ABA信号转导中OsUGD与OsDMI3相互作用的鉴定.pdf 8页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnABA信号转导中OsUGD与OsDMI3相互作用#的鉴定**李溪，蒋明义，倪岚5（南京农业大学，生命科学学院，南京，210095）摘要：本研究前期以OsDMI3为诱饵，利用酵母双杂筛选水稻叶片cDNA文库，筛选出一个与OsDMI3互作的蛋白，OsUGD。为了进一步检测OsDMI3和OsUGD互作的真实性，运用BiFC（BimolecularFluorescenceComplementation），GST-pulldown，Co-IP（Co-Immunoprecipitation）共同来验证OsDMI3和OsUDG的互作。实验表明OsDMI3和OsUGD不管在体内还是体外均存在相互作用。用荧光定量PCR检测水稻叶片中10OsUGD的表达，发现OsUGD表达量在外源ABA处理60min时出现峰值，确定OsUGD受ABA诱导上调。上述结果为进一步鉴定ABA信号途径中OsDMI3下游靶蛋白并阐明相关信号通路奠定了基础。关键词：OsDMI3；ABA信号；OsUGD中图分类号：Q945.78IdenficationofOsUGDInteractingwithOsDMI3inABA15signalingLIXi,JINGMingyi,NILan(NanJingAgriculturalUniversity,CollegeofLifeScience,NanJing,210095)Abstract:Inthisproject,basedonourpreviousstudiesforthisproject,weidentifyanewinteractingproteinofOsDMI3,OsUGD.ToverifytheinteractionbetweenOsUGDandOsDMI3,weusedBiFC20(BimolecularFluorescenceComplementation)assay,GST-pulldownassayandCo-IP(Co-Immunoprecipitation)assaystotest.TheresultrevealedthatOsUGDandOsDMI3didinteractwitheachotherinvitroandinvivo.ToinvestigatetheeffectsofABAtreatmentsontheexpressionofOsUGDgeneinleavesofriceseedlings,relativequantitativereal-timePCRanalysiswasused.ThemaximumincreaseofOsUGDappearedat60minafterABAtreatment.Theseresultswillestablishthe25foundationforfurtherstudyingtheinteractingproteinofOsDMI3andunderstandingofmechanismofOsDMI3intheABAsignaling.Keywords:OsDMI3;ABAsiganling;OsUGD0引言30ABA(absicsicacid)是一种经典的植物激素，调节植物体内多种生理过程，并在植物响应2+环境胁迫中起着重要的作用。大量研究显示，ABA信号通路中的第二信使包括Ca、一氧2+化氮（NO）、活性氧（ROS）等。它们中的一些通过质膜上的通道使Ca释放或流入细胞2+来改变胞浆中Ca的浓度，这些离子通道被信使ROS激活，如NADPH氧化酶产生的H2O2【1】2+2+。Ca需要与受体蛋白结合将信号传递至下游，而CaM作为植物中重要的Ca受体蛋白基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（20130097110025）作者简介：李溪（1989年-），男，硕士通信联系人：蒋明义（1962年-），男，教授，博导.E-mail:myjiang@njau.eud.cn-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn35其本身并不具有活性，其介导的信号通路及相关生理反应均通过钙调素结合蛋白（CaMBPs）[2]2+来实现。CaMBPs成员之一的Ca/CaM依赖型蛋白激酶（CCaMK）已经被证实是脱落酸（ABA）信号转导中的一个重要组分，调控根的生长、抗氧化防护和植物对水分胁迫、氧化胁迫的耐性。水稻中OsDMI3（CCaMK）已被证实参与ABA诱导抗氧化防护途径，作用[3,4]于OsMPK1上游来调节抗氧防护酶的活性。然而OsDMI3在这一过程中的作用机制仍有40待阐明。阐明ABA信号途径中OsDMI3互作蛋白对于阐明CCaMK在植物应答胁迫反应中的作用机制是十分重要的。先前的研究已经证实，位于细胞核的IPD3/CYCLOPS与CIP73是CCaMK的互作蛋白，[4-8]在菌根感染以及根瘤发育过程中起着十分重要的作用。然而，OsIPD3与OsCIP73并不参与ABA信号转导途径。这些结果意味着一些尚未澄清的CCaMK靶蛋白在ABA信号转导45中起着作用。本研究前期以OsDMI3为诱饵，利用酵母双杂筛选水稻叶片cDNA文库，筛选出一个与OsDMI3互作的蛋白，OsUGD。