利用直接重编程诱导心肌细胞体外培育心肌组织.pdf 7页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn利用直接重编程诱导心肌细胞体外培育心#肌组织**张光伟，谷天祥，于芙民5（中国医科大学附属第一医院，沈阳110001）摘要：【目的】研究利用直接重编程诱导心肌细胞及心脏脱细胞骨架培育心肌组织的可行性。【方法】将成年大鼠心脏脱细胞制成纤维骨架。取大鼠尾成纤维细胞，利用Gata4、Mef2c、Tbx5三个基因同时转染进行直接重编程，转染2周后进行二氢吡啶受体α2δ1δ1富集，所得10细胞采用心肌细胞特异性蛋白α-MHC和cTNT及电生理分析进行心肌细胞鉴定，并种植于心脏脱细胞纤维骨架中培养心肌组织，然后利用免疫荧光染色分析新生心肌组织结构。【结果】直接重编程并富集2周后，约86%的细胞表达α-MHC，79%表达cTNT，进一步分析显示这些细胞的电生理特点与心肌细胞极为相似，提示已转化为心肌细胞转。将这些细胞种植于心脏脱细胞纤维骨架后可形成心肌组织。【结论】直接重编程可使成纤维细胞转化为心15肌细胞，这些心肌细胞结合脱细胞心脏骨架可形成排列有序的心肌组织，可能成为一种新的组织工程心脏培育方法。关键词：直接重编程；心肌细胞；脱细胞心脏；组织工程心脏。中图分类号：R318.11文献标识码:A20Cultivationofmyocardialtissuebydirectreprogramming-inducedcardiomyocytesZHANGGuangwei,GUTianxiang,YUFumin(TheFirstHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001)Abstract:AimToinvestigatethefeasibilityofcultivationofmyocardialtissuebyusingdirect25reprogramming-inducedcardiomyocytesanddecellularizedheartmatrix.MethodsHeartswereharvestedfromadultrats,andsubsequentlydecellularizedforthefollowingexperiments.DirectreprogramingwasperformedtoinducefibroblastsintocardiomyocytesbydefinedfactorsGata4,Mef2candTbx5,followedbyanenrichmentforthedihydropyridinereceptorsubunitα2δ1δ1.Theinducedcardiomyocyteswereimplantedintodecellularizedheartmatrixforinvitrocultivationof30myocardialtissue,orwereculturedcontinuouslyforidentificationofmyocardialdifferentiationbymeasuringcardiacspecificproteinα-MHCandcTNT,aswellasbyanalysisofelectrophysiology.Results2weeksafterenrichment,86%cellsexpressedα-MHC,and79%expressedcTNT,andthesecellscouldbeinducedtoyieldcardiacactionpotential,whichisidentifiedascardiacdifferentiation.Andwhenimplantedintodecellularizedheartmatrix,theseinducedcardiomyocyteswouldgrowthand35myocardialtissue.ConclusionsFibroblastscanbeinducedbydirectreprogrammingtodifferentiatedintocardiomyocytes,whichcanbeuseforcultivationofmyocardialtissue,maybeanewmethodofhearttissueengineering.Keywords:Directreprogramming;Cardiomyocytes;Decellularizedheartmatrix;Hearttissueengineering.40基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金(20132104110004)作者简介：张光伟（1979年），男，副教授、硕导，主要研究方向：心肌细胞再生通信联系人：谷天祥（1964年），男，教授、博导，主要研究方向：心肌细胞再生.E-mail:cmugtx@sina.com-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn0引言由于人口老龄化日益严重，以及高血压、冠心病等常见心血管疾病发病率正逐年增加，[1]心力衰竭已成为威胁人们健康的主要杀手，给社会带来了巨大的负担。