敲降KLF4表达增强肝癌细胞Bel-7402对奥沙利铂的敏感性.pdf 7页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn敲降KLF4表达增强肝癌细胞Bel-7402对奥#沙利铂的敏感性**贾勇圣，李淑芬，史业辉，佟仲生5（天津医科大学附属肿瘤医院乳腺内科，国家肿瘤临床医学研究中心，乳腺癌防治教育部重点实验室，天津市300060）摘要：【目的】观察敲降KLF4表达增强肝癌细胞Bel-7402对奥沙利铂（Oxaliplatin,OXA）敏感性的作用及相关机制。【方法】pLVTHM-shKL4慢病毒感染人肝癌细胞Bel-7402，敲10降KLF4表达，Bel-7402细胞经OXA作用后，采用CCK8细胞增殖实验检测细胞存活率，流式细胞仪检测细胞凋亡，免疫印迹法检测GCLC及GPX1蛋白表达水平，并在体内水平上观察OXA对肝癌细胞Bel-7402裸鼠皮下移植瘤生长的影响。【结果】敲降KLF4能够明显增强OXA对Bel-7402细胞增殖抑制作用，并抑制Bel-7402细胞裸鼠皮下移植瘤生长。敲降KLF4可以增强OXA诱导的Bel-7402凋亡；降低Bel-7402细胞内谷胱甘肽水平，并下15调GCLC及GPX1蛋白表达。【结论】通过降低GCLC及GPX1蛋白的表达，敲降KLF4可明显抑制细胞内谷胱甘肽水平，从而显著增强肝癌细胞Bel-7402对奥沙利铂敏感性。关键词：肝癌；化疗；奥沙利铂中图分类号：R96620KLF4knockdownenhancesthesensitivityofhumanhepatocarcinomaBel-7402cellstooxaliplatinJIAYongsheng,LIShufen,SHIYehui,TongZhongsheng(DepartmentofBreastOncology,TianjinMedicalUniversityCancerInstituteandHospital,NationalClinicalResearchCenterforCancer,KeyLaboratoryofBreastCancerPreventionand25Therapy,MinistryofEducation,KeyLaboratoryofCancerPreventionandTherapy,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300060)Abstract:ToobservetheeffectofKLF4knockdownonoxaliplatinsensitivityinhumanhepatocarcinomaBel-7402cellsandtherelatedmechanisms.Methods:AfterinfectionofpLVTHM-shKLF4lentivirus,KLF4knockdownenhancesthesensitivityofhumanhepatocarcinoma30Bel-7402cellstooxaliplatinthecellviabilitywasdeterminedbyCCK-8invitro,thecellproliferationwasobservedinxenografttumormodel,thecellularapoptosiswereexaminedbyflowcytometry,andthechangesofGCLCandGPX1weredeterminedbyWestern-blot.Results:Ascomparedwithcontrol,KLF4knockdowncouldsignificantlyenhancetheproliferationinhibitionofBel-7402cellstooxaliplatininvitroandinvivo,andcouldinducethecellularapoptosis.Theglutathionecontentandthe35expressionlevelsofGCLCandGPX1weredown-regulatedaftertreatedbyKLF4knockdown.Conclusion:BydownregulatingtheproteinexpressionofGCLCandGPX1,KLF4-mediateddepletionofglutathionerepresentsamajormechanisminenhancingthesensitivityofhumanhepatocarcinomaBel-7402cellstooxaliplatin.Keywords:hepatocarcinoma;chemothrerapy;oxaliplatin40基金项目：教育部高等学校博士学科点专项科研基金（20131202120003）作者简介：贾勇圣（1979-），男，副主任医师，主要研究方向：肿瘤化疗通信联系人：佟仲生（1963-），男，主任医师，硕导，主要研究方向：肿瘤化疗.E-mail:tongzhongsheng@tjmuch.com-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn0引言肝癌是高度恶性的肿瘤，起病隐匿、进展快、预后差，患者在诊断时往往已经到了中晚期，失去手术和局部治疗的机会。虽然在肝细胞肝癌的研究中取得了一定的进展，但是肝细[1]45胞肝癌复发转移和5年生存率低下仍然是目前肝癌治疗的难题。尽管，索拉菲尼是被全世[2]界公认治疗晚期肝细胞肝癌的靶向药物。但是系统化疗目前也逐渐得到国际认可，2013年3月12日中国CFDA批准了奥沙利铂治疗晚期肝癌。Meta分析证明了含奥沙利铂的FOLFOX4方案、XELOX方案、GEMOX方案等系统化疗在肝癌治疗中的地位。系统化疗的理念得到接受，2015年NCCN指南也将含奥沙利铂的系统化疗作为晚期肝癌治疗的选择[3]50之一，标志着国际承认系统化疗在治疗晚期肝癌的占有一席之地。然而，肝癌细胞对奥沙利铂的耐药问题也成为肝癌化疗效率相对低下的原因之一，因此如何提高肝癌细胞对奥沙利[4]铂的敏感性成为近年来的研究热点之一。我们前期研究发现KLF4在肝癌细胞中过表达，[5]与维持肝癌细胞的干性相关，发挥对铂类化疗药物的耐药作用。因此，本研究拟通过敲降KLF4表达水平，观察奥沙利铂对肝癌细胞Bel-7402的增殖、凋亡的影响，探讨敲降KLF455是否有增强肝癌细胞Bel-7402对奥沙利铂敏感性的作用，并初步探讨其可能的作用机制，为其应用于肝癌的治疗提供理论依据。1材料与方法1.1细胞株及试剂人肝癌Bel-7402细胞系来源于天津医科大学肿瘤医院肝癌重点实验室。OXA购自美国60Sigma公司。pLVTHM-shKLF4(GGACGGCTGTGGATGGAAA)由实验室前期合成，shNC（shRNA-negativecontrol）为Kosik教授惠赠。兔抗人GCLC（Glutamate-cysteineligase,catalyticsubunit，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位）及GPX1（Glutathioneperoxidase1，谷胱甘肽过氧化物酶1）单克隆抗体购自美国Abcam公司，鼠抗人beta-actin单克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG均购自北京中杉金桥公司。CCK-8检测试剂65盒购自日本同仁化学研究所，细胞凋亡检测试剂盒购自BD生物科技公司，谷胱甘肽检测试剂盒、RIPA裂解液及ECL发光液购自北京碧云天生物技术公司。1.2细胞培养Bel-7402细胞培养于含10%胎牛血清的1640培养液（美国Hyclone公司），置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，定期换液，每3-4天（3～4d）传代1次，取对数生长期细胞用70于实验。1.3CCK-8法检测细胞增殖能力慢病毒pLVTHM-shKLF4和shNC感染Bel-7402细胞72h，经10%胎牛血清的1640培养液常规培养后用0.25%胰酶消化后，将细胞按照1×104个/孔的密度接种于96孔板，37℃过夜。将细胞分为shNC组、shKLF4组，OXA（0、5、10、20μmol/L）处理，每种浓度75设6个平行复孔。37℃孵箱培养48h后吸弃上清，更换含10%体积分数CCK-8的完全培养-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn基，继续37℃孵箱培养4h，采用自动酶标仪（Bio-Rad）检测各孔490nm波长的吸光度（OD值）。计算不同处理下细胞的存活率，细胞存活率（%）=（实验组OD值-对照组OD值）/对照组OD值×100%。实验重复3次。