漆黄素调节PI3KAktmTOR通路诱导乳腺癌细胞凋亡.pdf 9页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn漆黄素调节PI3K/Akt/mTOR通路诱导乳腺#癌细胞凋亡**孙旭，张甘霖，于明薇，王笑民5（首都医科大学附属北京中医医院，北京，１０００１０）摘要：目的漆黄素可抑制多种肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的凋亡，但是漆黄素对乳腺癌细胞的作用罕见报道，本研究通过体外实验探讨漆黄素对乳腺癌细胞的增殖和凋亡的影响，以及可能的作用机制。方法采用MTT方法检测漆黄素20μM，40μM，80μM对乳腺癌细胞4T1，MCF-7，MDA-MB-231,增殖的影响；采用Ecis方法检测漆黄素对4T1增殖的影响，10应用基于ECIS的电击损伤修复和侵袭方法研究漆黄素对4T1的转移和侵袭的影响；通过AnnexinV-PI双染方法检测漆黄素对4T1凋亡的影响；采用Westen检测4T1细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白表达。结果漆黄素可以抑制MCF-7，MDA-MB-23，4T1细胞的增殖（P<0.05）；ECIS实验显示漆黄素可以抑制4T1的增殖、转移和侵袭；漆黄素干预4T1细胞24h后，流式细胞检测发现中高浓度漆黄素可以诱导4T1的凋亡（P<0.05），15中浓度漆黄素主要诱导细胞的早期凋亡，高浓度的漆黄素主要诱导细胞的晚期凋亡；Western结果显示漆黄素可以降低PI3K、Akt、mTOR和P70的磷酸化。结论漆黄素可以抑制乳腺癌的增殖，诱导乳腺癌细胞的凋亡，作用机制和PI3K/Akt/mTOR信号通路相关。关键词：漆黄素；乳腺癌；凋亡中图分类号：R730.23120FisetininducesapoptosisinbreastcancerassociatedwithmediatedPI3K/Akt/mTORpathwaySUNXu,ZHANGGanlin,YUMingwei,WANGXiaomin(BeijinghospitaloftraditionalChinesemedicine,Capitalmedicaluniversity,Beijing,100010)25Abstract:Severalstudieshavedemonstratedthatthefisetinhaveanti-cancereffectagainstnumerouscancertypes,however,thecrucialanticancereffectoffisetininbreastcancerisstillunclear.Inthisstudy,thecytotoxicandapoptosiseffectsinducedbyfisetininbreastcancerwereextensivelyinvestigated.MethodsMTTwasusedtodetecttheabilityofproliferationeffectinbreastcancercells4T1，MCF-7，MDA-MB-231aftertreatedbyfisetinat20μM，40μM，80μM;ECISwasutilizedtomeasure30proliferation,migrationandinvasion;cellapoptosiswasquantifiedusingAnnexinV-PIdetectionkit;theexpressionofPI3K/Akt/mTORassociatedfactorswereexaminedbyWesternblotting.ResultsFisetincaninhibittheproliferationofbreastcancercells4T1，MCF-7，MDA-MB-231(P<0.05)；proliferation,migrationandinvasionof4T1wasweakenedbyfisetinbasedECISplatform;80μMand40μMcanintroducethe4T1apoptosisatlateandearlystagerespectively(P<0.05);westernof4T1cellandtumor35demonstratedthatthephosphorylationofPI3K,Akt,mTORwasdown-regulated.ConclusionFisetincaninducesapoptosisinbreastcancerassociatedwithmediatedPI3K/Akt/mTORpathway.Keywords:Fisetin,breastcancer,apoptosis0引言40乳腺癌是世界范围内女性最高发的恶性肿瘤，其相关的死亡排在女性肿瘤相关性死亡的第一位[1]。2017年预计美国新发女性乳腺癌252710例，占到女性总新发肿瘤30%[2]。