但是，对于这种终[2]45末期心脏病尚无有效的治疗策略，死亡率甚高。目前临床常用的方法包括心脏移植和心脏[3]机械辅助。前者由于存在供体数量以及免疫排斥反应等问题而无法广泛应用；而后者技术[4]还远不成熟，无法避免出现致命性并发症。近年来，组织工程技术飞速发展，使得体外培育自体心脏成为可能。利用自体细胞培育的组织工程心脏不会受到免疫排斥反应和供体短缺的限制，亦不存在血栓形成、溶血等严重50并发症。因而自体组织工程心脏移植可能具有十分广阔的应用前景，甚至已经有人提出，在[5]不久的将来该技术就可能应用于临床。虽然该领域已经有大量研究，且取得了许多重要突破，但是探寻适合组织工程心脏培养的种子细胞仍是最大的难题。各种干细胞已被广泛应用于动物实验及临床研究，但由于获取困难、数量有限、心肌细[6,7]胞分化能力严重不足或存在伦理问题等诸多限制，均不适用于培养组织工程心脏。最近55研究发现，利用基因重编程技术可将分化成熟的哺乳动物细胞直接诱导转化为另一种细胞，[8]这种技术称作直接重编程。Ieda等报导，利用Gata4、Mef2c和Tbx5（GMT）三个转录因子转染可诱导大鼠成纤维细胞直接转化为心肌细胞。这种诱导心肌细胞获取容易、数量巨大且转化效率极高，可能成为培育组织工程心脏的理想细胞。本研究拟利用直接重编程技术诱导的心肌细胞，进行体外培育组织心肌组织的探索。601材料和方法1.1大鼠尾成纤维细胞制备及直接重编程：选用成年Fsp1基因报告（GFP）SD大鼠（200~250g），利用组织干涸法提取尾成纤+维细胞，用流式细胞仪富集GFP细胞。所得细胞置于含5%CO2，37%湿度的培养箱内中培养。培养液为DMEM/F12培养基含有10%胎牛血清、100U/ml的青霉素。每周换液两65次，至汇合度达90%传代。第一次传代时，利用抗DDR2和Vimentin免疫荧光染色鉴定细胞。传至第3代，利用携带Gata4、Mef2c、Tbx5的三种基因的Lipofectamine2000转染系统体外转染成纤维细胞。1.2蛋白表达测定利用Westernblotting检测心肌细胞特异性肌钙蛋白T（CardiacspecifictroponinT,70cTNT）、α-肌球蛋白重链（α-myosinheavychain,α-MHC）的表达，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH）作为内参。1.3电生理分析-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn利用膜片钳技术记录动作电位时程（actionpotentialduration,APD）、钠电流（sodium75current,INa）、L-型钙电流（L-typecalciumcurrent,ICa-L）。封接电阻在2GΩ以上。使用膜片钳放大器（Axopatch200B）、数模转换装置（Digidata1200）、Pclamp5.5.1软件采集数据。采用Clampfit分析所得的数据。1.4免疫荧光染色利用免疫荧光技术行细胞爬片或新生心肌组织冰冻切片的抗DDR2染色和抗Vimentin80染色鉴定成纤维细胞；抗cTNT、α-MHC染色标记心肌细胞；抗胶原蛋白I和抗胶原蛋白III（CollagenI&III）染色标记细胞外纤维骨架。用4"，6二脒基-2-苯吲哚（4"，6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）进行核染色。采用荧光显微镜或共聚焦显微镜进行观察。所有一抗购自英国Abcam公司。1.5脱细胞心脏骨架的制备：85完整的心脏取自成年SD大鼠，体外经升主动脉灌注1%十二烷基硫酸钠（Sodiumdodecylsulfate，SDS）12小时脱细胞（20℃），然后1%Triton-X100灌注30分钟，100U/ml链霉素[9]和两性霉素B灌注5天，得到去细胞心脏纤维支架。1.6心肌细胞的纯化和种植:重编程2周后，采用免疫磁珠法富集二氢吡啶受体α2δ1（dihydropyridinereceptor-α2δ1,90DHPRs-α2δ1）阳性细胞。富集后细胞继续培养2周行心肌细胞分化鉴定，或直接采用局部注射方式种植于脱细胞心脏骨架中或继续培养6周后行心肌细胞分化分析。详细培育方法参[9]见作者已发表文献。1.7统计学分析:所得数据用ˉx±s表示，利用SPSS13.8统计软件处理，采用两样本t检验进行两组间比95较，P<0.05认为差异有显著性。2结果2.1Fsp1-GFP转基因大鼠尾成纤维细胞鉴定：通过免疫荧光检测成纤维细胞特异性抗原发现提取的细胞表达DDR2（图1A-D）和Vimentin（图1E-H），证实这些细胞为成纤维细胞。