1.4Balb/c荷瘤小鼠体内实验80雌性Balb/c裸鼠，5-6周龄，SPF级，24只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司（实验动物使用许可证号：SYXK(津)2012-0005）。慢病毒pLVTHM-shKLF4和pLVTHM-shNC感染Bel-7402细胞72h，制备单细胞悬液，PBS调整细胞浓度为2×107/ml，于小鼠侧腹壁皮下接种细胞悬液0.1ml。接种后每周2次用游标卡尺测量瘤体的长径（a）和短径（b），并根据v=(ab)2/2计算瘤体体积。当瘤体平均体积达到150mm3时，随机分为485组开始给予腹腔注射治疗（设为第0天）。shNC组：0.9%生理盐水；shKLF4组：0.9%生理盐水；shNC+OXA组：5mg/kg的OXA；shKLF4+OXA组：5mg/kg的OXA，每隔2d注射一次，每周测量两次瘤体体积，绘制生长曲线，20天后处死小鼠。1.5流式细胞术检测细胞凋亡按试剂盒说明书操作，Bel-7402细胞经10%胎牛血清的1640培养液，用0.25%胰酶消90化后，以1×105个/孔的密度接种于6孔板，37℃孵育过夜。将细胞分为shNC组、shKLF4组、shNC+OXA（5μmol/LOXA）组、shKLF4+OXA（5μmol/LOXA），经24h处理后胰酶消化收集细胞，100g离心5min，再经PBS洗3次，分别加缓冲液50μl、AnnexinⅤ-FITC5μL、PI10μL，避光15min以上，进行流式细胞检测。实验重复3次。1.6细胞总谷胱甘肽水平检测95Bel-7402细胞经1640常规培养，用0.25%胰酶消化后，以1×105个/孔的密度接种于6孔板，37℃过夜。慢病毒pLVTHM-shKLF4和pLVTHM-shNC感染Bel-7402细胞72h，PBS洗涤细胞一次，0.25%胰酶消化、离心收集细胞，吸尽上清，加入细胞沉淀体积3倍量的蛋白去除试剂S溶液，充分涡旋混匀，然后利用液氮和37℃水浴对样品进行两次快速的冻融（放入液氮中处理30s，37℃水浴处理30s）。冰浴放置5min后，1000×g离心10min，取100上清用于总谷胱甘肽的测定。使用96孔板，按照试剂盒说明书进行操作，依次加入样品及标准品，混匀，加入150μl总谷胱甘肽检测工作液后，混匀，室温孵育5min，加入50μl0.16mg/ml的NADPH（Nicotinamideadeninedinucleotidephosphate，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）溶液，混匀后立即用酶标仪测定A412。以上实验重复3次。1.7蛋白质印迹法检测105慢病毒pLVTHM-shKLF4和pLVTHM-shNC感染Bel-7402细胞72h，收集细胞，重悬于适量RIPA裂解液中，冰浴30min，使细胞充分裂解。4℃，1000g离心20min，收集上清液。BCA法进行蛋白浓度测定，计算上样量。30μg蛋白样品经SDS-PAGE凝胶电泳分离、转膜、5%脱脂奶粉封闭1h后，加入兔抗人GCLC及GPX1单克隆抗体（1:1000）和beta-actin抗体（1:2000）结合，4℃孵育过夜16h。TBST冲洗后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔110或鼠的IgG，室温孵育2h，ECL化学发光检测结果。全程以beta-actin为内参。以上实验重复3次。1.8统计学方法应用SPSS22.0统计软件进行处理，所有数据以均数±标准差（x±s）表示。多组间比-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn较115采用单因素方差分析，组内两两比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。2结果2.1敲降KLF4增强OXA对Bel-7402增殖抑制作用慢病毒pLVTHM-shKLF4和pLVTHM-shNC感染Bel-7402细胞72h，OXA（0、5、10、20μmol/L）作用于Bel-7402细胞48h，shNC组细胞存活率分别为：100±2.3%，75±4.2%，12050±2.9%，35±2.7%；shKLF4组Bel-7402细胞存活率分别为：89.8±5.7%，55.1±4.8%，30.9±3.1%，25.3±2.1%，较shNC组明显降低（P＜0.05），见图1，表明敲降KLF4可以明显增强Bel-7402对奥沙利铂敏感性。