对基金项目：教育部高等学校博士学科点专项科研基金（20131107110014）作者简介：孙旭（１９８９-），男，主要研究方向：中西医结合抗肿瘤通信联系人：王笑民（１９６５-），男，主任医师，博导，主要研究方向：中西医结合抗肿瘤研究.E-mail:wangxiaomin_bhtcm@126.com-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn乳腺癌的预防和治疗一直是肿瘤学关注的热点。青蒿素和紫杉醇的应用使得中药或者天然植物提取物得到了更多的研究关注，研究表明中药或者天然植物提取物在乳腺癌的预防和治疗中发挥重要作用[3,4]。45类黄酮类化合物是植物化学成分中的重要组成成分，作为是一种小分子多酚类复合物和植物的次生代谢产物，其具有抗炎、抗氧化、抗过敏、抗病毒等生物活性，近期的研究更是发现其具有预防和治疗肿瘤的作用[5,6]。自然界的黄酮类物质广泛分布于植物的根茎叶和果实种子内，更为重要的是类黄酮类化合物在蔬菜、水果等多种食源性植物中具有较高含量[7,8]。Frankenfeld等通过对2248名美国人调查发现，类黄酮类化合物摄入量与非霍奇金淋50巴瘤发病风险呈负相关[9]。Zamora-Ros等针对欧洲十个国家(荷兰、法国、意大利、西班牙、德国、希腊、丹麦、挪威、瑞典和英国)521448人的研究结果表明，类黄酮化合物的膳食摄入量与胃癌的发病几率也是负相关[10]。漆黄素（Fisetin）又称非瑟素，是众多类黄酮类化合物的一种，实验表明漆黄素具有抗肿瘤活性[7,11]。Khan等发现漆黄素可以抑制肺癌细胞增殖，降低PI3K和Akt的磷酸化55[12]，Liao等发现漆黄素通过调节ERK1/2，下调MMP-2,uPA,NF-Kb和AP-1抑制肺癌细胞的黏附、转移和侵袭[13]。体内实验表明漆黄素可以抑制肿瘤血管生成，降低微血管密度[14,15]。漆黄素的抗肿瘤活性同时在结直肠癌、前列腺癌、胰腺癌和黑色素瘤等肿瘤中发现[16,17]。其主要参与调节的信号通路为PI3K-Akt，MAPK等[7]。但是，漆黄素对乳腺癌的影响尚未明确，鉴于漆黄素对其他肿瘤的防治作用，本实验主要探索漆黄素对乳腺癌生长60的影响以及可能的分子机制。1材料和方法1.1实验细胞动物和药物试剂4T1小鼠乳腺癌细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，4T1-荧光素酶标记细胞（4T1-luc）由Caliper公司惠赠，人乳腺癌细胞MDA-MB-231，MCF-7，人脐静65脉血管内皮细胞（HUVEC）购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。Balb/c小鼠，雌性，6-8周，18-20g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。漆黄素（Fisetin）（纯度≥98%）购自Sigma公司，溶解于二甲基亚砜（DMSO），配置成浓度为100mM储存液。RPMI-1640（货号11875-095）,DMEM（货号11905-092），胎牛血清（FBS）（货号16000-044），美国Gibco公司；青霉素-链霉素（双抗）溶液（100X）（货号C0222），上海碧云天生物70技术有限公司；PBS（货号SH30028.02），美国Hyclo公司；胰酶（货号GNM25200），杭州吉诺生物医药技术有限公司；二甲基亚砜ne（DMSO）（货号D5879），四甲基偶氮唑蓝色（MTT），（货号M5655），Gelatin（货号G1393）,美国SigmaAldrich公司；AnnexinV-PI细胞凋亡检测试剂盒（货号KGA1014），江苏凯基生物技术股份有限公司；蛋白酶抑制剂cOmplete(货号04963116001)，磷酸化抑制剂phosSTOPEASYpack(货号04906837001)，75原位细胞凋亡检测试剂盒（货号11684817910），美国罗氏公司；组织蛋白提取液（Tissueproteinextractionreagent，T-per）（货号78510），美国ThermoScientific公司；美国RIPA细胞裂解液（货号C1053），4X分离胶缓冲液（货号B1004）,4X浓缩胶缓冲液（货号B1006），10X电转移缓冲液（货号B1003），10X电泳缓冲液（货号B1005）,四甲基乙二胺（TEMED）（货号A1006）,过硫酸铵（AP）（货号A1004），北京普利莱因技术有限公司；30%丙烯80酰胺-甲叉丙烯酰胺（Acr-Bis）（货号161-0158），美国Bio-Rad公司；实时动态无标记细-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn胞行为分析（ECIS）Electrode平衡液Cysteine（货号C14D128），ECISarray8W1E(货号D00811-835),ECISarray8WCP(货号ZC0220-255)，美国AppliedBiopgysics公司；生长因子诱导基质胶（货号35423），美国BD公司；PI3K抗体（货号4263），p-PI3K抗体（货号4228），AKT抗体（货号9272），p-Akt抗体（货号9271），p70S6抗体（货号2708），85p-p70S6抗体（货号9234），Cytochromec抗体（货号4280），AIF抗体（货号4642），p-Mtor抗体(货号5536)，Bcl-xl抗体（货号2764），Bax抗体（货号14796），美国CST公司；Actin抗体（货号E021020-01），北京冠星宇科技有限公司；二抗Dylight800（货号072-07-18-06），Dylight680（072-06-15-06），美国KPL公司。全波长扫描多功能读数仪（酶标仪）MultiskanGo，超低温冰箱HFU586,美国ThermoScientific公司；细胞培养箱90CCL-170B-8，新加坡ESCO公司；高温灭菌器GR85DR，美国Zealway公司；纯水仪Integral3，德国Millipore公司；ECISZθ，美国AppliedBiopgysics公司；FACS流式细胞仪EPICSXL，低温离心机AllegraX30R，美国Beckman公司；荧光显微镜BX53，日本Olympus公司1.2漆黄素对乳腺癌细胞增殖的影响1.2.1漆黄素对乳腺癌细胞增殖的影响-MTT方法95取对数生长期的乳腺癌细胞4T1，MCF-7，MDA-MB-231，消化离心后，使用完全培养4基（基础培养基+10%FBS+1%双抗）重悬，调整细胞浓度为1x10个/ml接种于96孔板，每孔100μl于培养箱中常规培养24h后，药物组加入100μl含有漆黄素的完全培养基（药物终浓度为20μM，40μM，80μM），对照组加入等量的完全培养基，培养一定时间后，加入15μlDMSO继续培养，4h后弃上清，加入120μlDMSO，使用酶标仪测定570nm的吸光度100值（OD）。1.2.2漆黄素对4T1乳腺癌细胞增殖的影响-ECIS方法准备ECISarray8WCP，做电极稳定。加入Cysteine200μl处理40min，吸出Cysteine，加入完全培养基200μl，将array放入ECISstation，选择Muti-Fre模式，开始采集数据，过夜。待曲线稳定，取出array，弃培养基，加入对数生长期的4T1细胞和漆黄素的混合液，5105调整细胞浓度为6x10个，调整漆黄素的终浓度为0μM，20μM，40μM，80μM。记录细胞的阻抗变化曲线（Resistancechang），以细胞生长的阻抗值变化来检测细胞增殖情况。1.3漆黄素对4T1乳腺癌细胞转移的影响-ECIS方法准备ECISarray8W1E，做电极稳定（方法同上）。取对数生长期的乳腺癌细胞4T1，5制备成细胞浓度为2.5x10/ml的细胞悬液，取400μl细胞悬液加入ECISarray的孔里，开110始记录细胞曲线，等到细胞阻抗达到平台期，进行电击损伤（Electronicwound），取出array，更换含有漆黄素的无血清培养基（漆黄素的终浓度为（0μM，4μM，8μM，16μM），将array放入station，记录细胞的阻抗变化曲线（Resistancechang），以细胞生长的阻抗值（Resistance，R）变化来检测细胞转移能力。1.4漆黄素对4T1乳腺癌细胞侵袭的影响-ECIS方法115准备ECISarray8W1E，加入Cysteine200μl处理40min，吸出Cysteine200μl处理40min，吸出Cysteine，加入Gelatin200μl，处理40min，吸出Gelatin，加入200μl完全培养基，过5夜待R值稳定，取出array，弃去培养基，加入2.5x10cells/ml的HUVEC细胞悬浮液400μl，-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn记录细胞生长的R值，等到HUVEC的R值到达平台期，加入漆黄素（药物浓度0μM，10μM，20μM，40μM）处理的细胞50μl，以细胞生长的阻抗值（Resistance，R）变化来检测细胞侵120袭能力。1.5漆黄素对4T1乳腺癌细胞凋亡的影响-AnnexinV-PI双染方法收集经漆黄素（药物浓度0μM，20μM，40μM，80μM）处理24h后的4T1细胞，使用不含EDTA的胰酶消化后，离心，用PBS洗涤细胞2次（用手指弹散细胞，使用移液器轻柔吹打混匀），离心后弃上清，加入500μl的loadingbuffer，重悬细胞，置于冰上。加入5μl125AnnexinV-FITC混匀后，加入5μlPropidiumIodide（PI）混匀，室温，避光，反应15min。用300目滤网过滤细胞到流式细胞仪上样管，上机检测。