酵母双杂交系统存在较高的假阳性，因此本研究通过双分子荧光互补（BiFC）、GST-pulldown、免疫共沉淀（CoIP）进一步证明OsUGD与OsDMI3互作的真实性。检测ABA处理的水稻中OsUGD基因的表达，发现ABA能够诱导OsUGD50表达。这些结果表明OsUGD是OsDMI3在ABA信号途径中的互作蛋白。进一步研究OsUGD有助于人们对CCaMK参与ABA信号途径的作用机制的认识，拓展人们对逆境下ABA诱导植物信号转导机理的理解。1材料与方法1.1材料55以徐稻4号为实验材料。将种子用去离子水浸泡24h后，置于暗培养箱中催发萌芽48h，挑选根和芽状态一致的种子栽种于96孔板上，加入水稻营养液，在温度28°，相对湿度75%暗培养箱中培养，待其第三片叶子完全展开，取根部至叶鞘部分提取原生质体。BiFC所需洋葱从超市购买。质粒及载体转化大肠杆菌菌株为DH5α，蛋白表达菌株为BL21（DE3）与Rosetta60（DE3）均购自Takara宝生物生物工程有限公司。pMD19-TVector购自Takara宝生物生物工程有限公司，BiFC相关载体、原核表达载体pET30a-c、原生质体瞬时表达载体pXZP008由本实验室保存。pXZP008-Myc-OsDMI3与pGEX-4T-1-OsDMI3质粒均由本实验室保存实验所涉及引物均由上海生工生物工程有限公司合成，基因测序由上海桑尼生65物科技有限公司和上海生工生物工程有限公司完成。本章涉及引物如下（表1），带下划线为酶切位点，加粗为his标签序列。70-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn表1所用引物Table1PrimersequencesAbbreviationSequence（5’-3’）DescriptionUGD-bifc-1GGTACCATGGCGCAGAAGGAGGCCAATGForwardUGD-bifc-2GGTACCTTAGGCCTGGTTCTTCTTGGGCACTReverseUGD-his-1GGTACCATGGCGCAGAAGGAGGCCAATGForwardUGD-his-2CTCGAGGGCCTGGTTCTTCTTGGGCACTReverseGAPDH-1CTTCATAGGAATGGAAGCTGCGGGTAForwardGAPDH-2CGACCACCTTGATCTTCATGCTGCTAReverseUGD-r1GATGGGCGTGTTGTTAGTForwardUGD-r2TTGCCTTTGTAATGTCTGGReverse751.2方法1.2.1BiFC验证OsDMI3和OsUGD相互作用根据BiFC载体图谱选择合适的酶切位点将OsUGD的CDS片段连接到pSPYCE155和pSPYCE173载体上。构建载体的引物见表1，讲OsUGD的CDS扩增的PCR产物TA克隆到pMD19-T载体上，测序验证后，将得到的阳性质粒酶切酶连到pSPYCE载体上，获得80SYFPN::UGD载体，SYFPC::OsDMI3载体实验室已有，根据氯化锂纯化方法提取纯化的BiFC载体将SYFPN::OsUGD载体和SYFPC::OsDMI3载体质粒稀释到1μg/μl与8μl制备好的金粉颗粒、7.5μl灭菌的2.5MCaCl2、0.1M亚精胺震荡混匀。加入10μl无水乙醇使金粉成悬浮状态。撕取新鲜洋葱第3-4层内表皮切成2cm×2cm大小的方块，整齐贴在MS固体培养基中85间。使用BioRadPDS-100/He基因枪基因轰击。将制备好的质粒金粉悬浮液均匀的涂在轰击膜中间，按照说明将压力膜、轰击膜和载有洋葱表皮的固体装置在基因枪上的发射装置和真空室内。抽真空，放氦气于气体加速管内，直到压力达到1.1Mpa时打枪，将质粒金粉混合物打入到洋葱表皮内。轰击完成后的洋葱表皮封口于25℃过夜培养。次日用激光共聚焦观察融合蛋白的表达，验证蛋白之间的互相作用。黄色荧光蛋白YFP激发波长为490nm，发90射波长为515nm。1.2.2GST-pulldown验证GST-OsDMI3和OsUGD相互作用将实验室先前保存的pGEX-4T-OsDMI3载体和pGEX-4T-1空载通过热击法转入Rossta（DE3）菌株感受态中。挑取单菌落于液体LB培养基中37℃振荡培养12-16h。按1:100体积比将培养好的菌液扩大培养，37℃200rpm振荡培养至OD600达到0.6-0.8之间，加入0.5M95IPTG转移到26℃低速振荡诱导表达6h，得到含有OsDMI3-GST蛋白的表达菌株。根据载体图谱选择合适的酶切位点将OsUGD的CDS片段连接到表达载体pET30a-c上，构建OsUGD-His表达载体。构建载体的引物见表1。用热击法将OsUGD-His质粒转入Rossta（DE3）菌株感受态中。挑取单菌落于液体LB培养基中37℃振荡培养12-16h。按1:100体积比将培养好的菌液扩大培养，37℃200rpm振荡培养至OD600达到0.6-0.8之间，加入0.5MTM100IPTG转移到24℃低速振荡诱导表达16h。使用MagneHisProteinPurificationSystem(Promega)纯化OsUGD-His蛋白。TM参照MagneGSTPull-DownSystem(Promega)描述的方法，验证OsDMI3-GST与OsUGD-His之间的相互作用。