-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn100图1尾成纤维细胞免疫荧光染色照片A和E为爬片的细胞表达GFP（绿色）；B为抗DDR2染色（红色）；F为抗Vimentin染色（红色）；C和G为DAPI染色（蓝色）；D和H分别为A、B和C与E、F和G的合成图片，共表达为黄色荧光。Fig.1Theimmunofluorescencepicturesofratfibroblasts.1052.2鉴定心肌细胞转化：+GMT重编程Fsp1-GFP细胞2周后免疫荧光染色发现，约有32%表达α-MHC（图2A-D），13%表达cTNT（图2E-H）。WesternBlotting分析显示，重编程后DDR2和Vimentin表达明显减低，而α-MHC和cTNT表达明显增高（图2I和JP＜0.05）。110图2GMT重编程成纤维细胞分化鉴定A和E为爬片的细胞表达GFP（绿色）；B为抗αMHC染色（红色）；和F为抗cTNT染色（红色）；C和G为DAPI染色（蓝色）；D与H分别为A、B和C与E、F和G的合成图片，共表达为黄色荧光。I为WesternBlotting结果照片；J为四种蛋白的表达对比。*与非重编程相比P＜0.05。Fig.2TheidentificationfordifferentiationofGMTreprogrammingfibroblasts.-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn1152.3新生心肌细胞特点分析：DHPRs-α2δ1富集继续培养2周后，约有86%的细胞表达α-MHC（图2A-D），79%表达cTNT（图2E-H）。膜片钳记录分析证实这些细胞的动作电位和INa和ICa-L与心肌细胞相似，提示这些细胞已转化为成熟的心肌细胞。120图3新生心肌细胞分析A和B分别抗α-MHC和cTNT免疫荧光染色图片（×200）。C为动作电位和INa和ICa-L曲线。Fig.3Theanalysisofneonatalcardiomyocytes.2.4心脏脱细胞骨架结构分析：125心脏脱细胞后抗胶原染色为阳性，而未发现抗cTNT染色和DAPI染色阳性细胞，提示心脏已完全脱细胞。而进一步的扫描电镜分析显示，脱细胞后无细胞残留，并且纤维骨架结构保留完整，详见作者已发表论文。2.5心肌组织培养结果：将富集后细胞植入脱细胞心脏纤维骨架4周后，共聚焦结果显示（图3），移植细胞在130脱细胞骨架中存活良好，其中大部分表达cTNT，并呈现出一定的极向性，细胞间以及细胞与脱细胞心脏纤维骨架间结合紧密，提示移植心肌细胞之间已形成结构和功能的整合。-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图4新生心肌组织共聚焦照片（×600），红色为抗胶原（COL）染色，黄色为抗cTNT染色，蓝色为细135胞核。Fig.4Theconfocolphotoofneonatalmyocaridialtissue.3讨论早在2007年，来自澳大利亚的Morritt等在组织工程心脏领域取得了一项重大突破，他[10]们利用新生心肌细胞在体培育出了可自主收缩的人工三维心腔组织。随后，来自美国明140尼苏达大学的Ott等在医学顶级期刊《NatureMedicine》杂志发表文章称，利用未成熟心肌细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞和去细胞心脏纤维骨架，在体外可培育出完整的心脏组织[11]。这些充分说明了体外培育组织工程心脏的可行性。如前所述，利用直接重编程技术可获得大量的自体心肌细胞。本研究发现，GMT重编程可使约40%的成纤维细胞转化为心肌细胞，与Ieda等的结果相似。该方法的心肌细胞转145化效率明显优于其他诱导技术。提示其可能成为培育组织工程心脏的重要种子细胞。然而，单纯的直接重编程仅能诱导不足50%的细胞转化为心肌细胞，如果心肌细胞分化成熟后进行筛选后再种植将影响细胞间的整合。所以需要探索一种方法，在早期就能筛选出心肌细胞。DHPRs是细胞膜上的一种L型钙通道，心肌细胞特异性钙离子通道蛋白DHPRs-α2δ1在心[12,13]肌细胞分化早期开始表达，最近等报导以及作者先前的研究发现，DHPRs-α2δ1可作为[9]150筛选心肌细胞的特异性表面标记物。本实验进一步研究发现，该表面受体也可作为筛选直接重编程诱导心肌细胞的有效标记物，可将分化率提高到近90%。而且更为重要的是，富集后的诱导心肌细胞并未完全成熟，种植后可更加有效地进行结构和功能的整合。[11]Ott等的体外实验中研究显示，心脏脱细胞纤维骨架是十分理想的心肌组织培养支架。其不仅具有自然的心肌细胞支架，还拥有完整的冠状动脉血管网，这些既可以保障新生155心肌组织的结构与正常心肌组织相似，又可以为体外培养提供理想的灌注系统。作者先前的[9]研究进一步证实，利用SDS等脱细胞可完整的保留细胞外结构，通过主动脉根部灌注培养基可满足新生心肌组织需要。-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn4结论160本研究将直接重编程诱导的新生心肌细胞直接注射于心脏脱细胞纤维骨架中，进行心肌组织培养。发现诱导心肌细胞能在脱心肌细胞的空隙中存活并生长，而且细胞间可见链接蛋白，提示细胞间已经进行了结构和功能整合，并且排列具有一定的极向性，可形成心肌组织。虽然新生心肌组织还不能自主收缩，但本实验结果仍然提示直接重编程诱导的心肌细胞与心脏脱细胞骨架联合应用，可能成为一个理想的组织工程心脏培育方法。165[参考文献](References)[1]YancyCW,JessupM,BozkurtB,etal.2017ACC/AHA/HFSAFocusedUpdateofthe2013ACCF/AHAGuidelinefortheManagementofHeartFailure:AReportoftheAmericanCollegeofCardiology/AmericanHeartAssociationTaskForceonClinicalPracticeGuidelinesandtheHeartFailureSocietyofAmerica[J].Circulation.1702017.doi:10.1161/CIR.0000000000000509.[Epubaheadofprint][2]LyonsKJ,EzekowitzJA,LiangL,etal.ImpactofCurrentVersusPreviousCardiacResynchronizationTherapyGuidelinesontheProportionofPatientsWithHeartFailureEligibleforTherapy[J].JACCHeartFail.2017;5(5):388-392.[3]BurchillLJ.Hearttransplantationinadultcongenitalheartdisease[J].Heart.2016;102(23):1871-1877.175[4]SlaughterMS,RogersJG,MilanoCA,etal.Advancedheartfailuretreatedwithcontinuous-flowleftventricularassistdevice[J].NEnglJMed.2009;361(23):2241-51.[5]TerzicA,NelsonTJ.Regenerativemedicineadvancinghealthcare2020[J].JAmCollCardiol.2010;55(20):2254-7.[6]JavaidMS,AshfaqUA,MasoudMS.PotentialofStemCellsasRegenerativeMedicine:FromPrefaceto180Advancements[J].CritRevEukaryotGeneExpr.2017;27(1):1-17.[7]BardelliS,MoccettiM.StemCellBankingandItsImpactonCardiacRegenerativeMedicine[J].AdvExpMedBiol.2016;951:163-178.[8]IedaM,FuJD,Delgado-OlguinP,etal.Directreprogrammingoffibroblastsintofunctionalcardiomyocytesbydefinedfactors[J].Cell.2010;142(3):375-86.185[9]张光伟，谷天祥，管晓宇等。利用c-kit+骨髓间充质干细胞与心脏脱细胞骨架共培育的心肌组织[J]。中国组织工程研究。2014,18(19)：2975-2980。[10]MorrittAN,BortolottoSK,DilleyRJ,etal.Cardiactissueengineeringinaninvivovascularizedchamber[J].Circulation.2007;115(3):353-60.[11]OttHC,MatthiesenTS,GohSK,etal.Perfusion-decellularizedmatrix:usingnature"splatformtoengineera190bioartificialheart[J].NatMed.2008;14(2):213-21.[12]ZhangGW,GuTX,GuanXY,etal.Delayedenrichmentforc-kitandinducingcardiacdifferentiationattenuatedprotectiveeffectsofBMSCstransplantationinpigmodelofacutemyocardialischemia[J].CardiovascTher.2015;33(4):184-92.[13]GrajalesL,GarcíaJ,BanachK,etal.Delayedenrichmentofmesenchymalcellspromotescardiaclineageand195calciumtransientdevelopment[J].JMolCellCardiol.2010;48(4):735-45.-7-'