1.6Westernblot检测4T1乳腺癌细胞的PI3K/Akt/mTOR相关蛋白的表达漆黄素（药物浓度0μM，20μM，40μM，80μM）处理4T1细胞24h后，弃掉培养液，收集细胞，使用细胞裂解液（RIPA+蛋白酶抑制剂）提取细胞蛋白，使用BCA方法测定130蛋白浓度，使用纯水和loadingbuffer配齐上样样本，煮沸变性，电泳分离，40v电压电转过夜，使用5%脱脂奶粉室温2h封闭，加入一抗层析柜中4℃过夜，TBST洗膜，加入二抗，室温2h孵育，TBST3x10min洗膜，Odyssey远红外分析仪检测。2统计方法计数资料采用均数±标准差表示，采用SPSS19.0进行统计学分析，图表主要由GraphPad135Prism5.0生成，两组比较采用t检验，多组比较采用方差分析，P<0.05认为差异具有统计学意义。3实验结果3.1漆黄素抑制乳腺癌细胞增殖-MTT方法采用MTT方法检测漆黄素不同浓度（20μM，40μM，80μM）对不同乳腺癌细胞4T1，1404T1-tumor，MCF-7，MDA-MB-231增殖的影响。如图1示，与对照组相比，漆黄素可以抑制4T1细胞的增殖（P<0.05），漆黄素可以抑制MCF-7细胞的增殖（P<0.05），且抑制药效呈浓度依赖。同时，高浓度的漆黄素可以抑制MDA-MB-231细胞的增殖（P<0.05）其中4T1对漆黄素的药物应答性较好，因此选择4T1进行进一步的研究。145图１漆黄素抑制乳腺癌细胞增殖3.2漆黄素抑制乳腺癌细胞4T1的增殖-ECIS方法ECIS是一种实时定量无损伤的细胞行为研究平台，通过细胞在电极板上的生长产生的阻抗值R值来检测细胞的行为学变化，ECIS增殖实验显示，漆黄素可以明显抑制4T1的增-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn殖，且呈浓度依赖性（图2A）。1503.3漆黄素抑制乳腺癌细胞4T1转移-ECIS方法电击损伤修复（woundhealing）是ECIS平台检测细胞转移能力的方法，当细胞生长达到平台期，给予中央电极孔区域的细胞进行电击造成细胞死亡，细胞的R值下降，电极孔周围的细胞迁移到电极区域，细胞的R值逐渐上升显示细胞迁移的速度。实验显示，漆黄素可以抑制4T1的转移(图2B)。1553.4漆黄素抑制乳腺癌细胞4T1侵袭-ECIS方法细胞侵袭实验，采用HUVEC模拟体内细胞基质屏障，HUVEC的R值到达平台期，加入肿瘤细胞，当肿瘤细胞穿透HUVEC形成的屏障，R值下降，用R值变化来反应肿瘤细胞的侵袭能力。实验显示，漆黄素可以抑制4T1的侵袭（图2C）。3.5漆黄素诱导乳腺癌细胞凋亡160采用AnnexinV-PI双染方法检测漆黄素对4T1凋亡的影响，药物作用24h后发现，与对照组相比，中高浓度漆黄素可以诱导4T1的凋亡（P<0.05），低、中、高浓度的漆黄素组凋亡率（早期凋亡±晚期凋亡）分别为10.82%±4.73%，24.28%±7.92%，22.89%±4.21%，中浓度漆黄素主要诱导细胞的早期凋亡，凋亡率为15.54%±2.88%，高浓度的漆黄素主要诱导细胞的晚期凋亡，凋亡率为15.54%±2.88%，结果见图3。-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn165图２ＥＣＩＳ平台实验显示漆黄素可以抑制４Ｔ１的增殖转移和侵袭-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图３漆黄素诱导４Ｔ１凋亡1703.6漆黄素调节乳腺癌细胞4T1的PI3K/Akt/mTOR通路Westernblot分析表明，漆黄素作用于4T1细胞后，Akt表达下降，PI3K、Mtor、P70表达无影响，但是磷酸化的PI3K、Akt、mTOR和P70的表达下降。图４漆黄素对PI3K/Akt/mTOR通路调节1754讨论中药或者天然植物应用与肿瘤治疗中历史悠久，研究显示其联合目前的标准治疗可以降低药物治疗的毒性，增加临床疗效。多种植物中的类黄酮类化合物被证实具有抑制肿瘤细胞-7- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn生长，诱导肿瘤细胞凋亡等抗肿瘤活性。大样本的流行病学调查发现类黄酮类化合物具有预防肿瘤作用。漆黄素作为一种广泛存在与药用植物和食用植物中的类黄酮类化合物也得到了180众多研究的关注，但是关于漆黄素和乳腺癌的研究较少，Yang等发现漆黄素可以通过调节细胞的凋亡和自噬来抑制Mcf-7的增殖[18]；Matthew实验也显示漆黄素可以通过细胞周期的阻滞和诱导细胞的凋亡来抑制乳腺癌细胞MDA-MB-468和MDA-MB-231的增殖[19]，但是还没有体内实验探讨漆黄素对乳腺癌的干预作用。本实验证实了漆黄素可以抑制乳腺细胞的的增殖，同时发现漆黄素可以抑制乳腺癌细胞4T1的转移和侵袭，诱导4T1的凋亡。体185内实验显示，漆黄素可以抑制乳腺癌细胞4T1原位移植瘤的生长。我们同时探讨了漆黄素抑制乳腺癌细胞4T1可能的作用机制，结果显示漆黄素可以下调磷酸化PI3K，Akt，mTOR的表达，Caspase-3，Caspase-8和Caspase-9参与了漆黄素诱导4T1的凋亡。