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'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn家蚕BmPDCD2基因功能研究#梁航华，马涵秀，胡晓松，崔红娟**（家蚕基因组生物学国家重点实验室，西南大学）5摘要：细胞程序性死亡PCD(programmedcelldeath)是一种正常的生命现象，与之相关的蛋白参与细胞增殖、分化、凋亡等多个过程。本研究通过定量PCR的方法检测了家蚕PDCD2基因BmPDCD2在各组织中的表达情况。利用双链RNA（double-strandRNA,dsRNA）干扰和过表达的手段在家蚕BmN4细胞中分别上调和下调BmPDCD2，通过BrdU和TUNEL的10方法探究了其在家蚕BmN4细胞中的功能。结果表明BmPDCD2基因在各组织中均有表达，且参与了细胞增殖与凋亡的调控，为进一步研究该基因在家蚕变态发育中的作用奠定了基础。关键词：细胞生物学;家蚕;增殖;凋亡中图分类号：Q29115FunctionExplorationofBmPDCD2inBombyxmoriLiangHanghua,MaHanxiu,HuXiaosong,CuiHongjuan(StateKeyLaboratoryofSilkwormGenomeBiology(SouthwestUniversity))Abstract:Programmedcelldeath(PCD)isanormallifephenomenon,andtheassociatedproteinis20involvedincellproliferation,differentiation,apoptosisandotherprocesses.Inthisstudy,theexpressionofPDCD2geneinsilkwormwasdetectedbyquantitativePCR.BmPDCD2wasup-regulatedanddown-regulatedinBmN4cellsbydouble-strandedRNAinterferenceandoverexpression.BrdUandTUNELassayswereusedtoexploreitsfunctioninsilkwormBmN4cells.TheresultsshowedthattheBmPDCD2wasexpressedinalltissues,anditwasinvolvedinthe25regulationofcellproliferationandapoptosis,whichlaidafoundationforthefurtherstudyoftheroleofthisgeneinthemetamorphosisofsilkworm.Keywords:cellbiology;Silkworm,Bombyxmori;cellproliferation;apoptosis300引言细胞程序性死亡(programmedcelldeath,PCD)是生物体发育过程中普遍存在的，是一个由基因决定的细胞主动的有序的死亡方式，而最早发现的细胞程序性死亡蛋白则被命名为PDCD[1]。PCD作为细胞的一种基本生物学现象，它在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中发挥重要的作用[2]。作为模式昆虫，家蚕（Bombyxmori）拥有果蝇不可比35拟的优势，可以将其作为占70%农林害虫的鳞翅目模型进行研究，为害虫防治提供新的策略[3]。同时，作为完全变态昆虫，家蚕一生要经历多次旧组织解体和新器官形成等形态结构变化，是研究细胞增殖、分化、凋亡以及自噬的理想材料。本研究旨在对家蚕BmPDCD2基因的功能进行初探，为进一步研究其在家蚕变态发育中的作用提供一定的参考。1材料与方法401.1材料实验所用家蚕品种为大造，由西南大学家蚕基因库提供。蚕卵在25℃相对湿度基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（20130182110003）作者简介：梁航华（1992-），男，博士研究生在读，研究方向：生物化学与分子生物学通信联系人：崔红娟（1968-），女，教授、博士生导师，主要研究方向;细胞生物学.E-mail:hongjuan.cui@gmail.com-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn60%–80%下催青，孵化后幼虫在25℃下桑叶饲育。家蚕BmN4-SID1（以下简称BmN4）细胞由本实验室保存[4]，培养所用IPL-41昆虫细胞培养基购自Sigma公司，血清为Gibco公司产品。Trizol试剂和Tunel试剂盒购自Invitrogen公司。反转录试剂、T7体外转录试剂45盒以及SYBERGREEN预混液购自Promega公司。引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。多聚甲醛为上海生工生物工程公司产品。BrdU抗体为美国Abcam公司产品，DAPI和抗荧光猝灭剂为碧云天生物技术公司产品，细胞转染试剂为罗氏公司XtremeGENEHPDNATransfectionReagent。1.2方法501.2.1总RNA的提取和cDNA的合成取5龄3d幼虫的头、体壁、血液、中肠、精巢、卵巢、马氏管、脂肪体等组织器官，除血液直接加入Trizol外，其他组织经液氮研磨后加入Trizol，按照Invitrogen公司TotalRNA操作指南提取总RNA。利用琼脂糖电泳和紫外分光光度计分别检测RNA产物的完整性、纯度和浓度。