探针在有血清无叶酸条件下分130别与U87细胞，H1299细胞及SKOV3细胞共孵育12h后的细胞成像实验进行了探讨，结果如图4所示，细胞内的荧光信号大大降低，这说明血清有可能对细胞对FA-NH2偶联的PFBT聚合物荧光纳米探针的内吞有阻断作用。SNNnPFBTC8H17C8H17ONSNO(H2C)4mOOHnC8H17C8H17PS-PEG-COOHnOHONHNONHNH2NNHNOOSNNFolate-NH2NH2nC8H17C8H17EDC135图1叶酸偶联的聚合物纳米探针的合成示意图Fig.1ThepreparationofFA-conjugatedpolymerdots-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图2（A）FA-NH2的紫外吸收光谱；（B）FA-NH2的标准曲线140Fig.2(A)TheUVabsorptionspectrumofFA-NH2;(B)TheStandardcurveofFA-NH2图320µgPFBT聚合物荧光纳米探针分别与（A）U87细胞，（C）H1299细胞及（E）SKOV3细胞共孵育14512h后的细胞成像图片；20µg的FA-NH2偶联的PFBT聚合物荧光纳米探针分别与（B）U87细胞，（D）H1299细胞及（F）SKOV3细胞共孵育12h后的细胞成像图片。所有的细胞均采用无血清培养液培养，每张图片中的标尺代表50μmFig.3CLSMimagesofU87(A),H1299(C)andSKOV3cells(E)afterincubatedwith20µg/mLPFBTpolymerdotsfor12h;CLSMimagesofU87(B),H1299(D)andSKOV3cells(F)afterincubatedwith20µg/mLFA-NH2150coupledPFBTpolymerdotsfor12h.AllthecellswereincubatedwithpolymerdotsinFBS-freemedium.Scalebarrepresents50μm-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图420µg的FA-NH2偶联的PFBT聚合物荧光纳米探针分别与（A）U87细胞，（B）H1299细胞及（C）155SKOV3细胞在有血清无叶酸条件下共孵育12h后的细胞成像图片。每张图片中的标尺代表50μmFig.4CLSMimagesofU87(A),H1299(B)andSKOV3cells(C)afterincubatedwith20µg/mLFA-NH2coupledPFBTpolymerdotsinfolate-freemediumwith10%FBSfor12h.Scalebarrepresents50μm3结论160细胞成像数据显示PFBT纳米探针与U87细胞、H1299细胞及SKOV3细胞共孵育12h后，细胞内检测到的荧光较弱，当使用叶酸偶联的PFBT-FA纳米探针，细胞内的荧光强度增加，初步说明PFBT-FA纳米探针对U87细胞，H1299细胞及SKOV3细胞有一定的靶向性。但是叶酸偶联后改变了纳米探针的电位，降低了其发光效率，不利于进一步活体成像应用。165[参考文献](References)[1]L.Q.Xiong,S.Adam,J.H.Rao.Self-luminescingBRET-FRETnear-infrareddotsforinvivolymph-nodemappingandtumourimaging[J].NatureCommunications,2012,3:1193.[2]L.Q.Xiong,F.W.Cao,X.M.Cao,etal.Long-Term-StableNear-InfraredPolymerDotswithUltrasmallSize170andNarrow-BandEmissionforImagingTumorVasculatureinVivo[J].BioconjugateChem.,2015,26(5):817-821.[3]L.Q.Xiong,Y.Guo,Y.Zhang,F.Cao,Highlyluminescentandphotostablenear-infraredfluorescentpolymerdotsforlong-termtumorcelltrackinginvivo[J].J.Mater.Chem.B,2016.4:202-206.[4]Y.Guo,F.Cao,Y.Li,L.Q.Xiong,FacilelysynthesizedpH-responsivefluorescentpolymerdotsentrappingdopedandcoupleddoxorubicinfornucleus-targetedchemotherapy[J],J.Mater.Chem.B,2017,5:2921-2930.175-6-'