PI3K是一种可使细胞膜上的肌醇环第3位羟基磷酸化的磷脂酰肌醇激酶，PI3K的活化主要是通过与具有磷酸化酪氨酸残基的生长因子受体或与Ras蛋白的结合，PI3K激活产190生的PIP3参与了Akt的磷酸化活化，激活的Akt从细胞膜转移到细胞质和细胞核，通过磷酸化作用激活或抑制下游靶蛋白如Bad，Caspase，NF-Kb，mTOR等调节细胞的增殖、分化、侵袭、凋亡、能量代谢等[20-22]。PI3K/Akt/mTOR信号通路在人类多种恶性肿瘤中被激活，包括乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌等，其中有研究报道在乳腺癌中这条通路的活化高达70%，且和乳腺癌的临床特征和不良预后相关[23,24]。PI3K/Akt通路的抑制可以195抑制肿瘤细胞的增殖，增加细胞的凋亡[25]。有实验研究发现，漆黄素可以抑制肺癌、前列腺癌、结直肠癌、白血病等细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路的表达和活化[11]，这与我们的实验结果一致，这些结果显示漆黄素的PI3K/Akt/mTOR信号通路的靶向抑制作用，此发现将推动漆黄素进一步的研究和临床转化的应用。本实验中我们采用了ECIS研究漆黄素对乳腺癌细胞4T1的转移和侵袭的作用，ECIS200平台能更加真实反应细胞的行为改变[26,27]。研究发现漆黄素可以抑制乳腺癌细胞4T1的转移和侵袭。课题组前期已经成功造模乳腺癌细胞4T1原位移植瘤转移模型，接种后按照肿瘤体积进行分组，采用小动物成像观察4T1乳腺癌原位移植瘤的生长情况，然后手术切除原位瘤，继续给药采用小动物成像观察4T1乳腺癌肺转移的情况。我们进行了体内实验的预实验，漆黄素223mg/kg腹腔注射的体内实验，该用量是参考Yasmine等之前的实验用205量[15]，实验结果有待正式实验正式。预实验中出现的药物毒性考虑溶媒（DMSO:PEG200=1:4）和漆黄素联合导致，漆黄素同其他的天然黄酮类化合物一样，溶解性较差，漆黄素的部分体内研究采用的是DMSO作为溶媒进行腹腔注射，同时有研究报道了漆黄素较低的口服生物利用度，这些与本实验的发现是一致的，低溶解性和低生物利用度限制了漆黄素的进一步研究转化。有研究者尝试采用加载药物运输载体，改进制剂技术来克服这些问题[28,29]，期210待更多的类似研究能为漆黄素的进一步的研究和临床转化提供策略。[参考文献](References)[1]L.A.Torre,F.Bray,R.L.Siegel,J.Ferlay,J.Lortet-Tieulent,andA.Jemal."Globalcancerstatistics,2012,"CACancerJClin,vol.65,no.2,pp.87-108.[2]R.L.Siegel,K.D.Miller,andA.Jemal."CancerStatistics,2017,"CACancerJClin,vol.67,no.1,pp.7-30.215[3]X.Sun,X.Zhang,J.Y.Nian,etal."ChineseHerbalMedicineasAdjunctiveTherapytoChemotherapyforBreastCancer:ASystematicReviewandMeta-Analysis,"EvidBasedComplementAlternatMed,vol.2016,p.3281968.[4]S.G.Li,H.Y.Chen,C.S.Ou-Yang,etal."TheefficacyofChineseherbalmedicineasanadjunctivetherapyforadvancednon-smallcelllungcancer:asystematicreviewandmeta-analysis,"PLoSOne,vol.8,no.2,p.e57604.220[5]H.S.Jang,S.H.Kook,Y.O.Son,etal."FlavonoidspurifiedfromRhusvernicifluaStokesactivelyinhibitcell-8- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cngrowthandinduceapoptosisinhumanosteosarcomacells,"BiochimBiophysActa,vol.1726,no.3,pp.309-316.[6]Y.J.Moon,X.Wang,andM.E.Morris."Dietaryflavonoids:effectsonxenobioticandcarcinogenmetabolism,"ToxicolInVitro,vol.20,no.2,pp.187-210.[7]N.Khan,D.N.Syed,N.Ahmad,andH.Mukhtar."Fisetin:adietaryantioxidantforhealthpromotion,"225AntioxidRedoxSignal,vol.19,no.2,pp.151-162.