图1敲降KLF4增强OXA对Bel-7402增殖抑制作用（*P＜0.05，**P＜0.01）1252.2敲降KLF4增强OXA对Bel-7402裸鼠皮下移植瘤生长抑制作用Bel-7402接种裸鼠皮下，建立肝癌裸鼠皮下移植瘤模型，接种20天，shNC组肿瘤体积3331452.27±204.64mm，shKLF4组：1189.81±230.41mm，shNC+OXA组：940.9±200.39mm，3shKLF4+OXA组：411.31±42.29mm。结果表明：shKLF4+OXA组裸鼠皮下移植瘤体积明显130小于shNC+OXA组（P＜0.05），提示敲降KLF4可明显增强OXA对Bel-7402裸鼠皮下移植瘤的生长抑制作用。-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图2敲降KLF4增强OXA对Bel-7402裸鼠皮下移植瘤生长抑制作用1352.3敲降KLF4增强OXA对Bel-7402凋亡诱导作用5μmol/LOXA作用Bel-7402细胞24h，AnnexinⅤ-FITC/PI双染细胞，流式细胞术检测细胞凋亡情况，结果显示：shNC组细胞凋亡率：4.1±1.3%，shKLF4组细胞凋亡率：6.5±2.8%，shNC+OXA组细胞凋亡率：14.8±3.6%，shKLF4+OXA组细胞凋亡率：42±6.5%。如图3所示，结果表明KLF4可明显增强OXA对Bel-7402凋亡诱导作用（P＜0.01）。140图3敲降KLF4增强OXA对Bel-7402凋亡诱导作用2.4敲降KLF4降低Bel-7402细胞内谷胱甘肽水平慢病毒pLVTHM-shKLF4和pLVTHM-shNC感染Bel-7402细胞72h，shKLF4组细胞内谷胱甘肽水平均较shNC组明显降低（图4A），说明敲降KLF4可以有效降低Bel-7402内谷145胱甘肽水平。同时蛋白免疫印迹实验检测结果表明，敲降KLF4表达后，shKLF4组Bel-7402细胞GCLC及GPX1表达水平较shNC组降低（图4B）。-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图4敲降KLF4对Bel-7402细胞中谷胱甘肽水平的影响1503讨论中国是肝癌高发的国家，中国人口占全球的1/5，而肝癌的发病和死亡率却超过了全球[6]1/2。化疗目前逐渐成为治疗晚期肝癌的重要治疗手段之一，含有奥沙利铂的方案在其化疗中发挥着重要作用，但肝癌细胞对奥沙利铂的耐药作用成为阻碍其治疗成功的主要原因。奥沙利铂是一种细胞毒性铂类衍生物，研究表明肿瘤细胞对铂类耐药是由多因素引起的，主要[7][8]155为：细胞内铂类累积量的减少；谷胱甘肽和巯基蛋白水平的升高；DNA损伤的修复。然而，进入细胞内的铂类仅有1%能与核DNA形成共价键并且铂类对胞质有明显的细胞毒作[9]用。因此，寻找能逆转肿瘤细胞对铂类耐药并减轻毒副作用的方法成为研究的热点。KLF4是KLF家族(Krüppel-likefactors)成员之一，该家族是真核生物中广泛存在的一类基础转录元件结合蛋白，通过羧基端三个连续锌指结构域结合靶基因启动子内富含GC序列以调控160其转录。在干细胞中，KLF4与维持胚胎干细胞自我更新能力有关，并且是参与体细胞重新编程的重要转录因子。同时，KLF4可以通过与靶基因的不同作用在肿瘤中发挥癌基因或抑[10]癌基因两种完全相反的作用。我们前期的研究也发现KLF4在肝癌细胞对铂类化疗药物的[5]耐药中发挥重要作用。本研究中，通过慢病毒感染的方法敲降KLF4蛋白表达，发现奥沙利铂对肝癌细胞的增殖抑制、凋亡诱导作用显著增强，在荷瘤小鼠水平上也观察到相同的结165果，说明敲降KLF4可增强肝癌细胞细胞Bel-7402对奥沙利铂的敏感性。然而，这种作用的分子机制仍不清楚。一些研究发现，谷胱甘肽和巯基蛋白水平的升高是肿瘤细胞解毒铂类药物的重要作用机制，通过抑制谷胱甘肽合成通路的关键酶GCLC及GPX1干扰谷胱甘肽[11]的合成，可有效降低肿瘤细胞的化疗耐药性。因此，本实验检测了敲降KLF4后GCLC及GPX1的表达水平，发现敲降KLF4表达可明显降低Bel-7402细胞内谷胱甘肽合成通路170的关键酶GCLC及GPX1的蛋白表达，从而降低细胞内谷胱甘肽水平，说明敲降KLF4可通过抑制谷胱甘肽水平增强Bel-7402对奥沙利铂敏感性。