使用DNA酶在37℃消化30min后，依照反55转录试剂盒说明书反转录获得cDNA。1.2.2实时荧光定量PCR设计BmPDCD2定量引物（上游序列5’-TCCAAGGTTCTTTCCAAGCAA-3’,下游引物5’-ATTTCGGTAGATCCTGCAGATTAAG-3’），采用SYBERGREEN法进行定量PCR检测，每个反应设三个重复，以GAPDH作为内参基因（上游引物605’-CATTCCGCGTCCCTGTTGCTAAT-3’，下游引物5’-GCTGCCTCCTTGACCTTTTGC-3’）。总反应体系为20µL：SYBERGreenPCRMastermix10µL，双蒸水7µL，上、下游引物各0.4µL，模板2µL，校正液0.2µL。利用2-△△T法分析结果。1.2.3dsRNA干扰设计两对干涉引物（1号上游引物5’-TGGCTTTTACATCCAAGGTT-3’，下游引物655’-ATTCAGCAGTTGTGGCATTA-3’;2号上游引物5’-TGTCAAGTTTATGCTCCGTT-3’，下游引物5’-ACTCCCCAGTCTATGCTGTT-3’），利用Promega公司的RiboMAXLargeScaleRNAProductionSystem-T7体外转录试剂盒合成dsRNA干扰片段，EGFP双链RNA作为对照[5]。24孔板培养细胞每孔加入2µgdsRNA处理五天[6]。1.2.4BrdU掺入实验7024孔板贴壁细胞经10μg/mlBrdU孵育1h后，PBS洗3次每次5min，随后使用4%多聚甲醛室温固定20min。盐酸处理后经10%山羊血清封闭1h，加入BrdU一抗4度孵育过夜。随后二抗孵育1h，DAPI孵育20min，利用荧光显微镜拍照。每组细胞至少拍摄十个视野，计算阳性率。1.2.5western-blotting实验75家蚕细胞过表达空载体pSL1180-A4-SV40-EGFP由本实验室构建，参照XtremeGENEHPDNATransfectionReagent转染试剂说明书瞬时转染pSL1180-A4-SV40-EGFP-BmPDCD2-Flag载体，空载作为对照。转染48h后收集细胞，裂解-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn提取蛋白，SDS-PAGE电泳后利用FLAG标签抗体进行western-blotting检测。1.2.6Tunel检测凋亡实验80将BmN4细胞接种到24孔板24小时后，瞬时转染pSL1180-A4-SV40-EGFP-BmPDCD2-Flag载体，空载作为对照。转染72h后参照Click-iT®PlusTUNELAssay试剂盒说明书检测细胞凋亡，利用荧光显微镜拍照。每组细胞至少拍摄十个视野，计算阳性率。852实验结果2.1家蚕BmPDCD2组织表达分析在NCBI和家蚕数据库SilkDB中获得BmPDCD2基因序列，设计定量引物。以家蚕五龄三天各组织cDNA作为模板通过定量PCR手段检测表达情况。结果显示该基因在各组织中均有表达，其中丝腺表达量最高，血液表达量最低（图1）。90图1BmPDCD2在家蚕五龄3d各组织表达谱检测Fig.1ExpressionprofileofBmPDCD2indifferenttissuesatL5D32.2dsRNA对BmPDCD2转录水平的影响合成两段dsRNA，分别命名为dsBmPDCD2-1和dsBmPDCD2-2，以dsEGFP作为对照，95处理BmN4细胞。干扰五天后利用定量PCR检测干扰效率。结果显示，两个干涉片段均能有效降低BmPDCD2的表达(图2)，其中1号下调约60%，2号下调约50%。-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图2dsRNA干扰效率检测Fig.2EfficiencyofdsRNAinterference1002.3下调BmPDCD2对家蚕细胞增值的影响利用dsBmPDCD2-1下调BmPDCD2的表达水平后，通过BrdU实验检测BmN4细胞的增值变化情况（图3.A）。与对照组相比，实验组细胞BrdU阳性率显著升高（图3.B），表明下调BmPDCD2能促进BmN4细胞增值。105图3下调BmPDCD2对BmN4细胞增殖的影响.A.BrdU染色结果;B.阳性率统计Fig3.EffectofBmPDCD2down-regulationonBmN4cellproliferation.A.BrdUstaining;B.Positiverate.2.4上调BmPDCD2对家蚕细胞凋亡的影响110在BmN4细胞中转染BmPDCD2过表达质粒，72小时后收集细胞，利用Flag标签抗体通过western-blotting检测过表达情况，结果显示质粒成功表达（图4.A）。在24孔板中转染细胞并利用Tunel试剂盒检测对细胞凋亡的影响（图4.B）。结果显示，与对照组相比，过表达BmPDCD2后，细胞凋亡率增加（图4.C），表明BmPDCD2能促进细胞发生凋亡。-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn115图4上调BmPDCD2对BmN4细胞凋亡的影响.A.BmPDCD2过表达蛋白水平检测；B.Tunel检测；C阳性率统计Fig4.EffectofBmPDCD2up-regulationonBmN4cellapoptosis.A.DetectionofBmPDCD2up-regulation;B.Tunelassay;C.Positiverate.3讨论与结论120细胞程序性死亡PCD(programmedcelldeath)是一种正常的生命现象，细胞程序性死亡最终导致的现象就是细胞凋亡[2]。