[8]P.Hodek,P.Trefil,andM.Stiborova."Flavonoids-potentandversatilebiologicallyactivecompoundsinteractingwithcytochromesP450,"ChemBiolInteract,vol.139,no.1,pp.1-21.[9]C.L.Frankenfeld,J.R.Cerhan,W.Cozen,etal."Dietaryflavonoidintakeandnon-Hodgkinlymphomarisk,"AmJClinNutr,vol.87,no.5,pp.1439-1445.230[10]R.Zamora-Ros,A.Agudo,L.Lujan-Barroso,etal."DietaryflavonoidandlignanintakeandgastricadenocarcinomariskintheEuropeanProspectiveInvestigationintoCancerandNutrition(EPIC)study,"AmJClinNutr,vol.96,no.6,pp.1398-1408.[11]D.N.Syed,V.M.Adhami,M.I.Khan,andH.Mukhtar."InhibitionofAkt/mTORsignalingbythedietaryflavonoidfisetin,"AnticancerAgentsMedChem,vol.13,no.7,pp.995-1001.235[12]N.Khan,F.Afaq,F.H.Khusro,V.MustafaAdhami,Y.Suh,andH.Mukhtar."Dualinhibitionofphosphatidylinositol3-kinase/Aktandmammaliantargetofrapamycinsignalinginhumannonsmallcelllungcancercellsbyadietaryflavonoidfisetin,"IntJCancer,vol.130,no.7,pp.1695-1705.[13]Y.C.Liao,Y.W.Shih,C.H.Chao,X.Y.Lee,andT.A.Chiang."InvolvementoftheERKsignalingpathwayinfisetinreducesinvasionandmigrationinthehumanlungcancercelllineA549,"JAgricFoodChem,vol.57,no.24019,pp.8933-8941.[14]N.Ravichandran,G.Suresh,B.Ramesh,andG.V.Siva."Fisetin,anovelflavonolattenuatesbenzo(a)pyrene-inducedlungcarcinogenesisinSwissalbinomice,"FoodChemToxicol,vol.49,no.5,pp.1141-1147.[15]Y.S.Touil,J.Seguin,D.Scherman,andG.G.Chabot."Improvedantiangiogenicandantitumouractivityof245thecombinationofthenaturalflavonoidfisetinandcyclophosphamideinLewislungcarcinoma-bearingmice,"CancerChemotherPharmacol,vol.68,no.2,pp.445-455.[16]D.N.Syed,F.Afaq,N.Maddodi,etal."InhibitionofhumanmelanomacellgrowthbythedietaryflavonoidfisetinisassociatedwithdisruptionofWnt/beta-cateninsignalinganddecreasedMitflevels,"JInvestDermatol,vol.131,no.6,pp.1291-1299.250[17]I.Murtaza,V.M.Adhami,B.B.Hafeez,M.Saleem,andH.Mukhtar."Fisetin,anaturalflavonoid,targetschemoresistanthumanpancreaticcancerAsPC-1cellsthroughDR3-mediatedinhibitionofNF-kappaB,"IntJCancer,vol.125,no.10,pp.2465-2473.