-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn1.2.3Co-IP验证OsDMI3与OsUGD的相互作用105设计引物在OsUGD的CDS区前加上His标签蛋白序列。选择适合的酶切位点连接到pXZP008载体上。引物序列见表1，编号为UGD-His.1和UGD-His.2。实验室先前已经将OsDMI3的CDS区前加入Myc标签连接到pXZP008载体上。[9]参照Yang等报道的方法提取水稻原生质体，用PEG介导的方法将构建好的pXZP008-Myc-OsDMI3与pXZP008-His-OsUGD载体共同转入水稻原生质体内，25℃黑暗110条件下培养16h。提取水稻原生质体总蛋白，加入5μlMyc标签单克隆抗体，4℃旋转结合12h。加入30μlproteinAbeads，4℃结合3h。4℃1000g离心3min，弃上清后用His抗体westernblot检测proteinA上的蛋白。1.2.4ABA处理水稻叶片中OsUGD的表达分析选取生长一致的水稻幼苗，放在去离子水中4h以消除伤害胁迫。将水稻幼苗用100μM115ABA处理。根据实验要求在不同的时间点快速剪取水稻展开的第三片叶，迅速用液氮冷冻已备后续实验使用。利用InvitrogenRNA试剂盒提取水稻叶片总RNA，用Takara第一单链cDNA合成试剂盒反转录得到cDNA模板。Real-timeRT-PCR反应采用SYBRGreenⅠ（TaKaRa），在ABI7500荧光定量PCR仪上进行，内参引物为NAPDH-1和NAPDH-2；OsUGD引物为UGD-r1和120UGD-r2。反应操作程序参照SYBRGreenⅠ说明书。95℃，30s预变性；95℃，5s；60℃,34循环40次。PCR反应结束后，65℃~95℃产生溶解曲线。每个样品重复3次。统计分析，实验结果是3次实验的平均值，利用SPSS16.5软件对实验中所有的数据做单因子方差分析（single-factoranalysisofvariance，ANOVA）或Duncan多重检验（Duncan’smultiplerangetest），以p≤0.05为显著差异。1252结果与分析2.1BiFC验证OsDMI3与OsUGD的相互作用将构建好的SYFPN::OsUGD载体和实验室保存的SYFPC::OsDMI3载体经质粒大量提取后利用基因枪法轰击洋葱表皮，OsUGD跟YFP荧光蛋白的N端融合表达，OsDMI3与YFP蛋白的C端融合表达，若两者互作，则YFP荧光蛋白表达，用激光共聚焦显微镜观察可以130看到黄色荧光。结果显示，轰击后的洋葱表皮培养16h后，能检测到黄色荧光，说明OsUGD与OsDMI3在体内存在相互作用（图1）。图1BiFC证明OsUGD与OsDMI3相互作用135Figure1BiFCdetectionofprotein-proteininteraction.-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn2.2GST-pulldown体外验证OsUGD与OsDMI3互作将构建好的OsUGD-His载体转化E.coliRostta（DE3）表达菌株，OsUGD-His在24℃、160rpm、0.5mM的IPTG浓度表达量最大，从4h至16h，随着时间的延长，表达量增大。收集菌液经超声破碎后取上清，使用MagneHisTMProteinPurificationSystem试剂盒纯140化，由SDS-PAGE检测纯化效果（图2）。图2OsUGD-His融合蛋白的SDS-PAGE分析Figure2SDS-PAGEassayofOsUGD-Hisfusionprotein145使用MagneGST™Pull-DownSystem试剂盒（promega）来检测OsDMI3和OsUGD的TM体外互作。将表达好的GST空载与GST-DMI3菌裂解后与MagneGST磁珠结合，加入目TM的蛋白OsUGD-His与反应缓冲液反应。用MagneGSTBinding/WashBuffer洗涤磁珠，去除非特异性结合的杂蛋白，分别用His一抗和GST一抗进行westernblotting检测。WB结果（图3）显示GST-DMI3的泳道经His一抗杂交出40KD大小左右的目的条带，而GST150空载的泳道则没有。GST一抗检测发现GST空载与GST-DMI3均表达且结合至磁珠上，说明结合GST-DMI3的磁珠正确捕捉到了OsUGD-His，而GST空载磁珠则不能与OsUGD-His结合。图3:体外蛋白互作pull-down体系检测OsDMI3和OsUGD的互作155Figure3Invitroproteinpull-downassayfortestingtheinteractionbetweenOsDMI3andOsUGD-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn2.3Co-IP体内验证OsUGD与OsDMI3互作通过PEG介导，将构pXZP008-Myc-OsDMI3与pXZP008-His-OsUGD载体共同转化到水稻原生质体内，培养16h以后提取蛋白。