细胞凋亡的途径主要有两条，一条是通过胞外信号激活细胞内的凋亡酶caspase、一条是通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活caspase[2]。这些活化的caspase可将细胞内的重要蛋白降解，引起细胞凋亡。细胞程序性死亡蛋白（PDCD）最早被发现并命名就是源于其对细胞凋亡的调控作用。125该家族在人类中迄今已经发现了十多个成员，因多数具有抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的功能而作为肿瘤抑制因子被研究，其中研究较多的有PDCD4/5等。PDCD2作为家族一员，目前对其的功能研究主要集中在细胞周期以及凋亡领域，有研究表明在肿瘤发生发展中PDCD2与TP53、BCL6等蛋白存在关联[7][8][9]。在果蝇中存在PDCD2的直系同源基因Zfrp8(ZincfingerproteinRP-8)。研究发现Zfrp8蛋白与细胞的发育、细胞周期以及某些疾病有一130定的联系，Zfrp8突变会造成果蝇发育迟缓，幼虫和蛹期致死和造血器官、淋巴腺增生[10][11]。PDCD2在家蚕生长发育中的作用还不得而知，研究PDCD2在家蚕变态发育中的作用将具有重要意义。作为完全变态昆虫，家蚕幼虫成熟后开始吐丝结茧，并在茧中完成化蛾。因此丝腺的发育对家蚕变态至关重要[12]。而丝腺在五龄之前一直发育缓慢，五龄之后开始快速发育，在熟蚕时期达到最大[12]。本研究发现BmPDCD2在家蚕各组织中均有表达，并在丝135腺表达量最高，推测其与丝腺发育密切相关，可能对家蚕变态发育产生影响。在BmN4细胞中的实验结果表明，BmPDCD2与家蚕细胞的增殖与凋亡有关。下调BmPDCD2能促进细胞增殖而上调则会促进细胞凋亡。BmPDCD2的具体作用机制，有待进一步深入研究。140-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn[参考文献](References)[1]敏云馨，马忠仁.细胞程序性死亡通路的研究进展[J].生物技术通报,2009（11）：20-23145[2]OuyangL1,ShiZ,ZhaoS,WangFT,ZhouTT,LiuB,BaoJK.Programmedcelldeathpathwaysincancer:areviewofapoptosis,autophagyandprogrammednecrosis[J].CellProlif.2012,45(6):487-98[3]秦俭，何宁佳，向仲怀.家蚕模式化研究进展[J].蚕业科学，2010，36(4):0645-0649[4]HiroakiMon1a,ZhiqingLi,etal.SoakingRNAiinBombyxmoriBmN4-SID1cellsarrestscellcycleprogression[J].JInsectSci,2013;13:155150[5]SunchaiPayungporn,SalinChutinimitkul,etal.Singlestepmultiplexreal-timeRT-PCRforH5N1influenzaAvirusdetection[J].JournalofVirologicalMethods,2006,131:143-147[6]ManXu,XueWang,etal.AnovelLozengegeneinsilkworm,Bombyxmoriregulatesthemelanizationresponseofhemolymph[J].DevelopmentalandComparativeImmunology,2015,53:191-198[7]CelineJ.Granier,WeiWang,etal.ConditionalinactivationofPDCD2inducesp53activationandcellcycle155arrest[J].BiologyOpen,2014,3:821-831[8]BeverlyW.Baron,etal.PDCD2,aproteinwhoseexpressionisrepressedbyBCL6,inducesapoptosisinhumancellsbyactivationofthecaspasecascade[J].BloodCells,Molecules,andDiseases,2010,45:169-175[9]BeverlyW.Baron,etal.RepressionofthePDCD2genebyBCL6andtheimplicationsforthepathogenesisofhumanBandTcelllymphomas[J].ProcNatlAcadSciUSA,2007,104(18):7449-54160[10]SvetlanaMinakhina,MarinaDruzhinina,RuthSteward.Zfrp8,theDrosophilaorthologofPDCD2,functionsinlymphglanddevelopmentandcontrolscellproliferation[J].Development,2014,141(2):259-68[11]SvetlanaMinakhina,NehaChangela,RuthSteward.Zfrp8/PDCD2isrequiredinovarianstemcellsandinteractswiththepiRNApathwaymachinery[J].Development,2014,141:259-268[12]浙江农业大学.养蚕学.2版[M].北京:中国农业出版社,1981165-6-'