[18]P.M.Yang,H.H.Tseng,C.W.Peng,W.S.Chen,andS.J.Chiu."Dietaryflavonoidfisetintargetscaspase-3-deficienthumanbreastcancerMCF-7cellsbyinductionofcaspase-7-associatedapoptosisand255inhibitionofautophagy,"IntJOncol,vol.40,no.2,pp.469-478.[19]M.L.Smith,K.Murphy,C.D.Doucette,A.L.Greenshields,andD.W.Hoskin."TheDietaryFlavonoidFisetinCausesCellCycleArrest,Caspase-DependentApoptosis,andEnhancedCytotoxicityofChemotherapeuticDrugsinTriple-NegativeBreastCancerCells,"JCellBiochem,vol.117,no.8,pp.1913-1925.[20]E.C.Lien,C.C.Dibble,andA.Toker."PI3Ksignalingincancer:beyondAKT,"CurrOpinCellBiol,vol.45,260pp.62-71.[21]S.J.Rodgers,D.T.Ferguson,C.A.Mitchell,andL.M.Ooms."RegulationofPI3Keffectorsignallingincancerbythephosphoinositidephosphatases,"BiosciRep,vol.37,no.1.[22]S.CarvalhoandF.Schmitt."PotentialroleofPI3Kinhibitorsinthetreatmentofbreastcancer,"FutureOncol,vol.6,no.8,pp.1251-1263.265[23]M.A.Aleskandarany,E.A.Rakha,M.A.Ahmed,etal."PIK3CAexpressionininvasivebreastcancer:abiomarkerofpoorprognosis,"BreastCancerResTreat,vol.122,no.1,pp.45-53.[24]E.Lopez-Knowles,S.A.O"Toole,C.M.McNeil,etal."PI3Kpathwayactivationinbreastcancerisassociatedwiththebasal-likephenotypeandcancer-specificmortality,"IntJCancer,vol.126,no.5,pp.1121-1131.[25]P.G.Rychahou,L.N.Jackson,S.R.Silva,S.Rajaraman,andB.M.Evers."Targetedmoleculartherapyofthe270PI3Kpathway:therapeuticsignificanceofPI3Ksubunittargetinginco[26]N.K.Saxena,D.Sharma,X.Ding,etal."ConcomitantactivationoftheJAK/STAT,PI3K/AKT,andERKsignalingisinvolvedinleptin-mediatedpromotionofinvasionandmigrationofhepatocellularcarcinomacells,"CancerRes,vol.67,no.6,pp.2497-2507.[27]N.K.Saxena,L.Taliaferro-Smith,B.B.Knight,etal."Bidirectionalcrosstalkbetweenleptinandinsulin-like275growthfactor-Isignalingpromotesinvasionandmigrationofbreastcancercellsviatransactivationofepidermalgrowthfactorreceptor,"CancerRes,vol.68,no.23,pp.9712-9722.[28]A.Kadari,S.Gudem,H.Kulhari,etal."EnhancedoralbioavailabilityandanticancerefficacyoffisetinbyencapsulatingasinclusioncomplexwithHPbetaCDinpolymericnanoparticles,"DrugDeliv,vol.24,no.1,pp.224-232.280[29]J.Seguin,L.Brulle,R.Boyer,etal."Liposomalencapsulationofthenaturalflavonoidfisetinimprovesbioavailabilityandantitumorefficacy,"IntJPharm,vol.444,no.1-2,pp.146-154.-9-'