不过，KLF4对谷胱甘肽调控的机制很复杂，其具体的信号通路还不是很清楚，仍有待深入的研究探讨。4结论本研究证实，敲降KLF4通过降低Bel-7402细胞内谷胱甘肽合成通路的关键酶GCLC175及GPX1的蛋白表达，进而下调细胞内谷胱甘肽水平，从而增加了肝癌细胞对奥沙利铂敏感-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn性。[参考文献](References)[1]KlungboonkrongV,DasD,McLennanG.MolecularMechanismsandTargetsofTherapyforHepatocellular180Carcinoma[J].JVascIntervRadiol,2017,pii:S1051-0443(17)30274-9.[2]KeatingGM.Sorafenib:AReviewinHepatocellularCarcinoma[J].TargetOncol,2017,12(2):243-253.[3]LiuL,ZhengYH,HanL,etal.Efficacyandsafetyoftheoxaliplatin-basedchemotherapyinthetreatmentofadvancedprimaryhepatocellularcarcinoma:Ameta-analysisofprospectivestudies[J].Medicine(Baltimore),2016,95(40):e4993.185[4]DengG,ZengS,MaJ,etal.Theanti-tumoractivitiesofNeferineoncellinvasionandoxaliplatinsensitivityregulatedbyEMTviaSnailsignalinginhepatocellularcarcinoma[J].SciRep,2017,7:41616.[5]JiaY,ZhangW,LiuH,etal.InhibitionofglutathionesynthesisreversesKruppel-likefactor4-mediatedcisplatinresistance[J].CancerChemotherPharmacol,2012,69(2):377-385.[6]ChenW,ZhengR,BaadePD,etal.CancerstatisticsinChina,2015[J].CACancerJClin,2016,66(2):115-132.190[7]Pedraz-CuestaE,ChristensenS,JensenAA,etal.TheglutamatetransportinhibitorDL-Threo-beta-Benzyloxyasparticacid(DL-TBOA)differentiallyaffectsSN38-andoxaliplatin-induceddeathofdrug-resistantcolorectalcancercells[J].BMCCancer,2015,15:411.[8]HuangX,HuangR,GouS,etal.AnticancerPlatinum(IV)ProdrugsContainingMonoaminophosphonateEsterasaTargetingGroupInhibitMatrixMetalloproteinasesandReverseMultidrugResistance[J].BioconjugChem,1952017,28(4):1305-1323.[9]GalluzziL,VitaleI,MichelsJ,etal.Systemsbiologyofcisplatinresistance:past,presentandfuture[J].CellDeathDis,2014,5:e1257.[10]GhalebAM,YangVW.Kruppel-likefactor4(KLF4):Whatwecurrentlyknow[J].Gene,2017,611:27-37.[11]PeiS,MinhajuddinM,CallahanKP,etal.Targetingaberrantglutathionemetabolismtoeradicatehuman200acutemyelogenousleukemiacells[J].JBiolChem,2013,288(47):33542-33558.-7-'