加入Myc抗体和免疫共沉淀反应缓冲液4℃反应过夜，加入proteinAbeads反应3h后，用新的免疫共沉淀反应缓冲液洗proteinAbeads，160然后用His抗体做Westernblot检测。实验结果如图4所示，在共同转化两个载体的原生质体蛋白结的proteinAbeads上检测到OsUGD-His目的条带。在加入Myc抗体结结合的过程中，只有携带Myc抗体的融合蛋白以及与该蛋白互作的目的蛋白才能与Myc抗体免疫，并结合到随后加入的proteinAbeads上。共同转化两个载体的原生质体内OsDMI3-Myc被Myc标签抗体所免疫结合，OsUGD-His和OsDMI3-Myc互作而被一起结合到Myc抗体上，从而165被proteinAbeads携带。westernblot检测到proteinA上携带了OsUGD-His融合蛋白。证明了OsUGD-His和OsDMI3-Myc相互作用(图4左图中三条带，第一条带为重链，第二条带为OsUGD，第三条带为轻链)。图4体内CoIP分析OsDMI3与OsUGD的相互作用170Figure4Co-IPassayfordetectingtheinteractionbetweenOsDMI3andOsUGDinvivo2.4外源ABA处理诱导水稻中OsUGD基因表达上调取第三片叶子刚展开的水稻幼苗置于纯水中，放于培养箱内预处理4h用于去伤害，然后分两批，对照组继续置于纯水中，实验组用100μM的ABA处理，分别在0、15、30、45、60、75、90、105、120min时取样冻于液氮，提取RNA，经反转录后进行荧光定量PCR实175验，分析OsUGD基因表达情况。如图5所示，用100uM的外源ABA处理45min后OsUGD的表达量开始快速上升，在60min时表达量最高，之后开始下降，2h时基本回到对照组水平。说明水稻中OsUGD的基因表达量受ABA诱导上调.-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图11ABA诱导OsUGD基因表达的时间进程180Figure11ExpressionanalysisofOsUGDinleavesofriceplantsexposedtoABAtreatments3讨论实验室前期利用酵母双杂交技术，以OsDMI3为诱饵筛选水稻叶片cDNA文库，得到了与之相互作用的靶蛋白OsUGD。由于酵母双杂交的假阳性较高，本文运用BiFC、GST-pulldown、Co-IP技术来验证这两个蛋白之间的相互作用。185利用BiFC检测OsUGD和OsDMI3两个蛋白之间的相互作用。分别将SYFPN::OsUGD载体和SYFPC::OsDMI3载体通过基因枪打入洋葱表皮细胞。培养16h后，利用激光共聚焦观察，能够观察到OsUGD和OsDMI3之间的相互作用而引起的YFP的表达，黄色荧光遍布在细胞质和细胞膜上。说明了OsUGD和OsDMI3存在相互作用。TM将GST-OsDMI3结合到MagneGST珠子上，加入纯化得到的OsUGD蛋白，结合反190应后清洗MagneGSTTM珠子，用His的抗体WB检测。实验证明OsUGD结合到含有OsDMI3的GST珠子上，说明OsUGD和OsDMI3在体外存在互作。在水稻原生质体内，分别表达了OsDMI3-Myc融合蛋白和OsUGD-His融合蛋白，利用抗体-抗原结合的原理，将OsDMI3-Myc蛋白通过Myc标签抗体免疫结合到ProteinA上，用His抗体WB验证，检测到OsUGD-His融合蛋白的确存在在ProteinA上。说明在水稻细195胞内，OsUGD和OsDMI3相互作用。这些实验均说明无论在体内还是体外，OsUGD和OsDMI3的确均存在相互作用。利用ABA处理水稻叶片后检测OsUGD的基因表达发现OsUGD在60min时候表达量出现峰值，证明OsUGD受ABA诱导上调。OsUGD（己四醇醛酸脱羧酶，GenBankAccessionNo.AB079064）与拟南芥中UXS同源，参与细胞壁的形成，催化己四醇醛酸形成木糖，该+[10,11]200反应被NADP抑制，受NADPH激活，主要作用于种子萌发期。OsUGD与OsDMI3互[12]作，而植物内源ABA的分解代谢依赖UGT（葡萄糖基转移酶）参与的糖代谢途径，说明OsDMI3可能参与糖信号途径，ABA与糖信号途径可能有交叉，OsUGD是否被OsDMI3磷酸化，磷酸化后的OsUGD又在下游ABA信号途径中起到什么作用，这些都待进一步研究。-7- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn4结论205以OsDMI3为诱饵筛选水稻文库得到一个互作蛋白OsUGD。用BiFC、GSTpull-down、Co-IP方法从体外体内共同证实两者之间的确存在相互作用。通过检测各种处理后水稻叶片中的OsUGD的基因表达情况，证实了在短时间内OsUGD是受ABA诱导调控。然而OsUGD在与OsDMI3相互作用的过程是否被OsDMI3磷酸化，作用于OsDMI3上游还是下游，其与OsDMI3互作在ABA信号途径的作用还有待进一步验证。210[参考文献](References)[1]MurateY,PeiZM,MoriIC,SchroederJ.AbscisicacidactivationofplasmamemebaraneCa2+channelsinguardcellsrequiredcytosolicNADPHandisdifferentiallydistruptedupstreamanddownstreamofreactiveoxygenspeciedproductioninabi-1andabi2-1proteinphosphatase2Cmutants[J].PlantCell,2001,13(11):2512-2523215[2]GiffordJL,WashMP,VogelHJ.Structuresandmetal-ion-bindingpropertiesoftheCa2+bindinghelix-loop-helixEF-handsmotifs[J].BiochemicalJournal,2007,405:199-221[3]KawasakiH,NakayamaS,KretsingerP.ClassificationandevolutionofEF-handprotein[J].Biometals,1998,II(4)；277-295JIXG,DENGShiB,NiL,ZhangA...JiangM.OsDMI3isanovelcomponentofabscisicacidsignalingintheinductionofantioxidantdefenseinleavesofrice[J].Mol220Plant,2012,5(6）：1359-1374[4]ShiB,NiL,LiuY,ZhangA,TanM,JiangM.OsDMI3-mediatedactivationofOsMPK1regulatestheactivitiesofantioxidantenzymesinabscisicacidsignalinginrice[J].PlantCellEnviron,2014,37(2);341-352[5]MessineseE,MunJ,YeunL...AneJ.AnovelnuclearproteininteractswiththesymbioticDMI3calciumandcalmodulin-dependentproteinkinaseofMedicagotruncatula[J].MolPlantMicrobeInteract,2007,20(8);912-921225[6]ChenC,GaoM.FungalsymbiosisinricerequiresanorthologofalegumecommonsymbiosisgeneencodingaCa2+/calmodulin-dependentproteinkinase[J].PlantPhysiology,2007,145:1619-1628[7]YanoK,YoshidaS,MullerJ...PaniskeM.CYCLOPS,amediatorofsymbioticintracellularaccommodation[J].ProcNatlAcadSciUSA,2008,105(51):20540-20545[8]KangH,ZhuH,ChuX...ZhangZM.AnovelinteractionbetweenCCaMKandAproteincontainingthe230Scythe-NUbiquitin-likeDomaininLotuejaponicas[J].PlantPhysiology,2011,155:1312-1324[9]SinghS,ParniskeM.Activationofcalcium-andcalmodulin-dependentproteinkinase(CCaMK),thecentralregulatorofplantrootendosymbiosis[J].CurrOpinPlantBiol,2012,15:444-453[10]GhoshI,HamiltonAD,ReganL.Antiparallelleucinezipper-directedproteinreassembly:Applicationtothegreenfluorescentprotein[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety,2000,23(122):5658-5659235[11]SuzukiK,SuzukiY,KitamuraS.CloningandexpressionofaUDP-glucuronicaciddecarboxylasegeneinrice[J].JExpBot,2003,54；1997-1999.[12]SuzukiK,WalanadeK,MasumuraT,KitamuraS.Characterizationofsolubleandputativemembrane-boundUDP-glucyronicaciddecarboxylase(OsUXS)isoformsinrice[J].ArchBiochemBiophys,2004,431(2):169-177[13]DongT,HwangJ.ContributionofABAUDP-glucesyltransferaseincoordinationofABAbiosynthesisand240catabolismofABAhomeostasis[J].PlantSignalBehax,2014,9(7):288-8-'